秦柯 郭雪君

上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院呼吸科200092

COPD 是一種嚴重危害人類健康、影響長期生活質(zhì)量的慢性呼吸系統(tǒng)疾病,是以氣流受限為特征的可以預防和治療的疾病,氣流受限呈不完全可逆、進行性發(fā)展。遺傳和環(huán)境共同作用是COPD的主要危險因素。COPD 的發(fā)病機制較為復雜,目前認為主要與香煙煙霧等有害顆?；蛴泻怏w作用于氣道,使氣道發(fā)生異常炎癥反應有關(guān),遺傳因素可能參與其中。同時機體氧化與抗氧化平衡紊亂、蛋白酶和抗蛋白酶機制失衡進一步加重肺組織的炎癥,血管內(nèi)皮損傷繼而引起血管重塑可促使COPD病情惡化。此外,近年來有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在COPD 發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮一定作用[1]。

糖皮質(zhì)激素是治療COPD 的常用藥物,尤其對于急性加重期的患者。但許多COPD 患者對糖皮質(zhì)激素治療的反應較差,治療后肺功能并未得到有效改善,炎癥未得到有效控制,進一步研究發(fā)現(xiàn)這部分患者可能存在糖皮質(zhì)激素抵抗現(xiàn)象[2-3],多種機制可能參與其中:中性粒細胞、巨噬細胞及其他炎癥細胞聚集在氣道和肺組織中引起的慢性氣道炎癥[4]、 組蛋白去乙?；?2 (histone deacetylases,HDAC2)活性下降[5]、激素受體亞型及翻譯修飾異常[6]、核因子κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)通路激活障礙[7]等,其中HDAC2活性降低被認為是導致激素抵抗的主要原因。姜黃素是一種從天南星科和姜科植物根莖中提取的多酚類化合物,其分子結(jié)構(gòu)為含β-二酮的庚二烯和兩個鄰甲基化的酚相連所組成,是WHO 和美國食品藥品管理局以及多國準許使用的食品添加劑,目前為世界上銷量最大的天然食用色素之一,也是常用的中藥之一。已確定姜黃素具有多種藥理活性:包括抗炎、抗氧化應激、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等,這些生物學效應為肺部疾病、心血管疾病、消化系統(tǒng)疾病、糖尿病、惡性腫瘤等多種疾病的治療提供了新思路,使其成為目前研究的熱點之一。

近年來研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過多種機制改善COPD 患者糖皮質(zhì)激素抵抗現(xiàn)象。具體機制包括有:姜黃素可抑制 NF-κB、轉(zhuǎn)錄激活因子(activator protein-1,AP-1)、磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)等分子活性,減弱組蛋白乙酰化酶活性,增加HDAC2 表達[8]。姜黃素還可以通過干預磷酸化-泛素-蛋白酶體途徑,提高HDAC2的活性[9]。上述研究大多基于動物實驗,本研究采用COPD 患者外周血為研究對象,通過分離得到其外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),建立COPD 體外細胞模型,探討COPD 患者的糖皮質(zhì)激素抵抗現(xiàn)象。為COPD 患者的治療提供了新思路,同時為姜黃素早日應用于臨床奠定重要的基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1·1 研究對象 2018年6月至2019年6月于上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院呼吸科住院的COPD 患者30例,年齡 (66.2±8.49)歲,年齡范圍為50～80歲;健康者30名,年齡 (66.37±6.00)歲,年齡范圍為50～80 歲。2 組年齡差異無統(tǒng)計學意義。本研究經(jīng)上海新華醫(yī)院倫理委員會同意(XHEC-D-2020-086),且患者均知情同意并簽署知情同意書。

1·2 納入標準

1·2·1 COPD 組 符合COPD 的診斷標準,具有一種或者多種呼吸系統(tǒng)癥狀,如慢性咳嗽、咳痰、氣喘、呼吸困難等。肺功能檢查提示,使用支氣管舒張劑后,第1 秒用力呼氣容積 (forced expiratory volume in one second,FEV1)/FVC＜70%。

1·2·2 健康組 無吸煙史;無COPD、哮喘等疾病;肺功能檢查提示肺功能正常者;經(jīng)倫理委員會同意,且均簽署知情同意書。

1·3 排除標準 近3個月曾經(jīng)應用激素者;近1個月應用過大環(huán)內(nèi)酯類抗生素;合并支氣管哮喘、肺結(jié)核、支氣管肺癌或其他呼吸系統(tǒng)疾病。

