王雅婷 蘭麗珍

摘要 目的：研究葛根芩連湯治療糖尿病性骨質(zhì)疏松大鼠的效果及機(jī)制。方法：雌性SD大鼠60只，隨機(jī)均分為3組。對(duì)照組20只無處理，余40只腹腔注射鏈脲佐菌素35 mg/kg，建立大鼠糖尿病模型。葛根芩連湯組：按生藥量10 g/kg葛根芩連湯灌胃，模型組同法以0.9% NaCl灌胃，持續(xù)灌胃12周。行大鼠空腹胰島素水平（Fins）、空腹血糖（FBG）、胰島素敏感指數(shù)（ISI）及素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）檢測(cè)。RT-PCR、Western Blot檢測(cè)椎體BMP-2/Smad表達(dá)變化，進(jìn)一步行骨密度、骨鈣含量及生物力學(xué)性能測(cè)定及HE染色。結(jié)果：模型組素HOMA-IR，F(xiàn)BG水平較對(duì)照組均升高，F(xiàn)ins及ISI降低（P<0.05）。葛根芩連湯組大鼠HOMA-IR，F(xiàn)BG水平與模型組比較降低，F(xiàn)ins及ISI均升高（P<0.05）。模型組大鼠椎體BMP-2、Smad1、Smad4基因和蛋白的表達(dá)較對(duì)照組降低（P<0.05）。葛根芩連湯組大鼠椎體BMP-2、Smad1、Smad4基因和蛋白較模型組升高（P<0.05）。模型組大鼠骨密度、骨鈣含量、極限載荷、極限應(yīng)力和彈性模量較對(duì)照組降低（P<0.05）;葛根芩連湯組大鼠骨密度、骨鈣含量、極限載荷、極限應(yīng)力和彈性模量與模型組比較升高（P<0.05），HE染色示葛根芩連湯治療后大鼠骨質(zhì)疏松減輕。結(jié)論：葛根芩連湯在降低DOP大鼠血糖水平，減輕胰島素抵抗，通過調(diào)高BMP-2/Smad通路發(fā)揮治療大鼠DOP的作用。

關(guān)鍵詞 葛根芩連湯;糖尿病;空腹胰島素水平;空腹血糖;大鼠;骨質(zhì)疏松;通路;機(jī)制

Abstract Objective：To study the efficacy and mechanism of Gegen Qinlian Decoction（GQD）in the treatment of diabetic osteoporosis rats. Methods：A total of 60 female SD rats were randomly divided into 3 groups. The control group did not receive any treatment， and the remaining 40 were intraperitoneally injected with streptozotocin 35 mg/kg once to establish a rat model of diabetes. GQD group：According to the crude drug amount 10 g/kg， GQD was intragastrically administered to the rats. The model group was intragastrically administered with 0.9% NaCl for 12 weeks， and the rats， fasting insulin level（Fins）， fasting blood glucose（FBG），insulin sensitivity index（ISI）and hormone resistance index（HOMA-IR）were detected. RT-PCR and Western Blot were used to detect the expression of BMP-2/Smad pathway in vertebral body， and the bone mineral density， bone calcium content， biomechanical properties and HE staining were further determined. Results：Compared with the control group， the HOMA-IR， the FBG level in rats of model group increased， and the Fins and ISI decreased（P<0.05）.Compared with the model group， the HOMA-IR， the FBG level decreased， and the Fins and ISI were increased in the GQD group（P<0.05）.Compared with the control group， the expression of BMP-2，Smad1，Smad4 gene and protein expression in the vertebral body of the model group was significantly lower（P<0.05）.Compared with the model group， the expression of BMP-2，Smad1，Smad4 gene and protein expression in the vertebral body of the GQD group were significantly increased（P<0.05）.Compared with the control group， the bone mineral density， bone calcium content， ultimate load， ultimate stress and elastic modulus of the model group were significantly lower（P<0.05）.Compared with the model group， the bone mineral density， bone calcium content， ultimate load， ultimate stress and elastic modulus of the GQD group were significantly increased（P<0.05），HE staining showed that osteoporosis was alleviated in rats after treatment with Gegen Qinlian decoction. Conclusion：GQD can reduce the blood glucose level of diabetic osteoporosis rats and alleviate insulin resistance， and may play a role in the treatment of diabetic osteoporosis by increasing the BMP-2/Smad pathway.

