王志龍 薛應(yīng)紅 郝月茹 劉寶玲 苑麗霞 薛金愛 李潤植

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，030801，山西太谷；2晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，030600，山西榆次）

亞麻薺[Camelina sativa（L.）Crantz]屬十字花科亞麻薺屬，是一種新型油料作物，不僅出苗快，抗寒、耐旱、耐貧瘠和抗倒伏能力強，還具有低投入、高產(chǎn)出和成熟周期短（90d左右）等優(yōu)點。亞麻薺是被認定為發(fā)展?jié)摿Υ蟮谋＝∈秤糜团c優(yōu)質(zhì)生物柴油的原料[1]。亞麻薺籽油含有多種對人體有益的不飽和脂肪酸，其中亞麻酸含量高達近30%，亞油酸含量達16%[2]，亞麻酸和亞油酸具有降低血液中低密度脂蛋白及膽固醇的作用，對維持人體心臟及心血管健康有重要作用[3]。因此，深入研究亞麻薺種子油脂生物合成及其調(diào)控機制對提高亞麻薺籽油份含量具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

植物油脂的合成過程主要包括質(zhì)體內(nèi)脂肪酸的從頭合成、脂肪酸在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的加工和三酰甘油（TAG）的合成積累，由多種基因協(xié)同作用完成[4]。轉(zhuǎn)錄因子是一類可通過結(jié)合基因啟動子上游的順式元件來調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)，在植物生長發(fā)育和物質(zhì)代謝調(diào)控中有重要作用[5]。其中LEC（LEAFY COTYLEDON）是可調(diào)控油脂合成相關(guān)基因表達的轉(zhuǎn)錄因子。LAFL相關(guān)基因LEC可通過與不同轉(zhuǎn)錄因子的互作調(diào)控油脂積累及脂肪酸生物合成[6]。

LEC有LEC1和LEC2兩種類型[7]。其中LEC2是從擬南芥T-DNA插入突變體中發(fā)現(xiàn)并分離得到的[8]，其屬于B3轉(zhuǎn)錄因子超家族中的LAV家族的AFL亞家族[9]。B3結(jié)構(gòu)域（植物特有的一種DNA結(jié)合基序）是一種轉(zhuǎn)錄激活因子，能激活胚胎發(fā)育成熟階段貯藏蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄，同時具有調(diào)控胚對脫落酸的敏感性、胚中葉綠素降解和花青素合成、增強種子抗旱能力和抑制不成熟種子萌發(fā)等重要生理功能，這些過程均與胚和子葉的正常發(fā)育有關(guān)[10]。B3結(jié)構(gòu)域編碼110個氨基酸，能與核心DNA元件（CTAG）結(jié)合[11]。同屬于AFL亞家族的ABI3、FUS3和LEC2的進化關(guān)系分析結(jié)果顯示，LEC2基因僅存在于雙子葉植物中，而在藻類、苔蘚、蕨類和單子葉植物中均未發(fā)現(xiàn)，進一步推測最早在綠藻中分化出ABI3基因，在陸生植物中首先分化出FUS3基因，而LEC2基因最后在雙子葉植物中分化產(chǎn)生[12]。過表達擬南芥AtLEC2基因可增加葉片脂肪酸的積累，同時提高LEC1、FUS3和ABI3基因的表達量[13]。在擬南芥中超表達蓖麻RcLEC2基因，能激活油體蛋白相關(guān)基因的表達，種子含油量增加約2.7倍[14]。在擬南芥中證實，AtLEC2通過調(diào)控下游AtWRI1基因的表達來間接調(diào)控脂肪酸合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達[15]。過表達LEC2基因可激活一些生長素響應(yīng)基因的表達[16]。擬南芥LEC2蛋白可結(jié)合貯藏蛋白基因At2S3上游啟動子區(qū)的RY-G-Box和RY元件（CATGCATG），進而調(diào)控某些種子特異性基因的表達[17]。擬南芥Lec2缺失突變體種子的蛋白質(zhì)和油含量分別比野生型減少了15%和30%，蔗糖和淀粉含量均有所提高[18]。由此可見，LEC2在調(diào)控下游基因以及提高種子含油量方面發(fā)揮重要作用。

