喻娜 趙有薇 潘阿且

摘要 [目的]建立以銀杏幼莖節(jié)為外植體的無菌接種體系。[方法]以銀杏樹當(dāng)年生幼莖節(jié)為外植體，研究不同種類、不同濃度消毒劑、不同處理時(shí)間對(duì)外植體的消毒效果，及不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑條件對(duì)愈傷的誘導(dǎo)。 [結(jié)果]外植體最佳接種條件為用75%乙醇處理2 min后，10%次氯酸鈉處理15 min，12%次氯酸鈉處理10 min;0.8%新潔爾滅處理20 min;12%雙氧水處理8～10 min，污染率和褐化率都相對(duì)較低。在0.3 ?mol/L NAA和0.3 mol/L 6-BA組合，0.3 mol/L NAA和0.5 mol/L 6-BA組合中，銀杏幼莖節(jié)的愈傷誘導(dǎo)率較高，愈傷的生長(zhǎng)情況較好。[結(jié)論]該研究建立了以銀杏幼莖節(jié)為外植體的再生體系，為其愈傷誘導(dǎo)及其進(jìn)一步的生理研究提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 幼莖節(jié);無菌接種;愈傷誘導(dǎo)

中圖分類號(hào) S723.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）19-0116-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.030

Abstract [Objective]To establish the tissue culture regeneration system of young stem nodes of Ginkgo biloba. [Method]Taking young stem nodes of annual G.biloba tree as explants，disinfection effect of different kinds，concentrations of disinfectants，treatment time on external implants，and different hormone conditions on callus induction were studied. [Result]The optimal inoculation conditions for explants were： after 75% alcohol treatment for 2 min，10% sodium hypochlorite treatment for 15 ?min and 12% sodium hypochlorite treatment for 10 min;0.8% bromogera mine for 20 ?min;12% hydrogen peroxide for 8-10 min; resulted in relatively low pollution rate and browning rate. In the hormone combination of 0.3 mol/L NAA and 0.3 mol/L 6-BA，0.3 mol/L NAA and 0.5 mol/L 6-BA，the callus induction rate of young stem nodes of G.biloba was higher and the callus growth was better. [Conclusion]This study established tissue culture regeneration system of G.biloba，which provided basis for its callus induction and further physiological studies.

Key words Young stem node;Aseptic inoculation;Callus induction

基金項(xiàng)目 廣安職業(yè)技術(shù)學(xué)院校級(jí)重點(diǎn)科研項(xiàng)目（GAZYKY-2019A03）;四川省教育廳重點(diǎn)科研項(xiàng)目（18ZA0228）。

作者簡(jiǎn)介 喻娜（1986—），女，四川隆昌人，講師，碩士，從事植物組織培養(yǎng)研究和教學(xué)工作。

收稿日期 2020-03-04

銀杏（Ginkgo biloba L.）是銀杏科、銀杏屬落葉喬木，因古老而稀少被譽(yù)為“活化石”[1]，又因其集觀賞、食用、藥用、生態(tài)環(huán)保于一體而受到人們的關(guān)注[2]。銀杏傳統(tǒng)的育苗方法為實(shí)生繁殖、扦插繁殖、嫁接繁殖等。但這些方法的繁殖率低、周期長(zhǎng)，遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需求。如果想短期內(nèi)得到大面積優(yōu)良的銀杏苗，組織培養(yǎng)技術(shù)是一種可行有效的方式。傳統(tǒng)育種方式弊端的顯現(xiàn)促使銀杏的組織培養(yǎng)方面研究取得了一定進(jìn)展，從不同外植體包括胚、莖段、子葉、胚軸、小孢子、配子體等方面都有相關(guān)研究[3]?？偟膩砜?，銀杏組培最易成功的外植體首屬莖段，莖段主要通過幼苗或者胚誘導(dǎo)的組培苗采集，幼莖的組培通過腋芽或嫩梢繁殖。羅紫娟[4]曾對(duì)銀杏胚和莖段進(jìn)行過組織培養(yǎng)，獲得再生植株。羅言云等[5]用銀杏無菌苗帶腋芽的莖段為外植體，由帶腋芽的莖段分化芽，分化出的芽再在培養(yǎng)基上分化根，并形成試管苗。通過組培的方式可以保持銀杏母本的優(yōu)良性狀，但分化率小，不定芽數(shù)較少，繁殖速度較慢。陳穎等[6]以銀杏成熟胚培養(yǎng)出的一個(gè)月月齡無菌幼苗各部位莖段為外植體，研究其頂芽、帶腋芽的中段、帶子葉的下段腋芽萌發(fā)和不定芽的分化情況時(shí)發(fā)現(xiàn)由胚誘導(dǎo)的組培苗莖段發(fā)生叢生芽的潛力最大。

