石玉濤，鄭淑琳，吳偉偉，羅盛財，陳夏婷，王飛權(quán)，李遠(yuǎn)華，張 渤

（1.武夷學(xué)院茶與食品學(xué)院，茶葉福建省高校工程研究中心，福建 武夷山 354300；2.武夷山市龜巖茶業(yè)有限公司，福建 武夷山 354300）

0 引言

【研究意義】武夷巖茶是閩北烏龍茶的優(yōu)秀代表，以其獨(dú)特的“巖骨花香”品質(zhì)特征和良好的降血脂、抗過敏、抗氧化作用而受到消費(fèi)者喜愛[1]。武夷山茶區(qū)獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境孕育出豐富多彩的武夷名叢茶樹種質(zhì)資源，為武夷巖茶新品種選育和產(chǎn)品開發(fā)提供了寶貴材料。隨著茶產(chǎn)業(yè)向集約化方向發(fā)展，肉桂、水仙等品種成為武夷巖茶生產(chǎn)中的主栽品種，武夷名叢的種植面積越來越小，許多名叢因管理不善而逐步衰老枯死，有的甚至被挖毀改種，造成武夷名叢茶樹種質(zhì)資源的多樣性日益耗失。近年來，在當(dāng)?shù)卣筒枞说呐ο?，?shù)百份武夷名叢逐步被收集并建圃保存，但對于武夷名叢的科學(xué)鑒定評價和發(fā)掘利用工作還較為滯后[2]。因此，系統(tǒng)開展武夷名叢種質(zhì)資源的鑒定評價，對武夷名叢茶樹種質(zhì)資源的保護(hù)和開發(fā)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】茶多糖（Tea polysaccharides, TPS）是茶葉中的一種重要的生理活性物質(zhì)，具有顯著的降血糖、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)能力等保健功效，有望開發(fā)成為防治糖尿病和心血管疾病的新型功能性食品和藥物[3]。目前，關(guān)于茶多糖的研究集中在提取分離、純化[4]、結(jié)構(gòu)表征鑒定及生物活性方面[5]，對原料性能與生物活性關(guān)系研究的報道較少。已有研究表明，茶多糖特性和生物活性存在品種多樣性[6]。而對于不同品種的羅望子[7]、棗[8]等植物多糖的研究也揭示了植物多糖的抗氧化活性具有品種間差異。近年來，學(xué)者對武夷名叢茶樹種質(zhì)資源的農(nóng)藝性狀[9]、葉片解剖結(jié)構(gòu)[10]和生化成分[11]等進(jìn)行了較為深入的研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對武夷名叢茶樹種質(zhì)資源茶多糖特性和抗氧化活性的研究鮮見報道。筆者前期對金毛猴等5 份武夷名叢茶多糖清除羥基自由基活性進(jìn)行了初步研究[12]，發(fā)現(xiàn)不同武夷名叢茶多糖清除羥基自由基活性存在差異，但該研究覆蓋武夷名叢材料份數(shù)少，對武夷名叢茶多糖特性和抗氧化活性的分析和評價尚不夠全面?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以31 份武夷名叢茶樹種質(zhì)資源為試材，以相同條件和方法提取茶多糖，測定茶多糖基本組分和清除DPPH 自由基（DPPH·）、羥基自由基（·OH）的活性，并采用聚類熱圖分析和隸屬函數(shù)法對武夷名叢茶樹種質(zhì)資源進(jìn)行分類和綜合評價，旨在探明不同武夷名叢茶樹種質(zhì)資源茶多糖的組成特征和體外抗氧化活性差異，篩選出含有高抗氧化活性茶多糖的武夷名叢種質(zhì)，為武夷名叢茶樹種質(zhì)資源的開發(fā)利用和烏龍茶新品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的31 份武夷名叢茶樹種質(zhì)資源采集自武夷山龜巖種植園茶樹資源圃（閩茶圃004 號），每份種質(zhì)種植小區(qū)長×寬為 15 m×1.8 m，茶樹樹齡為3～18年，基本信息見表1。該圃位于福建省武夷山市星村鎮(zhèn)前蘭村梅子橋（東經(jīng)117°97′59″，北緯27°61′50″），海拔200 ～270 m，土層深厚，灌溉條件便利，屬中亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候區(qū)；光照充足，雨量豐沛，溫濕度適宜，適合茶樹生長[13]。圃內(nèi)種質(zhì)資源材料均由其來源地取無病蟲害的枝梢在圃內(nèi)進(jìn)行扦插繁育保存，立地土壤條件和肥水管理一致。