了解亞麻薺CsLEC2家族成員的基本理化性質(zhì)、功能及進化對亞麻薺種子油脂的合成具有重要的意義。本文以十字花科擬南芥AtLEC2蛋白為參考序列，在亞麻薺數(shù)據(jù)庫中進行BLAST搜索，得到3個編碼CsLEC2轉(zhuǎn)錄因子的基因，利用生物信息學(xué)方法對這些蛋白進行了理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域、信號肽和亞細胞定位預(yù)測、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測、保守結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進化和啟動子順式元件分析。采用半定量與實時熒光定量檢測CsLEC2基因的時空表達特性，以及通過共表達分析預(yù)測CsLEC2可能調(diào)控的下游基因，為解析CsLEC2介導(dǎo)亞麻薺油脂合成調(diào)控機制及后續(xù)基因修飾、提高亞麻薺等油料作物種子含油量提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試亞麻薺材料種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站試驗田。定量表達用的根、莖、葉均采集于亞麻薺8～10片真葉幼苗；花和不同時期種子分別采集于盛花期和開花后10、20、30和40d。試驗材料采集后，經(jīng)液氮速凍并于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 數(shù)據(jù)來源與序列鑒定

以擬南芥AtLEC2蛋白序列（NCBI登錄號為NP_564304.1）為參考序列，在亞麻薺基因組數(shù)據(jù)庫中進行BLASTP搜索，發(fā)現(xiàn)CsLEC2有3條同源蛋白序列（Csa03g031590.1、Csa14g035910.1和Csa17g039140.1），下載3條CsLEC2蛋白序列。采用保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html）、SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和 Pfam（http：//pfam.xfam.org/）鑒定上述編碼蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。根據(jù)染色體分布，將3條蛋白序列分別命名為CsLEC2.1（Csa03g031590.1）、CsLEC2.2（Csa14g035910.1）和CsLEC2.3（Csa17g039140.1）。在NCBI數(shù)據(jù)庫中用CsLEC2蛋白序列Protein BLAST，下載其他物種的LEC2蛋白序列（表1）。

表1 各物種的LEC2蛋白序列基本信息Table 1 Basic information of LEC2 protein sequences from various species

1.3 CsLEC2基因及編碼蛋白的基本結(jié)構(gòu)分析

用 GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析CsLEC2基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。運用Expasy數(shù)據(jù)庫在線工具ProtParam（https：//web.expasy. org/protparam/）分析CsLEC2編碼蛋白的相對分子量和理論等電點等理化性質(zhì)，以擬南芥AtLEC2作為對照，使用GeneDoc本地軟件對CsLEC2蛋白進行多序列比對分析。應(yīng)用在線網(wǎng)站TMHMM Server 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和 Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）對亞麻薺CsLEC2蛋白進行跨膜結(jié)構(gòu)域、信號肽和亞細胞定位預(yù)測。利用在線網(wǎng)站SOPMA（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html）和 SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）對亞麻薺CsLEC2蛋白進行二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.4 CsLEC2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進化分析

利用在線網(wǎng)站MEME Suite（http：//meme-suite.org/tools/meme）對CsLEC2蛋白家族進行保守域預(yù)測，參數(shù)設(shè)置為默認參數(shù)；利用MEGA7.0軟件對CsLEC2蛋白和其他物種LEC2蛋白進行多序列比對后，采用鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 CsLEC2啟動子序列順式元件分析

選取CsLEC2基因上游2 000bp的啟動子序列，利用PlantCARE在線軟件（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對所選2 000bp范圍內(nèi)的啟動子序列進行順式元件預(yù)測。

