張政權(quán)，黃冬梅，史永富，婁曉祎，田良良，申兆棟

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部遠(yuǎn)洋與極地漁業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200090)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)又名河蟹、大閘蟹，主要分布在亞洲北部和中國的東部沿海省份[1]，中華絨螯蟹肉質(zhì)鮮嫩，營養(yǎng)豐富，深受國內(nèi)消費(fèi)者的喜愛[2]。隨著中華絨螯蟹需求量的迅速增加，中國的東南沿海省份開始大規(guī)模人工養(yǎng)殖，2017年中國的中華絨螯蟹產(chǎn)量達(dá)到了812 103 t[3]，基本上能夠滿足廣大消費(fèi)者的需求，但優(yōu)質(zhì)蟹的數(shù)量還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。目前針對中華絨螯蟹的研究主要集中在其脂肪酸及其風(fēng)味物質(zhì)組成方面[4-5]，針對其礦物元素的研究較少，中華絨螯蟹的風(fēng)味主要由其體內(nèi)的醇類、酮類、呋喃類、含氮類和芳香類物質(zhì)決定[6]，而礦物元素則直接參與中華絨螯蟹體內(nèi)復(fù)雜的生化反應(yīng)，對中華絨螯蟹的肉質(zhì)風(fēng)味起到重要的調(diào)節(jié)作用[7]。因此，通過對其礦物元素進(jìn)行研究可為優(yōu)化優(yōu)質(zhì)蟹養(yǎng)殖技術(shù)提供支持和借鑒。

本研究以中華絨螯蟹的腹部和腿部肌肉為共同研究對象，探討樣品消解條件和儀器測定干擾排除方法，并利用火焰原子吸收光譜儀測定了蟹肉中K、Ca、Na、Mg、Mn、Zn、Cu和Fe 8種金屬元素含量，建立的方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確，可用于中華絨螯蟹中多元素的測定，相關(guān)數(shù)據(jù)可為中華絨螯蟹的養(yǎng)殖條件優(yōu)化和品質(zhì)鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

原子吸收光譜儀ContrAA-700(德國耶拿分析儀器股份公司)；超純水機(jī)Milli-Q ELEMENT(美國Millipore公司)；真空冷凍干燥機(jī) FreeZone(美國Labconco公司)；精密電子天平JA5000C(常州市幸運(yùn)電子天平有限公司)；微波消解儀 ETHOS (意大利邁爾斯通)；電加熱板 HP-H35SC(盛達(dá)杰森自動化設(shè)備有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包括： K、Ca、Na、Mg、Mn、Zn、Cu及Fe元素單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/mL，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)認(rèn)證中心)。

硝酸、過氧化氫、硝酸鑭及氯化銫(均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

將購買的各元素標(biāo)準(zhǔn)儲備液用1%硝酸溶液進(jìn)行逐級稀釋，根據(jù)需要配制成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。元素濃度范圍：K為0.1～1.0 μg/mL，Ca為1.0～5.0 μg/mL，Na為0.03～0.3 μg/mL，Mg為0.05～0.5 μg/mL，Mn為0.3～3.0 μg/mL，Zn為0.2～1.5 μg/mL，F(xiàn)e為1.0～8.0 μg/mL，Cu為1.0～5.0 μg/mL。

1.2.2 樣品采集

2018年11月份于興化養(yǎng)殖塘采集中華絨螯蟹12只，質(zhì)量范圍為102～147 g，取其腹部及腿部肌肉，用超純水沖洗掉蟹肉中混雜的其他組織，放入-50 ℃冰箱冷凍，隨后放入真空冷凍干燥機(jī)中-50 ℃干燥至恒重，干燥后的樣品研磨均勻后放入干燥器中保存。

1.2.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.5 g樣品于消解罐中，加入5 mL硝酸和1 mL過氧化氫后酸解放置過夜，第2天將酸解后的樣品放入微波消解儀中，按設(shè)定的消解程序進(jìn)行消解。消解結(jié)束后，將消解罐放在加熱板上220 ℃條件下趕酸，待消解罐中的液體呈澄清透明狀后，取出冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至平底試管中稀釋定容至10 mL或25 mL。微波消解儀器條件見表1。