1.2 主要儀器與試劑

FZ102 型微型植物粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；Alpha2-4 型冷凍干燥機(jī)，德國Christ 公司；GK 系列型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；JJ-I 型精密增力定時電動攪拌器，江蘇金壇市中大儀器廠；UV-3200PC 型分光光度計，上海嘉鵬科技有限公司；Neofuge 15R 型高速冷凍離心機(jī)，香港力康生物醫(yī)療科技有限公司。半乳糖醛酸、脫氧核糖（DR）、硫代巴比妥酸（TBA）、1,1-二苯基苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH），美國Sigma-Aldrich 公司；上述及其他試劑（購自中國醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）均為分析純。

表1 供試材料基本信息Table 1 Basic information on tested materials

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集與處理 武夷名叢茶樹種質(zhì)資源鮮葉原料采自春季第1 輪新梢，每份種質(zhì)資源材料從種植小區(qū)中隨機(jī)選擇60 株以上茶樹，從樹冠外圍中部隨機(jī)采摘一芽二葉新梢600～800 g，重復(fù)3 次。新梢采摘后蒸汽殺青固樣，烘干、粉碎后過40 目篩，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 茶多糖的提取 參照倪德江等[14]的方法，采用水提醇沉淀法提取茶多糖。按式（1）計算粗茶多糖提取率：

1.3.3 茶多糖組分測定 糖醛酸含量測定采用硫酸-咔唑法[15]；蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法[16]；中性糖含量測定采用蒽酮-硫酸法[17]；茶多酚含量測定采用福林酚法[18]。

1.3.4 茶多糖清除自由基活性測定

茶多糖清除羥基自由基活性測定 將提取的茶多糖配制成5.0 mg·mL-1，采用D-脫氧核糖-鐵體系法測定不同武夷名叢茶多糖對·OH 自由基的清除率[19]。

茶多糖清除DPPH·自由基活性測定 將提取的茶多糖配制成1.0 mg·mL-1，參照CHEN 等[20]的方法測定不同武夷名叢茶多糖對DPPH·自由基的清除率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；采用TBtools（Toolbox for Biologists）v0.6696 生物信息學(xué)分析軟件進(jìn)行層次聚類（HCA）并繪制聚類熱圖[21]，聚類方法為Complete-linkage 法，距離為歐氏距離；以每個性狀極差的1/10 為間距將各性狀分為10 個等級，采用Shannon-Wiener 指數(shù)法計算各性狀的遺傳多樣性指數(shù)（H′），計算公式為：多樣性指數(shù)（H′）=-ΣPilnPi，其中Pi 為某性狀第i 個代碼出現(xiàn)的頻率[22]；采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對武夷名叢茶多糖抗氧化活性進(jìn)行綜合評價，隸屬值=（X-Xmin）/（Xmax-Xmin），式中X 為測定值，Xmax為最大值，Xmin為最小值，反隸屬函數(shù)與抗氧化活性呈負(fù)相關(guān)，反隸屬函數(shù)值=1-（X-Xmin）/（Xmax-Xmin）[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 武夷名叢茶樹種質(zhì)資源茶多糖組成分析