1.6 CsLEC2基因的實時定量PCR表達分析

用TransZolPlant試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）提取亞麻薺根、莖、葉、花及不同發(fā)育時期種子的RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ABM公司）將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用Premier 6.0軟件設(shè)計CsLEC2基因特異性引物（表2），對CsLEC2基因進行RT-PCR，以亞麻薺CsActin作為內(nèi)參基因。用試劑盒（Takara公司）進行qRT-PCR檢測，20μL反應(yīng)體系：定量上下引物各0.8μL、SYBR?Premix Ex TaqⅡ(2×) 10μL、ROX Reference Dye(50×)0.4μL、RNase-free H2O 7μL、cDNA 模 板 1μL， 每個樣品設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。熒光定量反應(yīng)程序為95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 1min，40 個循環(huán)；65℃5s，95℃ 15s。采用 2-△△Cq方法計算每個基因的相對表達量，用SPSS 25.0軟件分析顯著性差異。

表2 CsLEC2基因的特異性引物Table 2 Specific primers of CsLEC2 genes

1.7 CsLEC2下游基因預(yù)測

為分析亞麻薺CsLEC2轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)控的下游基因，我們在亞麻薺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[19]中找出了亞麻薺中所有的CsWRI1、CsFUS3和CsABI3基因以及部分CsOLE基因在種子不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄表達（FPKM）數(shù)據(jù)（表3），通過繪制折線圖分析CsLEC2轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因的共表達趨勢。

表3 預(yù)測基因在亞麻薺數(shù)據(jù)庫中的編號Table 3 Number of predicted genes in C. sativa database

2 結(jié)果與分析

2.1 CsLEC2家族基因結(jié)構(gòu)與編碼蛋白序列基本特征分析

染色體定位分析顯示，CsLEC2.1、CsLEC2.2和CsLEC2.3基因分別分布于亞麻薺3、14和17號染色體（表4）。CsLEC2基因出現(xiàn)多個拷貝的原因可能是由于片段重復(fù)。用GSDS 2.0分析CsLEC2基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)CsLEC2和AtLEC2基因結(jié)構(gòu)相似，均含有6個外顯子和5個內(nèi)含子（圖1），且均在600～1 500bp之間有1個最長的內(nèi)含子。CsLEC2.1和CsLEC2.2基因的5?非編碼區(qū)比3?非編碼區(qū)長，AtLEC2和CsLEC2.3基因的5?非編碼區(qū)比3?非編碼區(qū)短。在線蛋白結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（CDD）鑒定結(jié)果顯示，這3條蛋白序列均具有LEC2典型的B3結(jié)構(gòu)域（圖2）。

表4 亞麻薺CsLEC2家族蛋白理化性質(zhì)Table 4 Physicochemical properties of CsLEC2 family proteins from C. sativa

圖1 亞麻薺CsLEC2家族的基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Gene structures of CsLEC2 family from C. sativa

圖2 亞麻薺CsLEC2家族蛋白功能結(jié)構(gòu)域的分析Fig.2 Analysis of functional domains of CsLEC2 family protein of C. sativa

CsLEC2.1和CsLEC2.2開放閱讀框均為1 092bp，編碼363個氨基酸；CsLEC2.3開放閱讀框為1 044bp，編碼347個氨基酸。CsLEC2家族蛋白的相對分子量為39.34～41.71kDa，理論等電點為5.21～5.54（表4）。另外，3個CsLEC2蛋白的酸性氨基酸均多于堿性氨基酸，說明這3個CsLEC2蛋白在生理環(huán)境中均帶負電。3個CsLEC2蛋白與擬南芥AtLEC2蛋白氨基酸含量最多的均為絲氨酸（Ser）、天冬酰胺（Asn）和亮氨酸（Leu），氨基酸的親水性指數(shù)也一致。

用Softberry軟件對CsLEC2蛋白進行亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示3個CsLEC2蛋白和擬南芥AtLEC2蛋白主要定位在細胞核內(nèi)。使用SignalP 4.1 Server和Tmhmm Server 2.0在線分析，顯示亞麻薺CsLEC2和擬南芥AtLEC2蛋白均不含有跨膜區(qū)和對應(yīng)的信號肽。

2.2 CsLEC2蛋白高級結(jié)構(gòu)分析

圖3 亞麻薺CsLEC2蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.3 Comparison of secondary structure of CsLEC2 protein from C. sativa

