白明勇，周鑰，姜雪冰，程忠，吳逸凡，楊洪致，陳秋紅

(成都理工大學(xué)，成都 610051)

花青素是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬于黃酮類化合物，也是植物花瓣中主要的呈色物質(zhì)。紫薯花青素作為一種天然食用色素，具有產(chǎn)量高，成本低，營(yíng)養(yǎng)豐富，耐光性和耐熱性好等優(yōu)點(diǎn)。大量研究表明，紫薯花青素具有降低血脂和抗氧化[1-2]，保護(hù)肝臟[3]，抗炎癥[4]，預(yù)防肥胖[5]，抑制金黃色葡萄球菌[6]和介導(dǎo)肝癌細(xì)胞SNU-387和結(jié)腸癌HCT－116細(xì)胞凋亡過(guò)程的抗癌等作用[7-10]。紫薯花青素在酸性環(huán)境下穩(wěn)定，中性、堿性環(huán)境中易分解失效的理化性質(zhì)使得紫薯花青素口服給藥后，在胃部穩(wěn)定，轉(zhuǎn)運(yùn)至腸道后，受到腸道中性環(huán)境的影響分解失效，較大地影響了其口服生物利用度，因此增加紫薯花青素在胃部的滯留時(shí)間以提高其口服生物利用度的新型制劑研究迫在眉睫；胃漂浮緩釋片可以使藥物一直處于胃部酸性環(huán)境中，同時(shí)減少給藥次數(shù)，提高紫薯花青素穩(wěn)定性的同時(shí)提高了患者服藥的順應(yīng)性。近年來(lái)，李飛[11]和王余夢(mèng)[12]等研究了紫薯花青素微膠囊工藝，未見(jiàn)紫薯花青素胃漂浮緩釋片的文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以紫薯花青素為模型藥物，以羥丙甲基纖維素(HPMC)為主要輔材，采用濕法制粒壓片的方法制備胃漂浮緩釋片，減小生理環(huán)境對(duì)藥物穩(wěn)定性的影響，延長(zhǎng)花青素在胃內(nèi)的滯留時(shí)間，以達(dá)到提高紫薯花青素口服生物利用度，減少給藥次數(shù)的目的。

1 材料與儀器

1.1 儀器

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海譜元儀器有限公司)；萬(wàn)分之一電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；TDP-6單沖壓片機(jī)(吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械有限公司)；ZRS-8G智能藥物溶出儀(天津市精拓儀器科技有限公司)。

1.2 試劑

花青素原料藥(西安優(yōu)碩生物科技有限公司，批號(hào)：YS20180618)；羥丙甲基纖維素(HPMC K4M，Ashland)；乳糖(成都科龍化工試劑廠)；共聚維酮(上海昌為醫(yī)藥輔料技術(shù)有限公司)；碳酸氫鈉、硬脂酸鎂均為藥用規(guī)格；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 體外釋放度測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

精密稱取紫薯花青素提取物，以0.1mol/L鹽酸為溶劑，制備成濃度為6、12、30、60、100μg/mL的系列對(duì)照品溶液，于525nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[13]，將吸光度值(A)對(duì)濃度(c)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為 A=0.0015c－0.00452；r2=0.99997(見(jiàn)圖1)。結(jié)果表明，紫薯花青素在 6～100μg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.2 方法學(xué)考察

加樣回收實(shí)驗(yàn)：取精密稱定后的紫薯花青素原料藥，以pH=1鹽酸溶液為溶劑，配制低(20μg/mL)、中(40μg/mL)、高(80μg/mL)濃度的紫薯花青素溶液，連續(xù)6次在525nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果表明該法回收率良好(見(jiàn)表1)。

方法學(xué)考察表明，其精密度、重復(fù)性與穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均符合相關(guān)要求。說(shuō)明建立的分析方法可用于紫薯花青素的含量測(cè)定。

2.1.3 37℃(釋放實(shí)驗(yàn)溫度)紫薯花青素的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按加樣回收項(xiàng)下方法分別配置濃度為20μg/mL、40μg/mL、76μg/mL的紫薯花青素鹽酸溶液，在37±0.5℃保溫11h，定時(shí)取樣3mL，在525nm處測(cè)定吸收，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=0.0015c－0.00452計(jì)算樣品濃度，結(jié)果見(jiàn)表2由結(jié)果可知，紫薯花青素鹽酸溶液在釋放試驗(yàn)條件下11h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4 釋放度測(cè)定方法

按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版(四部) 通則0931第一法(籃法)操作，以900mL的0.1mol/L鹽酸為釋放介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100r/min，溫度(37.0±0.5)℃。在各規(guī)定測(cè)定時(shí)間取樣5mL(隨后補(bǔ)加同溫度下等體積介質(zhì))，0.45μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液于525nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算累積釋放度。

圖1 紫薯花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 制劑處方優(yōu)化

2.2.1 紫薯花青素胃漂浮緩釋片的制備

該緩釋片采用濕法制粒壓片，具體制備方法為：按處方量稱取主藥與輔料，加入乳糖，混勻，以95%乙醇為潤(rùn)濕劑，用24目藥典篩制粒，50℃干燥后整粒，加入潤(rùn)滑劑硬脂酸鎂1%，混勻5min；壓片，得硬度(50±2)N，片重約300mg紫薯花青素胃漂浮緩釋片，每片含紫薯花青素30mg。