以幼莖為外植體的研究多以0.1%升汞搭配75%乙醇進(jìn)行消毒處理，幾乎沒有系統(tǒng)性地研究不同消毒劑對(duì)幼莖消毒的影響[7-9]。用于外植體滅菌的消毒劑種類很多，在實(shí)際應(yīng)用中，外植體的消毒效果受消毒劑種類、濃度和處理時(shí)間及使用方法等多種因素的影響[10]。外植體的消毒效果直接影響銀杏莖節(jié)愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽誘導(dǎo)等，系統(tǒng)性地對(duì)銀杏幼莖節(jié)消毒效果研究為銀杏組織培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。在植物組織培養(yǎng)過程中，6-BA、NAA、IBA等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)多種植物的不同外植體愈傷誘導(dǎo)效果較好[11-13]，胡選萍等[14]在研究銀杏幼莖、莖尖為外植體時(shí)萘乙酸、6-芐基腺嘌呤都有利于愈傷的誘導(dǎo)。該研究選擇不同配比植物調(diào)節(jié)劑6-BA、NAA來研究銀杏幼莖節(jié)愈傷的誘導(dǎo)，以期為銀杏組培快繁及再生等生理學(xué)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 采集3月下旬—5月下旬生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致、粗約2 mm的銀杏母樹當(dāng)年生嫩枝莖節(jié)為外植體，切成小段，每段長(zhǎng)約1.5 cm，中上段帶腋芽。

1.2 滅菌方法

剪取生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致的銀杏當(dāng)年生枝條幼莖，連帶莖段的長(zhǎng)度約0.5 cm，放入含洗衣粉的三角瓶中充分搖晃，靜止浸泡15 min，后在流水下沖洗30 min。在超凈工作臺(tái)上將沖洗干凈的幼莖節(jié)放入75%乙醇中充分搖晃2 min，無菌水沖洗3遍;然后根據(jù)預(yù)試驗(yàn)分別放入不同濃度的消毒劑中處理不同時(shí)間：10%次氯酸鈉分別處理10、15、20 min，12%次氯酸鈉分別處理9、12、15 min ，15%次氯酸鈉分別處理8、10、12 min;新潔爾滅（0.5%、0.8%、1.0%）分別處理10、15、20 min;5%的雙氧水分別處理10、13、15 min，10%的雙氧水分別處理8、10、12 min，12%的雙氧水分別處理5、8、10 min。無菌水沖洗3遍，使用無菌濾紙吸干水分，接種于MS培養(yǎng)基上，每瓶接種7個(gè)莖節(jié)，每組重復(fù)3瓶，即每組接種21個(gè)。

1.3 愈傷誘導(dǎo)

選取經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后無菌的外植體，放置在含有不同濃度（0.1、0.3、0.5 mol/L）的NAA和不同濃度（0.1、0.3、0.5 mol/L）的6-BA組合的MS培養(yǎng)基中，對(duì)外植體進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，每瓶接種3個(gè)外植體，每組重復(fù)3瓶，即每組接種9個(gè)。