用在線工具SOPMA預(yù)測CsLEC2蛋白二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)亞麻薺3個CsLEC2蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲、α螺旋、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角組成（圖3）。亞麻薺CsLEC2.1蛋白二級結(jié)構(gòu)由20.66%的α螺旋、13.77%的β轉(zhuǎn)角、40.77%的無規(guī)則卷曲和24.79%延伸鏈組成；CsLEC2.2蛋白二級結(jié)構(gòu)由20.94%的α螺旋、13.22%的β轉(zhuǎn)角、43.80%的無規(guī)則卷曲和22.04%延伸鏈組成；CsLEC2.3蛋白二級結(jié)構(gòu)由23.92%的α螺旋、14.12%的β轉(zhuǎn)角、38.62%的無規(guī)則卷曲和23.34%延伸鏈組成。擬南芥AtLEC2蛋白二級結(jié)構(gòu)由24.79%的α螺旋、11.57%的β轉(zhuǎn)角、42.15%的無規(guī)則卷曲和21.49%延伸鏈組成。盡管亞麻薺CsLEC2和擬南芥AtLEC2蛋白二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占比例最大，β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)占比例最小，亞麻薺和擬南芥的LEC2蛋白在二級結(jié)構(gòu)上的主體結(jié)構(gòu)相似，但是在各個組成結(jié)構(gòu)所占比例上存在一定差異。

利用在線工具Swiss-Model分別對3種亞麻薺CsLEC2蛋白進行同源建模，以擬南芥LEC2-DNA復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)作為比對模板（PDB數(shù)據(jù)庫編號為6j9c.2）[20]，結(jié)果如圖4所示，3種亞麻薺CsLEC2蛋白與模板的序列相似度均為0.56，覆蓋度均為0.31，3條蛋白序列均以單體形式發(fā)揮作用。模板6j9c.2.A蛋白與亞麻薺3條CsLEC2蛋白均只由1條多肽鏈組成，該多肽鏈為含有B3結(jié)構(gòu)域的LEC2，該多肽鏈無配體存在。

圖4 亞麻薺CsLEC2家族蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of the tertiary structure of CSLEC2 family protein in C. sativa

2.3 CsLEC2氨基酸多序列比對

如圖5所示，4個蛋白的氨基酸組成同源性很高，CsLEC2和AtLEC2均存在一個較保守的B3結(jié)構(gòu)域，圖中藍線標記為B3結(jié)構(gòu)域的位置。除了B3結(jié)構(gòu)域外，CsLEC2氨基酸序列還存在和AtLEC2相同的B2結(jié)構(gòu)域的保守殘基TKxxARxxRxxAxxR，該保守殘基被證明是LEC1與LEC2之間作用的必需氨基酸殘基[21]。

圖5 亞麻薺CsLEC2家族蛋白多序列比對Fig.5 Multiple sequence alignment of CsLEC2 family proteins of C. sativa

2.4 CsLEC2家族蛋白保守基序和系統(tǒng)進化分析

系統(tǒng)進化分析結(jié)果（圖6）顯示，各物種LEC2蛋白大致聚為3個亞族，亞麻薺CsLEC2蛋白與同屬于十字花科的擬南芥AtLEC2蛋白、擬南芥琴亞種AlLEC2蛋白和山崳菜EsLEC2蛋白均位于第III亞族中，且AtLEC2與AlLEC2蛋白的親緣關(guān)系更近，可能在進化上有相同的進化來源。亞麻薺CsLEC2與其他兩個亞族的麻風(fēng)樹JcLEC2、蓖麻RcLEC2、可可TcLEC2和克萊門柚CcLEC2的雜緣關(guān)系相距較遠。

圖6 不同物種LEC2蛋白的系統(tǒng)進化樹和保守基序Fig.6 Phylogenetic tree and conserved motifs of LEC2 proteins from different species