1·4 觀察指標 各組研究對象中IL-8、IL-6以及基質(zhì)金屬蛋白酶9 (matrix metalloproteinases-9,MMP-9)的含量。

1·5 試驗方法

1·5·1 提取PBMC 每例正常組抽取5 ml外周血,COPD 患者抽取雙份5 ml血于EDTA 管中(第2份用于姜黃素部分研究用),與等量的PBS混勻。在離心管中加入淋巴細胞分離液,淋巴細胞分離液與血樣1∶1。室溫離心后分別得到PBMC。1·5·2 培養(yǎng)PBMC 胎牛血清與RPMI培養(yǎng)液1∶10制成培養(yǎng)基,將洗滌后的PBMC 重懸至濃度為1×106個/ml,每份外周血在24孔板中均分為7個孔進行培養(yǎng),每孔1 ml,每孔各加入植物血凝素(其終濃度為50 mg/L),嚴格保證各組細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義,并做好標記。

1·5·3 制備不同濃度的地塞米松 制備濃度為10-10mol/L～10-5mol/L的地塞米松試劑。

1·5·4 激素干預 取上述30 名健康者及30 例COPD 患者(第一份血標本)PBMC,以不同濃度的地塞米松 (10-10mol/L～10-5mol/L)分別干預,在無菌條件下 (50 ml/L CO2,37 ℃,濕度100%)培養(yǎng)48 h。48 h后應均進行半量換液,同時加入腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)共培養(yǎng),TNF-α 終濃度為0.1μg/L,共96 h后培養(yǎng)結(jié)束。以2 000 r/min離心20 min (離心半徑15 cm),離心后獲取上清液及單個核細胞。再次進行細胞計數(shù),保證培養(yǎng)后各組間的細胞計數(shù)(包括組內(nèi)及組間)差異無統(tǒng)計學意義,否則予以剔除。

1·5·5 制備不同濃度的姜黃素 制備濃度為1×10-10mol/L～1×10-5mol/L的姜黃素試劑。

1·5·6 分組藥物干預 取第2份分離得到的30例COPD 患者PBMC,各組細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義。制備姜黃素組:姜黃素 (1×10-10mol/L～1×10-5mol/L);姜黃素(1×10-7mol/L)+地塞米松(1×10-10mol/L～1×10-5mol/L)。在無菌條件下(50 ml/L CO2,37 ℃,濕度100%)培養(yǎng)48 h。48 h后應均進行半量換液,同時加入TNF-α共培養(yǎng),TNF-α終濃度為0.1μg/L,共96 h后培養(yǎng)結(jié)束。離心后獲取上清液及單個核細胞。再次進行細胞計數(shù),保證培養(yǎng)后各組間的細胞計數(shù)(包括組內(nèi)及組間)差異無統(tǒng)計學意義,否則予以剔除。

1·5·7 檢測炎癥因子含量 酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測各組上清液中IL-8、IL-6 以及MMP-9 的含量,按照公式計算各炎癥因子抑制率,各炎癥因子的抑制率(%)= (1-實驗組平均吸光度OD 值/對照組平均吸光度OD 值)100%。

1·6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS統(tǒng)計軟件進行分析,正態(tài)分布的計量資料采用±s 表示,組內(nèi)比較采用配對t檢驗,組間比較采用方差分析,P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2·1 一般情況比較 COPD 組與健康組的性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.733,t=-0.168,P 值均＞0.05)。見表1。

2·2 不同濃度地塞米松對各炎癥因子的抑制作用 COPD 患者組中不同濃度地塞米松對IL-8的抑制率均明顯低于正常組,差異均有統(tǒng)計學意義(P 值均＜0.01)。見表2。COPD 患者組中不同濃度地塞米松對IL-6 的抑制率均明顯低于正常組,差異均有統(tǒng)計學意義 (P 值均＜0.01)。見表3。COPD患者組中不同濃度地塞米松對MMP-9的抑制率均明顯低于正常組,差異均有統(tǒng)計學意義(P 值均＜0.01)。見表4。且在COPD 患者組中,當?shù)厝姿蓾舛冗_到1×10-7mol/l后,各炎癥因子的抑制率逐漸趨于穩(wěn)定,而在正常組中,隨著地塞米松濃度的升高,各炎癥因子抑制率持續(xù)升高。見表2～4,圖1。

表1 一般情況的比較)

表2 不同濃度地塞米松對2組IL-8的抑制率的比較 (%)

2·3 各炎癥因子IC50-Dex 值比較 COPD 組中IL-8的IC50-Dex值(2.72×10-6mol/L)明顯高于正常組 (1.08×10-9mol/L)。COPD 組中IL-6 的IC50-Dex值(4.31×10-7mol/L)明顯高于正常組(8.34×10-10mol/L)。COPD 組中MMP-9的IC50-Dex 值 (4.19×10-6mol/L)明顯高于正常組(2.30×10-9mol/L)。