Keywords Gegen Qilian decoction; Diabetes; Fins; FBG; Rat; Osteoporosis; Pathway; Mechanism

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.010

2型糖尿?。═ype 2 diabetes，T2DM）約占糖尿病總病例的90%，它引起多種并發(fā)癥，目前對(duì)于心血管和神經(jīng)、腎臟及外周血管的相關(guān)研究最多，但是其對(duì)機(jī)體的影響和破壞性不止如此，臨床和基礎(chǔ)研究表明2型糖尿病的內(nèi)分泌和代謝紊亂影響骨骼形成和代謝[1-2]，臨床表現(xiàn)為2型糖尿病患者常同時(shí)伴有骨質(zhì)疏松癥，如何對(duì)糖尿病骨質(zhì)疏松癥（Diabetic Osteoporosis，DOP）進(jìn)行有效的干預(yù)和治療為目前破待解決的問題，最好是對(duì)2型糖尿病及骨質(zhì)疏松具有治療效果且不良反應(yīng)小的藥物或方案[3-4]。傳統(tǒng)中藥方劑葛根芩連湯（Gegen Qinlian Decoction，GQD）對(duì)2型糖尿病有顯著的治療效果[5]，同時(shí)有研究顯示葛根對(duì)治療骨質(zhì)疏松亦有治療效果[6]，故本研究以糖尿病骨質(zhì)疏松癥（DOP）大鼠模型為研究對(duì)象，探討葛根芩連湯對(duì)DOP大鼠的療效和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康SD大鼠60只（康寶生物，山西），雌性，SPF級(jí)，8周齡，體質(zhì)量體質(zhì)量210～240 g，大鼠生產(chǎn)許可證號(hào)碼：SCXK（晉）2015-0003，飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)碼：SYXK（晉）2015-0004。濕度50～60%，溫度22～25 ℃，自然晝夜交替，自由飲水飲食。實(shí)驗(yàn)過程符合國家及本地相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的法規(guī)。

1.1.2 藥物 鏈脲佐菌素（美國Sigma公司，貨號(hào)：S0130），葛根、炙甘草、黃連、黃芩（由北京同仁堂太原分店提供）。

1.1.3 試劑與儀器 雙能X線骨密度儀（法國GK公司，型號(hào)：CHAILENGE），體質(zhì)量計(jì)（美國GE公司：型號(hào)：ZH6632）、BMP-2（批號(hào)：ab14933）、β-actin（批號(hào)：ab8245）、Smad1、Smad4（批號(hào)：ab202445）兔抗大鼠多克隆抗體、HRP山羊抗兔IgG（批號(hào)：ab6721）購于英國Abcam公司，由上海生工合成相關(guān)引物，Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天公司，批號(hào)P0006）、RT-PCR試劑盒（碧云天公司，批號(hào)：D7153），Trizol（北京嘉美紐諾生物科技公司，批號(hào)：tr118），Western blot電泳儀（美國BIO-RAD公司，型號(hào)：1645050-OG）。

1.2 方法

1.2.1 建立DOP大鼠模型及分組 經(jīng)1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，對(duì)照組不做任何處理，余40只，腹腔注射鏈脲佐菌素35 mg/kg 1次，建立大鼠糖尿病模型，監(jiān)測(cè)血糖2周，檢測(cè)血糖值和血清胰島素值，隨機(jī)血糖值≥16.7 mmol/L同時(shí)表現(xiàn)為對(duì)胰島素抵抗，符合2型糖尿病大鼠模型[7]。建模成功后分為模型組及葛根芩連湯組，20只/組。