在MEME網(wǎng)站預(yù)測到CsLEC2的保守結(jié)構(gòu)域（表5）。亞麻薺CsLEC2蛋白、擬南芥AtLEC2蛋白和擬南芥琴亞種AlLEC2蛋白均含有除了motif 6的其他9個保守motif。山萮菜EsLEC2缺少motif 8和motif 10。第I亞族和第II亞族均不含第Ⅲ亞族蛋白的motif 5、motif 7、motif 8和motif 10。這4個motif可能是十字花科物種LEC2在進化上區(qū)別于其他物種的關(guān)鍵氨基酸殘基位點。綜上，MEME保守基序預(yù)測結(jié)果與進化樹聚類結(jié)果完全一致，證明同屬于十字花科的LEC2蛋白在進化上相對保守。

表5 保守基序信息Table 5 Conservative motif information

2.5 CsLEC2啟動子的功能元件分析

選取CsLEC2基因上游2 000bp序列進行啟動子分析，運用PlantCARE在線軟件分析亞麻薺CsLEC2基因上游順式元件（表6）。3個CsLEC2基因均有CAAT-box和TATA-box啟動子基本元件，涉及光響應(yīng)的順式作用元件、厭氧誘導(dǎo)必需的調(diào)節(jié)元素、根特異性表達元件、雌激素應(yīng)答元件和MYB結(jié)合元件等順式元件，與激素響應(yīng)相關(guān)的茉莉酸和生長素等順式調(diào)節(jié)元件。

表6 CsLEC2基因上游啟動子順式元件Table 6 Cis-acting elements in the upstream promoter of CsLEC2

2.6 CsLEC2基因的表達分析

為進一步分析CsLEC2基因的時空表達特征，采用RT-PCR和qRT-PCR檢測各基因在亞麻薺根、莖、葉、花及開花后不同發(fā)育時期的種子（10、20、30和40d）的表達量。結(jié)果如圖7所示，內(nèi)參基因（CsActin）在各組織中穩(wěn)定高量表達，而CsLEC2.1、CsLEC2.2和CsLEC2.3基因均僅在開花后10和20d的發(fā)育種子中高量表達，表明這3個基因僅在亞麻薺發(fā)育中的種子中特異性表達。qRT-PCR結(jié)果（圖8）表明，3個CsLEC2基因均在種子發(fā)育早期和早中期種子中高量表達，CsLEC2.2基因在開花后表達量逐漸升高，在開花后20d表達量最高，在開花后30和40d時表達量顯著降低。CsLEC2.1和CsLEC2.3基因均在開花后10d表達量最高，表達量隨著種子的逐漸成熟而顯著降低，在種子發(fā)育的晚期（開花后40d左右）CsLEC2基因的表達量達到最低，其中CsLEC2.3基因的降低趨勢較緩，在開花后20d的表達量明顯高于CsLEC2.1基因。這3個基因總體表達趨勢同半定量結(jié)果一致，推測這3個基因主要在種子發(fā)育早中期調(diào)控胚胎發(fā)育以及中后期種子油脂合成和積累等重要生理過程。

圖7 亞麻薺CsLEC2在不同組織和種子不同發(fā)育時期的RT-PCR結(jié)果Fig.7 RT-PCR results of CsLEC2 expressions in various tissues and different developmental stages seeds of C. sativa

圖8 CsLEC2基因在種子不同發(fā)育時期的表達分析Fig.8 Expression analysis of CsLEC2 at different seed developmental stages of C. sativa