2.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

預(yù)試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)考察結(jié)果顯示，制劑處方中HPMC K4M、共聚維酮與碳酸氫鈉的用量為藥物釋放和片劑漂浮性能的主要影響因素。各制劑處方胃漂浮性能良好，釋藥性能差別較大，選取制劑在1h、4h、8h的累積釋放度Q1h(20%～35%)、Q4h(40%～60%)、Q8h(85%～95%)為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法是近年來(lái)常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化方法，具有實(shí)驗(yàn)精度高、擬合性好等特點(diǎn)[14]，按照星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法優(yōu)化的原理設(shè)計(jì)了三因素五水平試驗(yàn)，具體水平設(shè)置見(jiàn)表3，試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表4。

2.2.3 紫薯花青素胃漂浮片漂浮性能

漂浮性能的測(cè)定采用直接觀察法。配制濃度為0.1mol/L的鹽酸900mL于溶出儀中，將制備好的片劑沿溶出杯同一高度劃入溶液表面，啟動(dòng)攪拌槳(100 r/min)模擬胃蠕動(dòng)溫度37℃，記錄起漂時(shí)間和持漂時(shí)間。從星點(diǎn)設(shè)計(jì)的結(jié)果來(lái)看，除處方1、3、8、9外，其余處方均迅速起漂，持漂時(shí)間均＞8h。

2.2.4 模型擬合實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用 Design Expert 8.0.6.1 版軟件，分別進(jìn)行多元線性回歸擬合和二元多項(xiàng)式擬合[15]。以置信度(P＜0.05)作為顯著標(biāo)準(zhǔn)，剔除不顯著項(xiàng)后選取復(fù)相關(guān)系數(shù)(r2)較大的模型，對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。

多元線性方程：

表1 紫薯花青素加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 樣品溶液釋放度條件下的穩(wěn)定性(n=5)

二項(xiàng)式擬合方程:

表3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平表

表4 試驗(yàn)安排及結(jié)果

比較多元線性擬合方程和二項(xiàng)式擬合方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)，根據(jù)顯著性(P＜0.05)和r2最大原則，優(yōu)選出二項(xiàng)式方程擬合效果更佳。經(jīng)簡(jiǎn)化后模型方程P＜0.05，r2＞0.7109，方程具有較高的可信度。星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法的擬合方程及方差分析表明，處方中HPMC K4M與共聚維酮用量對(duì)藥物釋放有極顯著影響，碳酸氫鈉用量對(duì)藥物釋放的影響不顯著,藥片主要由于碳酸氫鈉與胃內(nèi)酸性介質(zhì)反應(yīng)持續(xù)產(chǎn)生氣體而快速且持續(xù)漂浮在胃內(nèi)，實(shí)驗(yàn)得出碳酸氫鈉的用量是影響漂浮性能的主要因素。

2.2.5 效應(yīng)面

根據(jù)簡(jiǎn)化后的二項(xiàng)式擬合方程，分別以累積釋放度Q1h、Q4h、Q8h對(duì)A(HPMC)，B(碳酸氫鈉)，C(共聚維酮)做三維效應(yīng)面圖和等高線圖(見(jiàn)圖2)。從三維效應(yīng)面圖和等高線圖可看出，藥物累積釋放度隨 HPMC K4M和共聚維酮用量的增加而降低，共聚維酮用量對(duì)藥物釋放的影響比HPMC K4M用量更顯著，三因素中對(duì)本制劑體外釋藥影響大小為共聚維酮＞HPMC＞碳酸氫鈉。

2.2.6 優(yōu)化處方

經(jīng)模型擬合，將效應(yīng)面對(duì)應(yīng)的等高線疊加，得到輔料用量預(yù)測(cè)最佳范圍為:HPMC 17.46%～26.94%、碳酸氫鈉9.62%～15.13%。優(yōu)化處方的等高線疊加圖(圖3)。根據(jù) Design-Expert軟件優(yōu)選出最佳處方:HPMC 19.08%、碳酸氫鈉14.34%、共聚維酮7.12%。

圖2 Q1h、Q4h、Q8h 對(duì)HPMC和共聚維酮的三維效應(yīng)面圖和等高線圖

2.2.7 釋放度測(cè)定

按照最佳處方：HPMC 19.08%、碳酸氫鈉14.34%、共聚維酮7.12%，平行制備三批紫薯花青素胃漂浮緩釋片，每批投藥量為6片，所制備的胃漂浮緩釋片的起漂時(shí)間＜5min，續(xù)漂時(shí)間＞11h，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11h的累積釋放度RSD分別為0.86%、4.11%、7.34%、1.39%、3.39%、1.64%、2.67%、0.76%、0.55%、1.18%、1.10%各批次取樣點(diǎn)平均累計(jì)釋放度和RSD值見(jiàn)表5，重復(fù)性良好，符合設(shè)計(jì)要求。其中1h，4h，8h累積釋放度的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值見(jiàn)表6，預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值偏差絕對(duì)值均小于5%，表明實(shí)驗(yàn)所得擬合方程能很好的預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和趨勢(shì)。