2.1.1 茶多糖提取率分析 31 份武夷名叢茶樹種質(zhì)資源茶多糖的提取率見圖1。不同種質(zhì)武夷名叢茶多糖提取率差異較大，茶多糖提取率最高的種質(zhì)為MC28（九龍珠），提取率達(dá)3.39%，提取率最低的種質(zhì)為MC14（香石角），提取率為1.73%，相差1.66%；茶多糖提取率的變異系數(shù)為18.33%，遺傳多樣性指數(shù)為2.05，說明武夷名叢茶多糖的提取率存在種質(zhì)間差異性。

2.1.2 茶多糖基本組分分析 31 份武夷名叢茶樹種質(zhì)資源茶多糖中各組分含量如圖2 所示。茶多糖中中性糖含量在25.75%～67.21%，含量最高的種質(zhì)是MC31（正白毫），最低的種質(zhì)是MC15（紅雞冠）（圖2-A）；糖醛酸含量在11.10%～22.57%，含量最高的種質(zhì)是MC26（嶺下蘭），最低的種質(zhì)為MC10（向天梅）（圖2-B）；蛋白質(zhì)含量變幅為2.24%～7.42%，含量最高的種質(zhì)為MC04（玉笪），最低的種質(zhì)是MC31（正白毫）（圖2-C）；茶多酚含量在3.81%～9.68%，含量最高的種質(zhì)是MC11（金丁香），最低的種質(zhì)是MC31（正白毫）（圖2-D）；4 個指標(biāo)的變異系數(shù)在16.74%～22.68%，平均變異系數(shù)19.55%，遺傳多樣性指數(shù)在1.93～2.18，平均值為2.05。

2.2 武夷名叢茶樹種質(zhì)資源茶多糖體外抗氧化活性分析

2.2.1 茶多糖清除自由基活性分析 31 份武夷名叢茶樹種質(zhì)資源茶多糖清除DPPH·和·OH 自由基活性如圖3 所示。茶多糖對DPPH·自由基的清除率在25.47%～84.30%，清除率最高的種質(zhì)為MC07（玉蟾），清除率最低的種質(zhì)是MC31（正白毫）（圖3-A）；茶多糖對·OH 自由基清除率在34.98%～78.38%，清除率最高的種質(zhì)為MC04（玉笪），最低的種質(zhì)是MC13（金雞母）（圖3-B）。茶多糖對DPPH·和·OH自由基清除率的變異系數(shù)分別為23.71%和20.68%，平均變異系數(shù)為22.20%，遺傳多樣性指數(shù)分別為2.05 和2.09，平均遺傳多樣性指數(shù)2.07。

2.2.2 基于茶多糖組成和清除自由基活性的聚類熱圖分析 基于茶多糖組成和清除自由基活性對31 份武夷名叢進(jìn)行聚類熱圖分析，結(jié)果見圖4。31 份武夷名叢茶樹種質(zhì)資源可分為3 類，第一類（Ⅰ）包含MC29、MC31 2 份資源，此類資源茶多糖清除·OH自由基能力較強(qiáng)，清除DPPH·自由基能力弱，提取率和中性糖含量高，其余組分含量低；第二類（Ⅱ）包含MC10、MC16、MC17、MC06、MC13、MC11、MC14、MC18、MC05、MC12、MC27、MC20、MC23、MC02、MC25 15 份資源，此類資源茶多糖清除DPPH·自由基能力較強(qiáng)，清除·OH 自由基能力弱，提取率低，各組分含量均較高；第三類（Ⅲ）包含MC19、 MC21、 MC28、 MC03、 MC04、 MC09、MC22、 MC30、 MC01、 MC07、 MC08、 MC15、MC24、MC26 14 份資源，此類資源的主要特征是茶多糖DPPH·和·OH 自由基能力強(qiáng)，提取率較高，中性糖含量低，其余組分含量高。對茶多糖組成和抗氧化活性7 個指標(biāo)的聚類結(jié)果顯示，提取率和中性糖2 個指標(biāo)與其余5 個指標(biāo)明顯分開，表明茶多糖組分中蛋白質(zhì)、茶多酚和糖醛酸含量與DPPH·和·OH 自由基清除率相關(guān)性較強(qiáng)，這3 種組分對茶多糖清除DPPH·和·OH 自由基活性的貢獻(xiàn)較大，其中蛋白質(zhì)和茶多酚與清除DPPH·自由基活性關(guān)系相對較近，糖醛酸與清除·OH 自由基活性關(guān)系相對較近，而提取率和中性糖含量與DPPH·和·OH 自由基清除率相關(guān)性較弱。