2.7 CsLEC2調(diào)控的下游基因預(yù)測

參與油脂生物合成基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，亞麻薺CsWRI1基因在各組織中均有轉(zhuǎn)錄表達，在種子中轉(zhuǎn)錄表達量最高，而CsFUS3、CsABI3和部分CsOLE基因均只在種子中轉(zhuǎn)錄表達。因此，CsFUS3、CsABI3和CsOLE基因與CsLEC2基因均是在種子中特異性表達的基因。根據(jù)亞麻薺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中CsWRI1、CsFUS3、CsABI3和CsOLE基因在種子不同發(fā)育時期的FPKM值，預(yù)測這些基因的表達模式（圖9）。從圖9(a)中可知，CsWRI1和CsFUS3-2基因在開花后10d轉(zhuǎn)錄表達值逐漸升高，在開花后20d轉(zhuǎn)錄表達值達到最高，在開花后30d到40d時轉(zhuǎn)錄表達值逐漸下降并趨于0，與亞麻薺CsLEC2.2的表達模式基本吻合。而2個CsFUS3基因與3個CsABI3基因在種子中的轉(zhuǎn)錄表達模式與3個CsLEC2基因的表達模式都不一致。圖9(b)中3個CsOLE3基因的轉(zhuǎn)錄表達值變化趨勢也與亞麻薺CsLEC2.2一致，而所有CsOLE1和CsOLE2基因的轉(zhuǎn)錄表達值趨勢與3個CsLEC2基因的表達趨勢均不一致。根據(jù)這幾個基因與CsLEC2的共表達趨勢，推測在亞麻薺種子發(fā)育時期CsLEC2.2轉(zhuǎn)錄因子可能直接調(diào)控下游CsWRI1和CsOLE3基因的表達。綜上，CsLEC2基因在種子發(fā)育的早期可能也參與了對CsFUS3、CsABI3和亞麻薺中所有的CsOLE1和CsOLE2基因的調(diào)控，而種子發(fā)育后期表達趨勢不完全一致的原因可能是在種子發(fā)育晚期增加了其他轉(zhuǎn)錄因子對這些基因的調(diào)控。

圖9 基因在亞麻薺種子不同發(fā)育時期的FPKM變化趨勢Fig.9 FPKM variation trend of genes at different seed developmental stages of C. sativa

3 討論

3.1 CsLEC2的序列特征分析

目前對LEC2基因的功能研究多集中在擬南芥、玉米和甘藍型油菜等植物上，而有關(guān)異源六倍體作物亞麻薺LEC2基因的研究較少。本研究在亞麻薺基因組數(shù)據(jù)庫中共鑒定得到3個CsLEC2，與AtLEC2均屬于B3超家族。AtLEC2含有B3結(jié)構(gòu)域，是調(diào)控種子胚胎發(fā)育和儲存營養(yǎng)物質(zhì)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能與RY-motif的DNA序列結(jié)合，而具有RY-motif的基因是種子特異性表達相關(guān)的基因[13]。LEC2基因可以正調(diào)控MYB115和MYB118的表達，而MYBs是胚乳中ω-7單不飽和脂肪酸合成的正向調(diào)節(jié)因子，在擬南芥lec2突變體種子中，油脂含量和蛋白質(zhì)含量都較野生型有所下降[21]?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示，CsLEC2與AtLEC2基因結(jié)構(gòu)相似。CsLEC2和AtLEC2理化性質(zhì)也非常相似，均屬于酸性、親水性蛋白，且都不含有跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽。亞細胞定位分析表明，亞麻薺CsLEC2家族基因均定位在細胞核內(nèi)，表明其在細胞核內(nèi)起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。三級結(jié)構(gòu)表明CsLEC2蛋白與6j9c.2[20]模板蛋白（擬南芥轉(zhuǎn)錄因子LEC2-DNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)）相似度高，因此推測這3個CsLEC2蛋白與AtLEC2一樣也具有調(diào)控種子胚胎發(fā)育和參與脂肪酸生物合成的功能。

Boulard等[22]研究表明，LEC2的B2結(jié)構(gòu)域中存在保守殘基TKxxARxxRxxAxxR，該保守殘基可與LEC1中的D86K氨基酸殘基結(jié)合形成異聚體，參與基因表達調(diào)控。多序列比對結(jié)果顯示，除B3保守結(jié)構(gòu)域外，亞麻薺CsLEC2家族蛋白也都存在B2結(jié)構(gòu)域的保守殘基TKxxARxxRxxAxxR，證明CsLEC2也可能與CsLEC1相互配合參與對下游基因的調(diào)控。

系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明，亞麻薺CsLEC2蛋白與同屬于十字花科的擬南芥AtLEC2蛋白、擬南芥琴亞種AlLEC2蛋白及山崳菜EsLEC2的親緣關(guān)系較近，推測CsLEC2蛋白與AtLEC2蛋白可能參與調(diào)節(jié)油脂的積累及控制脂肪酸生物合成[6]。MEME預(yù)測的結(jié)果與進化樹聚類的結(jié)果一致，均表明亞麻薺CsLEC2家族蛋白的保守性較高。