1.2.2 給藥方法 按生藥量10 g/kg葛根芩連湯灌胃，模型組同法以0.9% NaCl灌胃，持續(xù)灌胃12周。葛根芩連湯按《傷寒論》步驟制備：取葛根250 g、黃芩150 g、黃連150 g、炙甘草100 g，用10倍質(zhì)量的水分別對(duì)各中藥20 min浸泡，先煎葛根，水沸后煎煮20 min，加入其余已侵泡的藥湯繼續(xù)煎至40 min，濾過后，殘?jiān)屑?倍量的水，煎煮30 min，把2次濾過的湯劑混合，調(diào)整全方生藥量2 g/mL，濃縮水煎液后備用。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1）空腹血糖、血清胰島素和HOMA-IR及ISI檢測(cè)：治療12周后，每組大鼠眼眶取血，電子血糖儀測(cè)量FBG，取大鼠主動(dòng)脈血，采用ELISA法，行各組大鼠血漿胰島素水平測(cè)定。按公式：FBG×Fins/22.5計(jì)算HOMA-IR。按公式：1/（FBG×Fins）計(jì)算ISI。2）測(cè)定骨密度及骨鈣含量：于治療后的12周，每組隨機(jī)選大鼠5只，以頸脫臼法處死，在無菌條件下將大鼠的左側(cè)股骨取出后，于股骨中點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記后，分別進(jìn)行右側(cè)股骨中點(diǎn)、近端及遠(yuǎn)端骨密度檢測(cè)。CHAILENGE骨密度儀測(cè)定并記錄結(jié)果。取右側(cè)股骨在支架上固定，手術(shù)刀將股骨上附著的組織剔除干凈后，通過原子吸收法對(duì)其骨鈣含量進(jìn)行測(cè)定。3）股骨生物力學(xué)檢測(cè)及HE染色：于治療后的12周，每組隨機(jī)選大鼠5只，以頸脫臼法處死，大鼠固定于支架上，取出大鼠股骨，將股骨上上附著的組織剔除干凈后，通過三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)對(duì)股骨進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)試，將股骨置于試驗(yàn)機(jī)上測(cè)試，跨距設(shè)置17 mm，加載速度2.0 mm/min，按結(jié)果描繪應(yīng)力-應(yīng)變曲線。10%的甲醛對(duì)股骨固定后，行組織切片;經(jīng)梯度酒精脫水，行石蠟包埋，行4～5 μm連續(xù)切片，脫蠟后，經(jīng)HE染色，行光學(xué)顯微鏡觀察。4）BMP-2、Smad1、Smad4基因表達(dá)檢測(cè)：將每組剩余大鼠予以頸脫臼處死，取椎體組織100 mg，液氮冷凍后研磨，Trizol法提取大鼠椎體組織總RNA，測(cè)定總RNA含量后，RT-PCR兩步法將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，BMP-2上游引物：5′-GGAC TGCGG TCTCCTAAA-3′，下游引物：5′-CA GCCTC AA CTCAAACTCG-3′，產(chǎn)物長度為191 bp;Smad1上游引物：5′-GCAGCACCTACCC TCAC-3′，下游引物：5′-AACCATCCACCAACACG-3′，產(chǎn)物長度為306 bp;Smad4上游引物：5′-CACT ATGAGCGGGTTGT-3′，下游引物：5′-TGTCCTTCCGTGGGTAA-3′，產(chǎn)物長度為137 bp;內(nèi)參β-actin上游引物：5′-CCACCATGTACCCAGGCATT-3′，下游引物：5′-AGGGTGTAAAACGCAGCTCA-3′，產(chǎn)物長度為253 bp。PCR反應(yīng)條件如下：于94 ℃條件下變性，1 min，于60 ℃溫度下退火，退火時(shí)長30 s，72 ℃延伸延伸1 min，共45個(gè)循環(huán)。5）BMP-2、Smad1、Smad4蛋白表達(dá)檢測(cè)：將提取后的剩余物按1 500 r/min，離心半徑8 cm，離心30 min后，取上清為粗體蛋白，BCA法行蛋白濃度測(cè)定。每組取樣品蛋白40 μg，10%的ADS-PAGE凝膠電泳（70 V，30 min;95 V，90 min），蛋白電泳分離，通過半干法將蛋白電轉(zhuǎn)于硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h;然后加入相應(yīng)一抗BMP-2、Smad1、Smad4鼠單抗（1∶500）、β-actin鼠單抗（1∶800）4 ℃孵育過夜。PBS將未結(jié)合的抗體洗去，加入二抗羊抗兔IgG（1∶800）孵育1 h，洗去未結(jié)合蛋白，經(jīng)ECL發(fā)光顯色后，照相后，Quantityone軟件行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較行單因素方差分析（One-way ANOVA）及q檢測(cè)，2組比較通過LSD-t法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組FBG、Fins、HOMA-IR及ISI水平 模型組素HOMA-IR，F(xiàn)BG水平較對(duì)照組均升高，F(xiàn)ins及ISI較對(duì)照組均降低（P<0.05）。葛根芩連湯組大鼠HOMA-IR，F(xiàn)BG水平與模型組比較均降低，F(xiàn)ins及ISI與模型組比較均升高（P<0.05）。見表1。

2.2 骨密度及骨鈣含量測(cè)定 12周后，模型組股骨BMD及骨鈣含量較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;葛根芩連湯組股骨的BMD和骨鈣含量較模型組顯著升高（P<0.05）。見表2。表明葛根芩連治療能夠有效地提高糖尿病骨質(zhì)疏松癥大鼠BMD和骨鈣含量，發(fā)揮治療作用。

2.3 生物力學(xué)性能的變化 12周后，三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)生物力學(xué)性能檢測(cè)模型組極限載荷、極限應(yīng)力和彈性模量明顯低于對(duì)照組（P<0.05），葛根芩連湯組的極限載荷和彈性模量比模型組有顯著增高（P<0.05）。見表3。

2.4 HE染色結(jié)果 在治療后的第12周后，模型組可見骨小梁出現(xiàn)斷裂，變稀疏，小梁排列紊亂，間隙擴(kuò)大。葛根芩連湯組骨小梁窄較之減輕，部分骨小梁較粗，骨小梁排列較之規(guī)則、間隙增小于模型組，對(duì)照組骨可見組織結(jié)構(gòu)完整，未見骨小梁斷裂，稀疏和排列紊亂。見圖1。