圖1 武夷名叢茶多糖提取率Fig.1 TPS extraction rates of various Wuyi Mingcong tea germplasms

圖2 武夷名叢茶多糖基本組分含量Fig.2 Composition of TPS extracted from various Wuyi Mingcong tea germplasms

圖3 武夷名叢茶多糖對DPPH 自由基和·OH 的清除能力Fig.3 Scavenging rates on DPPH· and ·OH by TPS extracted from various Wuyi Mingcong tea germplasms

圖4 31 份武夷名叢種質(zhì)資源基于茶多糖基本組成和抗氧化活性的聚類熱圖Fig.4 Clustered heatmap of 31 Wuyi Mingcong tea germplasms based on composition and antioxidant activity of TPS

2.2.3 茶多糖體外抗氧化活性綜合評價 利用隸屬函數(shù)法對武夷名叢茶多糖體外抗氧化活性進(jìn)行多指標(biāo)綜合評價，結(jié)果見表2。31 份武夷名叢種質(zhì)資源平均隸屬函數(shù)值在0.16～0.79，平均隸屬函數(shù)值排名前5 位的武夷名叢種質(zhì)為MC08（九龍?zhí)m）、MC07（玉蟾）、MC04（玉笪）、MC01（白雞冠）、MC15（紅雞冠），說明這5 份武夷名叢茶多糖抗氧化活性較強(qiáng)；排名后5 位的武夷名叢種質(zhì)為MC31（正白毫）、MC29（正太陽）、MC13（金雞母）、MC10（向天梅）、MC17（紅孩兒），說明這5 份材料茶多糖的抗氧化活性較弱。排名前5 位的5 份材料位于聚類分析的第三類，排名后2 位的2 份材料與聚類分析第一類的2 份材料一致，由此表明采用隸屬函數(shù)法對武夷名叢種質(zhì)資源茶多糖抗氧化活性的綜合評價可獲得與聚類分析基本一致的類群劃分結(jié)果。

表2 31 份武夷名叢茶樹種質(zhì)資源茶多糖抗氧化活性的隸屬函數(shù)分析Table 2 Subordinate function analysis on antioxidant activity of TPS extracted from 31 Wuyi Mingcong tea germplasms

3 討論與結(jié)論

種質(zhì)資源是作物遺傳育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，種質(zhì)資源遺傳差異大小直接影響性狀遺傳改良和研究利用的效果[24]。本研究結(jié)果顯示同一生境下保存的31 份武夷名叢茶樹種質(zhì)資源茶多糖的提取率、茶多糖基本組分和清除自由基活性具有明顯的種質(zhì)間差異，說明不同武夷名叢茶樹種質(zhì)資源之間茶多糖組成特征及抗氧化活性的差異主要受基因型的影響，這與陳玉瓊等[6]的研究結(jié)果一致。不同武夷名叢茶多糖組成特征和清除自由基活性具有豐富的遺傳變異性，茶多糖組成和清除自由基活性7 個指標(biāo)平均變異系數(shù)為20.13%，平均遺傳多樣性指數(shù)達(dá)2.05，表明武夷名叢茶樹種質(zhì)資源茶多糖性狀變異豐富、類型廣泛，可為選育出滿足不同保健價值的育種目標(biāo)提供豐富的種質(zhì)材料。