2·4 姜黃素作用下各炎癥因子的抑制率 在COPD 患者組中,與單用地塞米松組相比較,地塞米松+姜黃素組的IL-8的抑制率明顯提高,差異有統(tǒng)計學意義 (P ＜0.01)。見表5,圖2。與單用地塞米松組相比較,地塞米松+姜黃素組的IL-6的抑制率明顯提高,差異有統(tǒng)計學意義 (P ＜0.01)。見表6,圖2。與單用地塞米松組相比較,地塞米松+姜黃素組的MMP-9 的抑制率明顯提高,差異有統(tǒng)計學意義 (P ＜0.01)。見表7,圖2。

2·5 姜黃素作用下各炎癥因子IC50-Dex值比較

在COPD 組中,與單用地塞米松相比,姜黃素+地塞米松組中各炎癥因子的IC50-Dex值明顯減小。IL-8的IC50-Dex 值在單用地塞米松組為2.72×10-6mol/L,明顯高于姜黃素+地塞米松組(1.20×10-9mol/L);同理,IL-6 的IC50-Dex值在單用地塞米松組為4.31×10-7mol/L,明顯高于姜黃素+地塞米松組 (3.32×10-10mol/L);MMP-9 的IC50-Dex值在單用地塞米松組為4.19×10-6mol/L,明顯高于姜黃素+地塞米松組(3.25×10-9mol/L)。

表3 不同濃度地塞米松對2組IL-6的抑制率的比較 (%)

表4 不同濃度地塞米松對2組MMP-9的抑制率的比較 (%)

圖1 地塞米松作用下各組炎癥因子抑制率 A:IL-8;B:IL-6;C:MMP-9

3 討論

3·1 COPD 患者糖皮質(zhì)激素抵抗現(xiàn)象 近年來,COPD 的發(fā)病率逐漸上升,目前認為該疾病與肺對有害氣體或顆粒的異常炎癥反應有關(guān),吸煙是最常見的危險因素,其他還包括吸入生物燃料、粉塵及其他有害氣體等。其發(fā)病機制與以中性粒細胞、巨噬細胞和CD8+T 淋巴細胞為主的慢性炎癥、蛋白酶與抗蛋白酶失衡、氧化與抗氧化失衡及氣道重塑等相關(guān)[10-11]。臨床主要表現(xiàn)為慢性咳嗽、咳痰、氣促、呼吸困難,晚期可合并心功能不全等癥狀,對患者日常生活造成了長久的負擔[12]。目前COPD主要治療原則是改善癥狀,防止急性發(fā)作,減緩并發(fā)癥,因糖皮質(zhì)激素可有效抑制炎癥反應、緩解肺毛細血管滲漏、減輕氣道黏膜水腫,故在COPD患者中糖皮質(zhì)激素成為控制癥狀及改善預后的主要藥物[11]。研究發(fā)現(xiàn),不同的個體對激素的反應狀況具有差異,部分個體對糖皮質(zhì)激素無反應或者反應性明顯降低,稱為糖皮質(zhì)激素抵抗[13-14]。近年來,許多研究發(fā)現(xiàn)COPD 患者治療中可能存在糖皮質(zhì)激素抵抗現(xiàn)象[15-16]。具體機制可能與HDAC的減少[5,17]、糖皮質(zhì)激素受體亞型轉(zhuǎn)變[6]以及炎癥因子作用[16,18]等相關(guān)。

表5 COPD 患者中分組藥物干預下IL-8的抑制率 (%)

表6 COPD 患者中分組藥物干預下IL-6的抑制率 (%)

表7 COPD 患者中分組藥物干預下MMP-9的抑制率 (%)

圖2 分組藥物干預下各炎癥因子抑制率 (COPD組) A:分組藥物干預下IL-8抑制率;B:分組藥物干預下IL-6抑制率;C:分組藥物干預下MMP-9抑制率

IL-8主要由單核細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞、內(nèi)皮細胞、淋巴細胞等分泌,具有多種生物學功效,是中性粒細胞的主要趨化因子。IL-8的趨化作用可以促使中性粒細胞大量表達黏附分子,引發(fā)呼吸爆發(fā),誘發(fā)較強的炎癥反應[19]。IL-6是由單核巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞以及T 細胞等分泌,而且具有多種生物學效應的細胞因子,在低氧環(huán)境中,可誘導多種炎癥因子,研究發(fā)現(xiàn)[20],COPD 患者外周血清中,IL-6水平明顯升高,而且與FEV1%pred 呈負相關(guān),可做為評估COPD患者預后的指標之一[21]。MMP-9是由活化的中性粒細胞分泌的金屬蛋白酶,有研究表明,在COPD 發(fā)病過程中,MMP-9會對肺泡基質(zhì)構(gòu)成破壞,并能介導炎癥細胞聚集以及損害上皮及內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu),促進氣道重塑。在中重度COPD 患者中,MMP-9 m RNA 表達水平與FEV1、FEV1/FVC 呈負相關(guān)[22]。故本研究通過測定外周血中以上3種炎癥因子的含量,間接反應COPD 患者的炎癥程度。