2.5 各組BMP-2/Smad基因表達(dá)影響 模型組大鼠椎體組織BMP-2、Smad1、Smad4基因表達(dá)較對(duì)照組顯著降低（P<0.05）。葛根芩連湯組大鼠椎體組織BMP-2、Smad1、Smad4基因表達(dá)較模型組顯著升高（P<0.05）。見圖2、圖3。

2.6 各組BMP-2/Smad蛋白表達(dá)影響 模型組大鼠椎體組織BMP-2、Smad1、Smad4蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著降低（P<0.05）。葛根芩連湯組大鼠椎體組織BMP-2、Smad1、Smad4蛋白表達(dá)較模型組顯著升高（P<0.05）。見圖4、圖5。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是糖尿病的一種常見并發(fā)癥，但在發(fā)生骨折前并沒有其他癥狀，DOP主要的發(fā)病機(jī)制是機(jī)體的骨重建失衡，包括破骨細(xì)胞數(shù)量增多導(dǎo)致的骨吸收加速和成骨細(xì)胞檢索導(dǎo)致的骨形成減少[8-9]。流行病學(xué)研究中，糖尿病患者表明骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險(xiǎn)與一般人群比較升高，與非糖尿病患者和血糖控制良好的糖尿病患者比較，血糖控制欠佳的糖尿病患者骨折風(fēng)險(xiǎn)增加了47%～62%[10]。然而，導(dǎo)致糖尿病骨質(zhì)疏松的潛在分子機(jī)制仍不清楚，如何有效的對(duì)DOP進(jìn)行治療是目前研究的熱點(diǎn)，目前多數(shù)研究關(guān)注點(diǎn)在中藥配方及其成分對(duì)骨質(zhì)疏松癥的影響[11]。

本研究我們探討葛根芩連湯對(duì)DOP大鼠的影響。古人多用葛根芩連湯治療濕熱所致的痢疾、腹瀉等?，F(xiàn)代基礎(chǔ)及臨床研究證實(shí)其對(duì)于各科疾病均有治療作用[12-13]。葛根芩連湯具有消渴作用，臨床研究證實(shí)其能降低糖尿病患者的血糖及血脂，對(duì)2型糖尿病有一定療效，基礎(chǔ)研究表明其哪個(gè)降低多種動(dòng)物模型的血糖[14]，同時(shí)大量研究顯示葛根及其提取物能夠?qū)琴|(zhì)疏松發(fā)揮治療作用，葛根的功能成份主要以葛根甙類化合物、異黃酮類化合物及三萜皂苷為主，異黃酮類化合物為天然性植物性雌激素，對(duì)骨質(zhì)疏松有治療作用，且具有著不良反應(yīng)低的特點(diǎn)。鐘偉權(quán)等研究表明葛根提取物能夠有效的提高骨密度，升高血清骨轉(zhuǎn)化指標(biāo)，能夠促進(jìn)老年骨質(zhì)疏松患者骨折愈合，具有較高的應(yīng)用價(jià)值[15-16]。

本研究將葛根芩連湯用于DOP大鼠治療，結(jié)果顯示，模型組素HOMA-IR，F(xiàn)BG水平較對(duì)照組均升高，F(xiàn)ins及ISI均降低。葛根芩連湯組大鼠HOMA-IR，F(xiàn)BG水平與模型組比較均降低，F(xiàn)ins及ISI均升高。這些結(jié)果均證明葛根芩連湯可對(duì)糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠具有降低血糖，減輕胰島素抵抗的治療作用，從根本上改善了大鼠機(jī)體內(nèi)環(huán)境，為緩解糖尿病骨質(zhì)疏松癥狀提供條件，進(jìn)一步研究表明在改善大鼠血糖及胰島素水平后，與模型組比較，葛根芩連湯組大鼠骨密度、骨鈣含量、極限載荷、極限應(yīng)力和彈性模量明顯升高。研究結(jié)果表明了大鼠骨質(zhì)疏松得以改善，骨密度及鈣含量升高，生物力學(xué)性能得以提高，分子生物學(xué)進(jìn)一步研究表明與模型組比較，葛根芩連湯組大鼠大鼠椎體組織BMP-2、Smad1、Smad4基因和蛋白的升高，HE染色示葛根芩連湯治療后大鼠骨質(zhì)疏松減輕。從此結(jié)果可以推斷，葛根芩連湯可能通過調(diào)控調(diào)高BMP-2/Smad通路，發(fā)揮對(duì)骨質(zhì)疏松的治療作用，為DOP治療提供新的思路。

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（2019-10-22收稿 責(zé)任編輯：王明）