1.4 培養(yǎng)條件

以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，蔗糖30 g/L，瓊脂8 g/L，pH調(diào)節(jié)為6左右，將滅菌好的幼莖節(jié)下端插入培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)1 d，然后置于光照強(qiáng)度1 000 lx、光照時(shí)間為12 h/d、溫度為25 ℃、濕度為50%左右的條件下培養(yǎng)。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

外植體的消毒效果主要通過污染率和褐化率來體現(xiàn)，該研究接種5 d后統(tǒng)計(jì)幼莖節(jié)的污染率和褐化率，污染率=污染的外植體個(gè)數(shù)/接種的外植體個(gè)數(shù)×100%，褐化率=褐化的外植體個(gè)數(shù)/接種的外植體個(gè)數(shù)×100%，并觀察幼莖節(jié)的生長(zhǎng)情況。外植體的愈傷誘導(dǎo)情況主要由愈傷誘導(dǎo)率及愈傷的生長(zhǎng)情況來體現(xiàn)，接種到愈傷培養(yǎng)基上30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率，愈傷誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷的外植體個(gè)數(shù)/接種的外植體個(gè)數(shù)×100%，并觀察愈傷生長(zhǎng)情況。

1.6 數(shù)據(jù)處理 采用DPS 7.05進(jìn)行Duncans新復(fù)極差法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 次氯酸鈉消毒效果分析 不同濃度次氯酸鈉處理不同時(shí)間對(duì)外植體污染率和褐化率的影響存在差異（表1），第2組10%次氯酸鈉處理15 min的污染率和褐化率都與第1組差異極顯著（P<0.01），生長(zhǎng)較好。12%的次氯酸鈉處理12 min 時(shí)的污染率和褐化率都最低，褐化率與第1組和第9組時(shí)差異極顯著（P<0.01），污染率與第1、4、6、7組時(shí)的差異顯著（P<0.05），但整體相對(duì)來說比10%的次氯酸鈉更容易褐化。15%次氯酸鈉處理12 min時(shí)污染率也低，但褐化率相對(duì)高。選用次氯酸鈉作為表面消毒劑時(shí)濃度在10%更利于外植體滅菌和生長(zhǎng)。

2.2 新潔爾滅消毒效果分析

不同濃度新潔爾滅處理不同時(shí)間對(duì)外植體污染率和褐化率的影響存在差異（表2），整體來看低濃度的新潔爾滅有助于降低褐化率，但滅菌效果不理想，污染率最低是第6組，此條件下的褐化率也較低。選用新潔爾滅作消毒劑時(shí)用濃度0.8%處理20 min較合適。

2.3 雙氧水消毒效果分析

不同濃度雙氧水處理不同時(shí)間，第8、9組污染率最低，與其他幾組差異顯著（P<0.05），12%雙氧水處理8、10 min污染率和褐化率相對(duì)較低，外植體生長(zhǎng)較好。選用雙氧水作銀杏幼莖節(jié)消毒劑時(shí)用12%雙氧水處理8～10 min為宜（表3）。

2.4 銀杏幼莖愈傷誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)外植體進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)試驗(yàn)，選用不同濃度的NAA和6-BA組合（表4），發(fā)現(xiàn)低濃度和高濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑都不利于愈傷的誘導(dǎo)，第1組和第2組未誘導(dǎo)出愈傷，第9組的愈傷較疏松，呈黃色，生長(zhǎng)較緩慢;第3～8組愈傷誘導(dǎo)率都比較高，愈傷生長(zhǎng)狀態(tài)都比較好，第6組、7組和8組愈傷誘導(dǎo)率較高，較緊密，顏色呈黃綠色;第4組、5組愈傷緊密，呈綠色，更有利于芽的誘導(dǎo)（圖1）。從數(shù)據(jù)分析看，NAA對(duì)愈傷的誘導(dǎo)要比6-BA的影響大，從該試驗(yàn)可以看出，0.3 mol/L NAA比0.1、0.5 mol/L的NAA誘導(dǎo)愈傷效果好一些。綜合2種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的影響，0.3 mol/L NAA和0.3 mol/L 6-BA的組合、0.3 mol/L NAA和0.5 mol/L 6-BA組合下銀杏幼莖節(jié)的愈傷誘導(dǎo)效果相對(duì)較好。

