徐雪雪， 王春玲， 馬明陽， 陳思錦， 田萬年*

(1. 吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 吉林 132101； 2. 吉林省永吉縣黃榆鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，吉林 永吉 132223)

羊泰勒蟲病是由泰勒屬(Theileria)的多種原蟲引起羊的血液原蟲病[1]。該病可通過蜱傳播，羊被攜帶蟲體的蜱叮咬后，蟲體由血液侵入羊體內(nèi)并寄生在巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞中進(jìn)而引發(fā)病理現(xiàn)象。我國已報(bào)道能夠感染羊的泰勒蟲分別為呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲、綿羊泰勒蟲，其中呂氏泰勒蟲作為國內(nèi)的優(yōu)勢蟲種分布范圍廣且危害最大[2]。本病危害嚴(yán)重，外地引進(jìn)羊發(fā)病率較高，慢性發(fā)病羊生長發(fā)育變緩，產(chǎn)肉量和產(chǎn)毛量顯著下降，給養(yǎng)羊業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[3]。為了解吉林市左家鎮(zhèn)羊泰勒蟲優(yōu)勢蟲種及感染情況，本試驗(yàn)應(yīng)用血液涂片鏡檢結(jié)合PCR方法對采自吉林市左家鎮(zhèn)4個(gè)村的綿羊血液樣品進(jìn)行羊泰勒蟲檢測，為相關(guān)防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 血液樣品無菌采集左家鎮(zhèn)馬虎頭村、大官地村、黃花村、河灣子村飼養(yǎng)的綿羊抗凝血樣品278份，用于相關(guān)項(xiàng)目檢測。

1.2 主要試劑及儀器血液DNA提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)、DNA 2 000 Marker[寶生物工程(大連)有限公司]、瓊脂糖(上海生工生物工程有限公司)、PCR儀(百泰克生物技術(shù)有限公司)。

1.3 血液涂片染色鏡檢制作血涂片，滴加甲醇固定，放入裝有吉姆薩染液的染缸中，室溫染色6 h，然后取出血涂片用蒸餾水沖洗，自然晾干后顯微鏡檢查羊泰勒蟲體。

1.4 分子生物學(xué)檢測

1.4.1 基因組DNA提取將采集的綿羊抗凝血按照血液基因組DNA提取試劑盒說明書程序提取全血基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 羊泰勒蟲PCR檢測及測序根據(jù)GenBank 收錄的羊泰勒蟲18S rRNA基因序列，分別設(shè)計(jì)3種羊泰勒蟲PCR擴(kuò)增引物(見表1)。PCR反應(yīng)體系25 μL ：TaqPreMix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA 2 μL，dd H2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，55～62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行核苷酸序列測定。

表1 羊泰勒蟲PCR擴(kuò)增引物

2 結(jié)果

2.1 血涂片染色鏡檢羊血涂片經(jīng)吉姆薩染色后在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)梨形蟲體(見圖1)。

圖1 羊血涂片染色鏡檢結(jié)果(1 000×)

2.2 羊泰勒蟲PCR檢測及測序通過對278份綿羊血液樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測到呂氏泰勒蟲特異性條帶(見圖2)?；厥?0份PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)核苷酸序列測定，結(jié)果與GenBank 登錄的呂氏泰勒蟲(登錄號：AY262119)同源性為99.9%，與尤氏泰勒蟲(登錄號：AY262116)同源性為96.4%，與綿羊泰勒蟲(登錄號：FJ603460)同源性為96.0%，鑒定左家鎮(zhèn)流行的羊泰勒蟲均為呂氏泰勒蟲(T.luwenshuni)。

M：DL 2 000 DNA Marker； 1～5：檢測樣品； 6：陰性對照圖2 羊泰勒蟲PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 不同村羊泰勒蟲感染率對4個(gè)村羊泰勒蟲PCR檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表2。各村羊泰勒蟲平均感染率為19.06%。其中馬虎頭村羊泰勒蟲感染率最高，為32.89%；大官地村感染率最低，為8.33%。

表2 左家鎮(zhèn)4個(gè)村羊泰勒蟲感染情況

3 結(jié)論

經(jīng)檢測鑒定，吉林市左家鎮(zhèn)羊泰勒蟲感染蟲種為呂氏泰勒蟲，平均感染率為19.06%，應(yīng)加強(qiáng)羊泰勒蟲病的防治工作。

4 討論

近年來我國養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展迅速，羊泰勒蟲病在大部分省(區(qū)、市)均有流行，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。通常情況下羊感染一定數(shù)量的泰勒蟲才會表現(xiàn)出臨床癥狀，多為隱性感染。該病主要造成免疫器官受損，引發(fā)免疫抑制，免疫功能下降，嚴(yán)重影響生產(chǎn)性能。對羊泰勒蟲蟲種的收集與鑒定是防治該病的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)應(yīng)用血液涂片檢查和PCR方法對左家鎮(zhèn)羊泰勒蟲進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示4個(gè)村均有呂氏泰勒蟲感染。分析原因可能與當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境有關(guān)，左家鎮(zhèn)為低山丘陵地區(qū)，森林茂密，利于傳播媒介蜱的生長繁殖，放牧?xí)r羊易受到蜱叮咬，從而感染羊泰勒蟲。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)所感染蟲種僅為呂氏泰勒蟲，尚未檢測到尤氏泰勒蟲和綿羊泰勒蟲，可為吉林市左家鎮(zhèn)羊泰勒蟲病的防控提供參考依據(jù)，同時(shí)也豐富了我國羊泰勒蟲流行病學(xué)資料[5～7]。