前人研究表明，茶多糖抗氧化活性與茶葉種類、茶多糖一級結(jié)構(gòu)及其中的中性糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸含量等有關(guān)[25,26]。本研究結(jié)果顯示，茶多糖對DPPH·和·OH 自由基的清除率均與其組分中糖醛酸、蛋白質(zhì)和茶多酚含量呈正相關(guān)，說明糖醛酸、蛋白質(zhì)和茶多酚對武夷名叢茶多糖抗氧化活性的貢獻(xiàn)較大；艾于杰[27]研究表明，粗多糖與純化后的各多糖組分均可清除DPPH·自由基，但純化后的多糖組分清除DPPH·自由基的能力有明顯下降，推測粗多糖清除DPPH·自由基活性為各組分與茶多糖結(jié)合后協(xié)同作用的結(jié)果，這與本研究結(jié)果一致。但聚類熱圖分析結(jié)果表明武夷名叢茶多糖組分中中性糖含量與其抗氧化活性呈負(fù)相關(guān)，推測武夷名叢茶多糖的結(jié)構(gòu)特征可能對其抗氧化活性有更明顯的影響[28]。

·OH 自由基是機(jī)體內(nèi)氧化活性最強(qiáng)的一種瞬態(tài)自由基，可誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生氧化損傷。在D-脫氧核糖-鐵體系中，F(xiàn)e2+-EDTA 在磷酸鹽緩沖液中與H2O2反應(yīng)引發(fā)產(chǎn)生·OH，·OH 與DR 反應(yīng)產(chǎn)生MDA，再與TBA 在酸性加熱的條件下形成色素[29]。本研究中，加入不同種質(zhì)武夷名叢茶多糖樣品后，MDA 生成量明顯減少，說明茶多糖可通過與DR 競爭·OH 方式達(dá)到清除自由基的效果。DPPH·自由基是一種以氮為中心的穩(wěn)定的自由基，其水溶液具有紫紅色特征吸收峰，抗氧化劑可以與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，溶液顏色逐漸變淺，褪色程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系[30]。本研究中，加入不同種質(zhì)武夷名叢茶多糖樣品后，溶液顏色變淺，吸光度變小，說明武夷名叢茶多糖可通過替代或結(jié)合方式使體系中DPPH·自由基數(shù)量減少，達(dá)到清除自由基的效果。本研究結(jié)果顯示，DPPH·自由基清除率高的武夷名叢茶多糖，其·OH 自由基清除率并不一定高，這一方面說明武夷名叢茶多糖對瞬態(tài)自由基和穩(wěn)定自由基的清除能力不同，另一方面也說明茶多糖可通過多種機(jī)制和途徑實現(xiàn)清除自由基的效果[31]，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

聚類分析是應(yīng)用多元統(tǒng)計分析原理研究問題分類的一種數(shù)學(xué)方法，可同時對大量性狀進(jìn)行綜合考察[32]，熱圖是近年來被廣泛應(yīng)用的一種統(tǒng)計方法，可以簡單地聚合大量數(shù)據(jù)，將結(jié)果以一種漸近的色帶直觀地區(qū)性展現(xiàn)出來，兩種多元統(tǒng)計方法已廣泛應(yīng)用于多樣品、多指標(biāo)的植物種質(zhì)資源分類研究工作中[33]。本研究采用層次聚類熱圖分析將31 份武夷名叢茶樹種質(zhì)資源分為3 類，各類群間茶多糖組成和抗氧化活性指標(biāo)存在明顯差異。故在武夷名叢茶樹種質(zhì)資源茶多糖性狀篩選時，可以結(jié)合不同類群的特點(diǎn)加以利用，從而提高親本選擇的效率和可預(yù)知性。

綜上所述，31 份武夷名叢茶樹種質(zhì)資源茶多糖組成和體外抗氧化活性存在明顯差異和多樣性，茶多糖抗氧化活性較強(qiáng)的5 份武夷名叢種質(zhì)為九龍?zhí)m、玉蟾、玉笪、白雞冠、紅雞冠，可作為武夷巖茶保品質(zhì)育種的親本材料。進(jìn)一步開展武夷名叢茶多糖構(gòu)效關(guān)系研究，其將為武夷名叢茶樹種質(zhì)資源的開發(fā)利用和烏龍茶保健育種提供更為全面的理論參考。