表1 微波消解條件Tab.1 Microwave digestion conditions

1.2.4 儀器測定

待測溶液通過進(jìn)樣管進(jìn)入霧化器，在霧化器中被霧化，然后進(jìn)入原子化器，空氣-乙炔混合氣體燃燒產(chǎn)生的高溫將氣體原子化，產(chǎn)生的氣相自由原子獲取光源產(chǎn)生的電磁輻射能躍遷到更高能態(tài)，并成為激發(fā)態(tài)原子。在此過程中，通過控制分光器，實(shí)現(xiàn)僅被測金屬元素對應(yīng)的吸收波長的光通過，從而達(dá)到檢測待測金屬元素的目的。由于固定數(shù)量的基態(tài)原子躍遷到激發(fā)態(tài)吸收的電磁輻射能是一定的，因此，通過觀察儀器最終測定出的吸收值可以計(jì)算出產(chǎn)生躍遷的基態(tài)原子數(shù)量，進(jìn)而計(jì)算出溶液中待測金屬原子的濃度。各元素測定時儀器條件參數(shù)見表2。

表2 各元素測定時儀器條件參數(shù)Tab.2 Instrument condition parameters for each element measurement

2 結(jié)果與討論

2.1 消解條件的選擇

目前關(guān)于食品消解方法的選擇已經(jīng)有很多研究[8-13]。樣品消解主要分為干法灰化和濕法消解兩種方式，干法灰化法相較于濕法消解雖可避免使用試劑，但由于灰化過程中溫度過高，有可能造成待測元素的損失，且消解所用坩堝可吸附部分待測元素，另外K、Na、Ca及Mg這4種常量元素在實(shí)驗(yàn)室中無處不在，長時間暴露在開放環(huán)境中極有可能造成樣品污染而對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。綜合考慮樣品本身的性質(zhì)和環(huán)境污染因素，本實(shí)驗(yàn)選擇濕法消解結(jié)合微波密閉輔助加熱的方法對樣品進(jìn)行消解。消解采用的酸解體系主要有高氯酸-硝酸體系、單硝酸體系，硝酸是唯一一種可以單獨(dú)使用的消解用氧化性酸[14]，單硝酸體系在消解含脂肪較少的生物樣品時反應(yīng)相對溫和、緩慢、安全。實(shí)驗(yàn)所用樣品為脂肪含量較少的蟹肉干粉，試驗(yàn)比較了3 mL硝酸+1 mL過氧化氫、5 mL硝酸+1 mL過氧化氫、7 mL硝酸+1 mL過氧化氫3種配比下的消解效果，將酸解樣品放置過夜后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)硝酸用量為5 mL時即可達(dá)到將樣品完全酸解的目的。酸解后的樣品幾乎完全溶于酸解體系中，金屬元素均以易溶于水的硝酸鹽形式存在于溶液中。由于消解過程在密閉容器中進(jìn)行，樣品與外界隔絕從而避免了樣品被污染，且微波消解只需要提前設(shè)置好微波消解儀的參數(shù)，整個消解過程基本上實(shí)現(xiàn)自動化[15]。

2.2 儀器干擾的排除

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

本研究測定的8種金屬元素中有些元素在樣品中的含量差別較大，要使原子吸收光譜儀能夠同時測定8種元素，除了對樣品定容體積進(jìn)行調(diào)整外，還需要對各元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍進(jìn)行優(yōu)化，使樣品和標(biāo)曲的吸光度值位于原子吸收光譜儀的線性范圍內(nèi)，通過結(jié)合儀器生產(chǎn)廠家的推薦參數(shù)和多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終確定了各元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍，見表3。

表3 線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab.3 Linear range, regression equation and correlation coefficients

2.4 方法的檢出限

根據(jù)儀器的檢出限、稱樣量及定容體積計(jì)算方法的檢出限，儀器的檢出限由試劑空白吸光度值的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值所得，根據(jù)儀器的檢出限、稱樣量及定容體積計(jì)算得到方法的檢出限，然后再以3倍的檢出限計(jì)算得到方法的定量限。各元素的檢出限和定量限見表4。