本研究通過采用體外實驗,分離培養(yǎng)得到PBMC,每個樣本均給予不同濃度地塞米松干預,同時設(shè)置空白對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在COPD 患者組中,地塞米松對單個核細胞釋放的炎癥因子(IL-8、IL-6和MMP-9)的抑制作用較正常組明顯減弱;且在COPD 患者組中,當?shù)厝姿蓾舛冗_到1×10-7mol/L 時,繼續(xù)增加地塞米松的濃度,各炎癥因子抑制率無明顯變化。綜上表明COPD患者存在糖皮質(zhì)激素抵抗現(xiàn)象。

3·2 姜黃素改善COPD 患者的糖皮質(zhì)激素抵抗現(xiàn)象 姜黃素是姜科姜黃屬植物干燥根莖中的一種天然有效成分,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤[23-24]等多種活性,藥理作用廣泛,毒性低,且不良反應小[25]。目前研究表明,姜黃素通過清除自由基[26],抑制環(huán)氧合酶[27]、脂肪氧化酶和誘生型一氧化氮合成酶活性,抑制TNF-α 和NF-κB 表達[28-29],以及調(diào)節(jié)基因的表觀遺傳等發(fā)揮作用。近年,姜黃素的抗炎作用一直是研究的重點[30]。在肺泡上皮細胞中,姜黃素能夠抑制由過氧化氫[31]和TNF-α 引起的IL-8 的釋放,降低AP-1[32]和NF-κB活性,上調(diào)谷胱甘肽水平。

前期體外細胞學研究發(fā)現(xiàn),姜黃素能部分降低COPD 大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞IL-8、MCP-1、巨噬細胞炎性蛋白 (macrophage inflammatory protein 2α,MIP-2α)的H3、H4 位乙酰化水平,升高H3K9位點的甲基化水平。在COPD 大鼠體外實驗的研究中發(fā)現(xiàn),姜黃素可以逆轉(zhuǎn)香煙煙霧提取物誘導的布地奈德抵抗,在RAW264.7細胞和RTE 細胞中,與LPS+CSE+布地奈德相比,LPS+CSE+姜黃素+布地奈德組的IC50-布地奈德顯著降低(P ＜0.05)。實驗結(jié)果顯示姜黃素具有逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素抵抗的作用,對于COPD 等激素抵抗型疾病,姜黃素具有潛在的治療價值。

本研究擬采用COPD 患者PBMC為研究對象,通過分組藥物干預培養(yǎng),檢測上清液中IL-8、IL-6及MMP-9的含量,根據(jù)本實驗結(jié)果可發(fā)現(xiàn),姜黃素對COPD 患者糖皮質(zhì)激素抵抗現(xiàn)象具有明顯改善作用。姜黃素改善糖皮質(zhì)激素抵抗現(xiàn)象可能與其增強HDAC2的活性表達相關(guān)[9,33]。HDAC2屬于組蛋白去乙?；傅囊粋€亞型,在香煙煙霧等有害顆粒的應激作用下活性明顯降低,可促使炎癥因子如IL-8、TNF-α等表達增強,在COPD 患者炎癥反應調(diào)控中發(fā)揮重要的作用[34]。姜黃素提高HDAC2表達的相關(guān)具體機制可能如下:(1)姜黃素可抑制NF-κB、轉(zhuǎn)錄激活因子AP-1、磷脂酰肌醇3激酶等分子活性,減弱組蛋白乙?；富钚?增加HDAC2表達[8,35]。(2)姜黃素可通過抑制磷酸化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶,提高HDAC2 的表達。 (3)姜黃素可干預磷酸化-泛素-蛋白酶體途徑,提高HDAC2的活性[9]。

盡管姜黃素具有以上多種生物活性,但姜黃素自身穩(wěn)定性差,難溶于水,在體外易被氧化,在體內(nèi)經(jīng)胃腸道代謝易失活,難被人體吸收[36],故為其推廣應用帶來了一定的難度,也是姜黃素類化合物尚未開發(fā)成新藥的根本原因,因此,如何提高姜黃素的水溶性及生物利用度是以后積極探討的重要內(nèi)容,也是姜黃素能夠早日應用于臨床的關(guān)鍵問題?？傊?本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠改善COPD 患者糖皮質(zhì)激素抵抗現(xiàn)象,為COPD 患者臨床治療提供了新思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突