2.2.8 釋藥機(jī)理初步研究

圖3 處方優(yōu)化等高線疊加圖

表5 各批次取樣點(diǎn)平均累計(jì)釋放度和RSD值(n=6)

按最佳制劑處方制備紫薯花青素胃漂浮緩釋片，三批樣品體外釋放曲線見(jiàn)圖4。應(yīng)用Origin 2016軟件對(duì)其體外釋放曲線進(jìn)行方程擬合，分別采用了零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、Higuchi方程、Weibull方程和Ritger-peppas方程等進(jìn)行擬合，擬合結(jié)果見(jiàn)表7。其體外釋放行為，以Weibull方程擬合效果最好，Weibull擬合曲線見(jiàn)表5。擬合方程結(jié)果可以看出藥物為非 Fick 擴(kuò)散，通過(guò)擴(kuò)散和骨架溶蝕共同作用釋藥[16]。在釋放試驗(yàn)中，HPMC吸水形成凝膠，藥片體積逐漸增大，藥物透過(guò)凝膠骨架空隙緩慢擴(kuò)散，釋藥后期以骨架溶蝕為主，同時(shí)可以得出藥物釋放符合一級(jí)速率過(guò)程，釋放曲線具有明顯的緩釋特征。體外釋放度試驗(yàn)顯示，制備的紫薯花青素胃漂浮緩釋片達(dá)到11h緩釋。

3 討論與展望

普通片劑在胃腸道滯留時(shí)間太短，未被釋放就通過(guò)吸收部位，胃漂浮片是根據(jù)流體動(dòng)力學(xué)平衡原理制成的一種新型制劑，這種制劑在胃中滯留時(shí)間長(zhǎng)，將紫薯花青素制成胃漂浮緩釋片有助于提高紫薯花青素的口服生物利用度。

不同黏度的HPMC 對(duì)藥物釋放度影響較大，在實(shí)驗(yàn)前期考察了不同黏度的HPMC(K4M、K15M)對(duì)藥物體外釋放度的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HPMC K15M黏度過(guò)大，藥物釋放過(guò)于緩慢，黏度較低的HPMC K4M更符合本實(shí)驗(yàn)對(duì)胃漂浮緩釋片的要求，因此本實(shí)驗(yàn)選擇了HPMC K4M為凝膠骨架。

根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)處方1、3、9結(jié)果，可以認(rèn)為凝膠骨架HPMC的用量對(duì)于藥物突釋有較大影響，用量過(guò)少會(huì)導(dǎo)致藥物突釋；根據(jù)處方15，16結(jié)果，可以認(rèn)為共聚維酮對(duì)藥物釋放同樣有較大影響，過(guò)多會(huì)造成藥物釋放過(guò)緩，過(guò)少會(huì)造成藥物突釋。

表6 驗(yàn)證處方的累積釋放度

圖4 優(yōu)化處方的體外釋放曲線(n=6)

本實(shí)驗(yàn)為胃漂浮緩釋片應(yīng)用于更多種類的花青素的實(shí)際應(yīng)用提供了指導(dǎo)，但因時(shí)間有限，本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)紫薯花青素胃漂浮緩釋片體外釋放度進(jìn)行了研究，而未對(duì)紫薯花青素胃漂浮緩釋片進(jìn)行體內(nèi)漂浮性能及釋藥特性進(jìn)行研究，在將來(lái)的研究中將更全面的研究其漂浮性能和釋藥特性。

藥物穩(wěn)定性是保障藥物安全性和有效性的基本條件，本實(shí)驗(yàn)還未對(duì)紫薯花青素胃漂浮緩釋片進(jìn)行影響因素、加速實(shí)驗(yàn)以及長(zhǎng)期穩(wěn)定性方面的實(shí)驗(yàn)，后續(xù)應(yīng)考察該制劑在溫度、濕度以及光照的影響下隨時(shí)間變化的規(guī)律，為藥品的生產(chǎn)、包裝、貯存及運(yùn)輸條件提供科學(xué)依據(jù)。

表7 最佳處方體外釋放度擬合方程

圖5 Weibull擬合曲線

本文通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)并對(duì)結(jié)果進(jìn)行擬合分析，建立了共聚維酮、HPMC K4M和碳酸氫鈉用量與胃漂浮緩釋片釋藥特性的二次模型，得到最佳處方:HPMC 19.08%、碳酸氫鈉14.34%、共聚維酮7.12%、乳糖 49.46%,整粒后加入硬脂酸鎂1%，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，最優(yōu)處方制得胃漂浮緩釋片持漂時(shí)間＞11h，11h累積釋放度達(dá)到95%以上，具有良好的漂浮性能，制備方法簡(jiǎn)便，工藝穩(wěn)定。星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法可以很好的用于紫薯花青素胃漂浮緩釋片處方工藝優(yōu)化，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。