3 結(jié)論

采集3月下旬到5月下旬生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致、粗約2 mm的銀杏母樹當(dāng)年生嫩枝莖節(jié)為外植體，切成每段長(zhǎng)約1.5 cm，通過預(yù)處理后采用75%乙醇處理2 min，再用10%次氯酸鈉處理15 min，12%次氯酸鈉處理10 min或0.8%新潔爾滅處理20 min或12%雙氧水處理8～10 min，處理效果較好。3種消毒劑中次氯酸鈉控制污染率的效果最好，雙氧水控制褐化率的效果最好，可采用75%乙醇處理2 min，12%雙氧水處理8～10 min。在誘導(dǎo)愈傷組織的過程中，NAA較6-BA對(duì)愈傷誘導(dǎo)的效果影響更大，其中濃度為0.3 mol/L的NAA誘導(dǎo)愈傷的效果更好，2種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑結(jié)合使用時(shí)，0.3 mol/L NAA和0.3 mol/L 6-BA組合，0.3 mol/L NAA和0.5 mol/L 6-BA組合下銀杏幼莖節(jié)的愈傷誘導(dǎo)率較高，愈傷生長(zhǎng)情況較好，更有利于芽再生。

參考文獻(xiàn)

[1] 郭長(zhǎng)祿. 銀杏再生體系建立和LEAFY基因表達(dá)、轉(zhuǎn)化的研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2004.

[2] 汪素娟，康安，狄留慶，等.銀杏葉提取物主要活性成分藥動(dòng)學(xué)研究進(jìn)展[J]. 中草藥，2013，44（5）：626-631.

[3] 陳穎，曹福亮.銀杏組培快繁和體胚發(fā)生技術(shù)研究進(jìn)展[J].林業(yè)科技開發(fā)，2006，20（6）：10-14.

[4] 羅紫娟.銀杏莖段的組織培養(yǎng)[J].植物生理學(xué)通訊，1985（1）：35-36.

[5] 羅言云，賈勇炯.銀杏莖段的組織培養(yǎng)及其植株再生[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，38（3）：412-416.

[6] 陳穎，曹福亮，徐彩平，等.不同部位銀杏莖段培養(yǎng)及位置效應(yīng)的研究[J].浙江林業(yè)科技，2010，30（1）：28-31.

[7] 張德華，張占甲，陳坤明，等.銀杏組織培養(yǎng)研究Ⅰ.不同培養(yǎng)條件對(duì)銀杏愈傷組織形成的影響[J].西北植物學(xué)報(bào)，1994，14（6）：29-32.

[8] 郝崗平，杜希華，史仁玖，等.銀杏幼嫩莖段培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織及其細(xì)胞學(xué)研究[J].西北植物學(xué)報(bào)，2003，23（4）：648-652.

[9] 胡蕙露，楊景華，楊荻榮，等.銀杏莖段試管培養(yǎng)條件篩選研究[J].林業(yè)科學(xué)，2002，38（3）：52-56.

[10] 呂瑞芳，張曉紅.病原生物與免疫學(xué)基礎(chǔ)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2015：18-19.

[11] 陳華蕊，陳業(yè)淵，何書強(qiáng)，等.維多利亞菠蘿組培快繁技術(shù)研究[J].中國(guó)南方果樹，2016，45（6）：90-92.

[12] 王猛，李曉旭，張箏，等.馬蹄金（Dichondra repens Forst.）組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].分子植物育種，2020，18（10）：3331-3340.

[13] 余慧，丁彥芬，卓啟苗，等.歐洲衛(wèi)矛葉片愈傷組織誘導(dǎo)及培養(yǎng)[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，47（5）：19-24.

[14] 胡選萍，張曉娟，任鵬斌，等.不同激素對(duì)銀杏愈傷組織黃酮積累的影響[J].中成藥，2015，37（12）：2787-2790.