馮優(yōu)妍,楊愛馥,鄭秋月,萬 超,曹際娟，

(1.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧 大連 116034； 2.大連海關，遼寧 大連 116001)

霉菌污染是糧食儲藏過程中尤為重要的危害原因，尤其產毒霉菌污染更為嚴重地影響糧食質量安全。霉菌污染對糧食主要產生兩大方面的危害[1]:一是會引起糧食發(fā)生變質，降低糧食的口感、營養(yǎng)等食用價值，帶來經濟上的巨大損失。二是霉菌毒素會危害人與動物，威脅人類的身體健康。如一部分黃曲霉和所有的寄生曲霉在其代謝過程中會產生黃曲霉毒素，黃曲霉毒素具有致畸、致癌、致突變的作用，危害也最為嚴重[2-4]。

本研究設計TaqMan?實時熒光PCR反應引物和探針，構建優(yōu)化實時熒光PCR反應體系，建立引發(fā)糧食霉變的黃曲霉和寄生曲霉霉菌實時熒光PCR快速檢測方法；并與行業(yè)標準SN/T 2582—2010中普通PCR法[5]進行了比較，結果表明,實時熒光PCR方法快速、簡便、易于觀察結果，為糧食霉變霉菌的早期快速準確鑒別提供了有效技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

微生物DNA快速提取劑(lysis buffer for microorganism to direct PCR)、Premix Ex Taq(Takara Code:RR390A)、Rox Peference DyeⅡ；引物及探針由寶生物工程(大連)有限公司合成、試驗菌株來源于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)、中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

表1 試驗菌株及其編號

1.2 儀器與設備

Viia7熒光定量PCR儀，ABI公司；小型高速離心機，Eppendnorf公司；迷你離心機，Tomy公司；恒溫水浴鍋，Memmert公司；超微量紫外分光光度計，Eppendnorf公司。

1.3 引物與探針設計

根據黃曲霉和寄生曲霉共有的5.8SrDNA的ITS序列，應用Primer5.0軟件設計通用引物和探針，并將設計好的引物和探針在GenBank上進行blast比對確定引物和探針的理論特異性。引物和探針由寶生物工程(大連)有限公司合成。引物與探針序列見表2。

1.4 霉菌DNA的快速提取

(1)取50 μl微生物裂解緩沖液(lysis buffer for microorganism to direct)PCR 于滅菌的微型管(microtube)中。

(2)用滅菌牙簽或槍頭挑取單菌落，置于微型管(microtube)中攪動幾下后取出。需要注意的是：牙簽置于微型管(microtube)中的時間不要過長，否則會影響裂解液的體積，并會影響PCR擴增效果。

(3)80℃熱變性15 min后，低速離心，取1～5 μl裂解后的上清液作為PCR反應的模板。

1.5 實時熒光PCR檢測方法的建立

優(yōu)化反應體系和反應條件，得出最佳實時PCR通用反應體系和反應條件。

反應體系總體積為25 μl，其中Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μl，正向和反向引物(10 μmol/L)各0.5 μl，探針(5 μmol/L)1 μl， Rox Peference DyeⅡ 0.5 μl，模板DNA(10～100 μg/ml)2 μl，滅菌雙蒸水8 μl。

反應條件：95℃預變性10 s(1個循環(huán))；95℃變性5 s，60℃退火/延伸34 s(40個循環(huán))，熒光閾值為設備默認值。

1.6 特異性試驗

利用1.4節(jié)中的DNA提取方法提取黃曲霉、寄生曲霉、黑曲霉、雜色曲霉、正灰綠正青霉、白曲霉、赭曲霉和棒曲霉的DNA進行實時熒光 PCR擴增，對建立的實時熒光PCR檢測方法進行特異性測試。

1.7 靈敏度試驗

以黃曲霉CGMCC3.4408為參考菌株進行靈敏度試驗，將菌株DNA提取液進行10倍梯度稀釋，使DNA濃度為10、1、10-1、10-2、10-3ng/μl，進行實時熒光PCR擴增，確定所建立的實時熒光PCR檢測方法的靈敏度。

1.8 與SN/T 2582—2010中普通PCR方法比較

以平板計數方式為基準，比較實時熒光PCR方法與SN/T 2582—2010中普通PCR方法檢測的靈敏度差異。

1.9 模擬污染樣品檢測

建立10個霉菌模擬污染糧食模型，分別將試驗倉中的500 g糧食置于無菌環(huán)境中，用噴霧器向糧食表面均勻噴灑適量無菌水，混合均勻后用塑料薄膜密封，一周后分別采用GB 4789.16—2016[6]和實時熒光PCR方法進行霉菌檢測。