2.5 方法的精密度和回收率

為驗(yàn)證方法的可行性，本研究對方法的精密度和回收率進(jìn)行了測試。通過向空白樣品中添加適量已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液檢驗(yàn)方法的回收率。每種元素設(shè)置了3個加標(biāo)水平，每個加標(biāo)平行測定3次，測得的平均加標(biāo)回收率為73.5%～111.5%，滿足實(shí)驗(yàn)室檢測要求。精密度用RSD表示，各元素測定的RSD為1.19%～12.00%，說明該方法的精密度較高，測量結(jié)果穩(wěn)定，單次測定結(jié)果真實(shí)可靠。

表4 方法的檢出限和定量限Tab.4 Limit of detection and limit of quantitation mg·kg-1

表5 樣品加標(biāo)回收率測定結(jié)果Tab.5 Results of the spiked recovery rate n=3

2.6 質(zhì)控樣品測定結(jié)果

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，研究測定了國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10050(GSB-28)大蝦成分中的8種金屬元素含量，測定結(jié)果見表6，8種元素的測定值均在標(biāo)準(zhǔn)真值允許誤差范圍內(nèi)，表明該方法測定結(jié)果準(zhǔn)確。

表6 質(zhì)控樣品測定結(jié)果Tab.6 The results of quality control sample measurements mg·kg-1

2.7 實(shí)際樣品測定結(jié)果

使用本方法對興化地區(qū)采集的12個樣本進(jìn)行測定，平均測定結(jié)果見表7。由表7可知，蟹肉中含量最多的元素是K和Na，兩者在蟹肉干重中含量分別為12 580 和7 845 mg/kg。K和Na是維持生物體細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡的主要元素，在肌肉組織中廣泛存在[18]，K還在氧化還原調(diào)節(jié)、酸堿平衡和新陳代謝過程中扮演著關(guān)鍵的角色[19]，Ca是構(gòu)成生物體骨骼和外殼的主要元素，在肌肉組織中含量相對較少。Mg在肌肉組織中的含量僅次于K、Na和Ca，是生物體內(nèi)第四大金屬元素，在細(xì)胞內(nèi)主要參與K和Ca離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，還對細(xì)胞的增殖和分化有重要的調(diào)控作用[20]。Fe、Mn、Zn及Cu作為生物體內(nèi)的微量元素雖然在蟹肉組織中含量較少，但也是生物體維持正常的生命活動必不可少的元素，其中，F(xiàn)e是人體中合成血紅蛋白的原料[21]，而血紅蛋白是血紅細(xì)胞輸送氧氣的載體；Mn除了參與骨骼形成，還在生物體大分子合成和生殖代謝中扮演重要的角色[22]；Zn對青少年的生長發(fā)育至關(guān)重要，Zn含量嚴(yán)重不足將會導(dǎo)致青少年侏儒癥和智力低下[23]；Cu參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，骨和結(jié)締組織的形成[24]。本研究表明，中華絨螯蟹中富含8種微量元素，具有很好的營養(yǎng)價值。利用本實(shí)驗(yàn)建立方法可同時檢測不同養(yǎng)殖模式、不同品系的蟹中微量元素，可為改進(jìn)養(yǎng)殖技術(shù)、培育優(yōu)質(zhì)蟹提供良好的科學(xué)指導(dǎo)。

表7 實(shí)際樣品測定結(jié)果Tab.7 The results of actual sample measurements

3 結(jié)論

本方法可用于測定中華絨螯蟹肌肉中的K、Ca、Na、Mg、Mn、Zn、Cu和Fe 8種金屬元素含量，方法的準(zhǔn)確度高，回收率好。且該方法的前處理過程簡單，原子吸收光譜采用的連續(xù)光源可在不需要更換燈源的情況下同時測定多種元素，相較于傳統(tǒng)的單元素?zé)羰∪チ藫Q燈步驟，節(jié)省了成本和測定時間；相較于傳統(tǒng)的原子吸收光譜儀，靈敏度更高，檢出限更低；相較于電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，不僅能滿足多元素同時測定，且測量成本較低，是一種非常經(jīng)濟(jì)高效的多元素測定方法。本研究測得的生物樣本數(shù)據(jù)還可用于中華絨螯蟹的養(yǎng)殖條件優(yōu)化及蟹產(chǎn)品的綜合利用開發(fā)。