亞麻薺CsLEC2基因上游啟動子元件分析表明，除含有啟動子的基本元件外，還有涉及光響應(yīng)的順式作用元件、厭氧誘導(dǎo)必需的調(diào)節(jié)元素、根特異性表達元件、雌激素應(yīng)答元件、MYB結(jié)合元件等順式元件和與激素響應(yīng)相關(guān)的茉莉酸和生長素等順式調(diào)節(jié)元件。許多MYB蛋白和含有MYB結(jié)合元件的基因?qū)M南芥、玉米、棉花、蘋果和胡楊都有干旱反應(yīng)[23]。楊英軍等[24]對proteinase omega基因5?上游調(diào)控序列分析，發(fā)現(xiàn)多種逆境應(yīng)答調(diào)控元件ERE、ABRE和HSE等。果天宇等[25]發(fā)現(xiàn)ZmCOL3pro217啟動子中含有分生組織特異性、光響應(yīng)和脅迫響應(yīng)等順式作用元件，推測其參與玉米開花調(diào)控。過表達LEC2基因可激活一些生長素響應(yīng)基因的表達[16]。亞麻薺CsLEC2啟動子序列的順式作用元件分析表明，CsLEC2可能參與逆境環(huán)境脅迫應(yīng)答，同時也可以通過光響應(yīng)參與亞麻薺開花調(diào)控。

3.2 CsLEC2的表達模式分析

本研究發(fā)現(xiàn)，3個亞麻薺CsLEC2基因都只在種子中表達。實時熒光定量結(jié)果顯示，在亞麻薺不同發(fā)育時期的種子中CsLEC2的表達均有差異，但都是在未成熟的種子中高表達，隨著種子的發(fā)育成熟表達量逐漸降低甚至不表達。大豆GmLEC2也是在未成熟的種子中表達量最高[26]，與亞麻薺CsLEC2表達模式相同。因此推測亞麻薺CsLEC2基因與種子中油脂的積累相關(guān)，并且是在亞麻薺種子發(fā)育的早中期通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達而發(fā)揮作用。

3.3 CsLEC2的下游基因預(yù)測分析

通過對幾個基因不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄表達值變化趨勢分析，本研究發(fā)現(xiàn)亞麻薺CsWRI1和CsOLE3基因在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的轉(zhuǎn)錄表達值變化趨勢與亞麻薺CsLEC2.2相似。Mendoza等[13]過表達擬南芥AtLEC2提高了擬南芥中LEC1、FUS3和ABI3基因的表達量。Kim等[14]在擬南芥中超表達蓖麻RcLEC2基因，激活了油體蛋白合成相關(guān)基因的表達，種子含油量增加了約2.7倍。Baud等[15]在擬南芥中證實了AtLEC2能夠通過調(diào)控下游AtWRI1基因的表達來調(diào)控脂肪酸合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達。這些都表明LEC2轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控下游基因的表達。由本研究結(jié)果推測，在亞麻薺種子發(fā)育時期CsWRI和CsOLE3基因上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子為CsLEC2.2。而CsWRI1基因在亞麻薺根、莖、葉和花組織中也有表達，表明在這些組織中可能存在其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

4 結(jié)論

以具有調(diào)控種子發(fā)育過程和油脂產(chǎn)量功能的擬南芥AtLEC2蛋白序列為參考序列，鑒定得到了3個亞麻薺CsLEC2基因，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)亞麻薺CsLEC2蛋白與擬南芥AtLEC2蛋白有著相似的功能，通過RT-PCR和qRT-PCR表達特性分析發(fā)現(xiàn)亞麻薺CsLEC2在種子中特異表達，并且在種子發(fā)育的早期和早中期高表達。對幾種不同基因在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)錄表達值的變化趨勢分析發(fā)現(xiàn)亞麻薺CsLEC2.2轉(zhuǎn)錄因子可能直接調(diào)控下游CsWRI1和CsOLE3基因的表達。