2 結果與分析

2.1 特異性試驗結果

特異性試驗結果如圖1所示。由圖1可知，黃曲霉、寄生霉菌均檢測到了特異性擴增曲線，實時PCR擴增結果均為陽性。其它常見霉菌菌株的檢測結果均為陰性。

圖1 糧食中主要霉菌特異性檢測1.黑曲霉；2.雜色曲霉；3.正灰綠正青霉；4.白曲霉；5.黑曲霉；6.黃曲霉；7.黃曲霉；8.寄生曲霉；9.赭曲霉；10.棒曲霉

2.2 靈敏性試驗結果

(1)將黃曲霉CGMCC3.4408菌株的DNA提取液進行10倍梯度稀釋，以DNA濃度10、1、10-1、10-2、10-3ng/μl為模板進行熒光PCR檢測，靈敏度檢測結果如圖2所示，當DNA濃度≥10-2ng/μl時可發(fā)生特異擴增，說明黃曲霉CGMCC3.4408 DNA檢測靈敏度可達到10-2ng/μl。

圖2 黃曲霉實時PCR靈敏度檢測1.10 ng/μl擴增曲線；2.1 ng/μl擴增曲線；3.10-1 ng/μl擴增曲線；4.10-2 ng/μl擴增曲線；5.10-3 ng/μl擴增曲線；6.空白對照。

(2)取50 μl已復蘇的黃曲霉菌培養(yǎng)物，培養(yǎng)過夜后測其OD值，估計其菌數，然后按10-1、10-2、10-3CFU/ml，等倍數梯度稀釋，取幾個梯度的菌液進行平板計數，重復2次，取平均值確定其真實的菌密度。每個梯度菌液提取DNA，進行實時PCR檢測，將檢測結果與平板計數結果比較，結果如表3所示，熒光PCR檢測靈敏度可達到76 CFU/ml。

表3 實時PCR與平板計數結果比較確定檢測靈敏度

2.3 與SN/T 2582—2010中普通PCR方法比較

以靈敏度測試中黃曲霉菌標準菌株的DNA稀釋液為模板，同時采用建立實時熒光PCR法和SN/T 2582—2010中普通PCR方法進行方法檢出限比較。兩種檢測方法比較的結果如表4所示。

表4 實時熒光PCR法與SN/T 2582—2010中普通PCR法檢測結果的比較 ng/μl

由表4可見，建立實時熒光PCR法可檢測10-2ng/μl的霉菌，SN/T 2582—2010中普通PCR方法可檢測10-1ng/μl霉菌。實時熒光PCR法檢測霉菌的靈敏度比SN/T 2582—2010中普通PCR法高出一個數量級。

2.4 在霉變玉米樣品檢測中的應用

按照1.9節(jié)中的方法建立霉菌模擬污染糧食模型，用實時熒光PCR方法和GB 4789.16—2016方法同時檢測污染模型中分離得到的霉菌。采用實時熒光PCR方法檢測出2個樣品中存在黃曲霉和寄生曲霉菌，分離得到的陽性菌株同時采用GB 4789.16—2016方法進行驗證，確認分離菌株為黃曲霉和寄生曲霉菌。驗證結果表明，建立實時熒光PCR方法鑒定霉菌準確度為100%，顯示該方法具有較好的適用性。

3 討論

本研究所建立的實時熒光PCR法可以特異性檢測糧食中黃曲霉和寄生曲霉菌。目前，國內外糧食中主要霉菌檢測仍以傳統(tǒng)的病原菌培養(yǎng)和形態(tài)學、生化鑒定為主。霉菌培養(yǎng)和形態(tài)學鑒定耗時長，工作量大，且霉菌孢子容易造成實驗室污染，霉菌鑒定需要實驗室人員豐富的經驗。本研究建立了糧食中黃曲霉和寄生曲霉實時熒光PCR快速檢測方法,與SN/T 2582—2010中普通PCR法和傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定法相比較，驗證了實時熒光PCR方法的可靠性。與SN/T 2582—2010中普通PCR檢測方法相比，實時熒光PCR檢測的優(yōu)勢主要表現(xiàn)在：(1)高靈敏度：實時熒光PCR法可檢測10-2ng/μl的霉菌，普通PCR方法可檢測10-1ng/μl霉菌；(2)操作簡便，速度快，實現(xiàn)PCR擴增和產物分析一體化；(3)安全、無污染，實時熒光PCR在全封閉狀態(tài)下進行PCR擴增和產物分析，杜絕了SN/T 2582—2010中普通PCR開放檢測對環(huán)境的污染和由此導致的假陽性[7-8]。建立方法為我國糧食霉變監(jiān)測和快速檢測提供新的技術手段，可以快速、靈敏、準確檢測出糧食中是否帶有霉菌，早期識別霉變和病害發(fā)生，有效控制霉變和霉菌毒素產生發(fā)展，可提高糧食制品預防霉變病害和霉菌毒素污染發(fā)生發(fā)展的監(jiān)測水平。