張金勇 何暮春 項(xiàng)子龍 柳淑芳① 莊志猛

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院 無(wú)錫 214081；4. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 青島 266003；5. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

金烏賊(Sepia esculenta Hoyle, 1885)俗稱墨魚或?yàn)豸~，主要分布于中國(guó)沿海海域、日本北海道以南、朝鮮西南海域及菲律賓群島海域(Okutani, 1995)。金烏賊是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的優(yōu)良品種，曾是我國(guó)渤、黃海重要捕撈對(duì)象。然而，20 世紀(jì)80 年代以來(lái)，由于過(guò)度捕撈、棲息地破壞等原因，金烏賊資源急劇衰退(郝振林等, 2007)。金烏賊具有營(yíng)養(yǎng)豐富、生長(zhǎng)迅速、個(gè)體大(均重700 g)、生命周期短(約1 年)、世代更新快和洄游規(guī)律性強(qiáng)等特點(diǎn)，為保護(hù)和恢復(fù)金烏賊資源，我國(guó)學(xué)者在金烏賊基礎(chǔ)生物學(xué)、增養(yǎng)殖技術(shù)及種群遺傳學(xué)等方面開展了系列研究(鄭小東等,2002、2003; 趙厚鈞等, 2004; 郝振林等, 2008; 韓松等,2010; Zheng et al, 2007、2009)，并于2010 年突破了金烏賊人工繁育和增殖放流技術(shù)(佚名, 2010)。為更好地開展金烏賊繁育及增殖養(yǎng)護(hù)工作，有必要從分子層面精準(zhǔn)評(píng)估現(xiàn)有種群的種質(zhì)狀況和遺傳多樣性。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeat, SSR)分子標(biāo)記技術(shù)，也稱為微衛(wèi)星DNA 序列標(biāo)記，其串聯(lián)重復(fù)的核心序列為1～6 個(gè)核苷酸(Powell et al, 1996;Toth et al, 2000)。作為一種遺傳標(biāo)記，SSR 廣泛存在于原核和真核生物基因中，具有重復(fù)性好、共顯性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、多態(tài)性豐富等特點(diǎn)(Tuler et al, 2015)。按照SSR 的來(lái)源，可分為表達(dá)序列標(biāo)簽SSR (EST-SSR)和基因組SSR(g-SSR)。近年來(lái)，相對(duì)于傳統(tǒng)的ESTSSR 開發(fā)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序平臺(tái)開發(fā)SSR 標(biāo)記已在多種水產(chǎn)動(dòng)物中得到應(yīng)用。本研究在金烏賊Pacific Biosciences 單分子實(shí)時(shí)(Single-molecule real-time,SMRT)測(cè)序技術(shù)和Illumina RNA-Seq 技術(shù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得生物學(xué)數(shù)據(jù)信息的基礎(chǔ)上，利用Micro Satellite(MISA)軟件篩選SSR 位點(diǎn)并分析其分布及組成特征，以期為后續(xù)的金烏賊群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀QTL 定位和良種選育等研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物材料

實(shí)驗(yàn)用金烏賊于2017 年1 月～7 月取自青島金沙灘水產(chǎn)開發(fā)有限公司，挑選體形完整，無(wú)傷害的個(gè)體。分別從生長(zhǎng)(約6 月齡)、產(chǎn)卵(10～11 月齡)和產(chǎn)后瀕死(11～12 月齡)三個(gè)關(guān)鍵時(shí)期隨機(jī)選擇3 個(gè)雌性金烏賊親體。從選擇的雌性個(gè)體解剖腦亞腳葉/嗅葉、視腺、卵巢和纏卵腺組織樣品，浸沒在RNAlater(天根, 中國(guó))中，并于–80℃儲(chǔ)存。

1.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)源

提取金烏賊不同時(shí)期的腦亞腳葉/嗅葉、視腺、卵巢和纏卵腺組織樣本的總RNA，送天津諾禾致源生物信息科技有限公司，采用PacBio SMRT 測(cè)序技術(shù)和Illumina RNA-Seq 技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)整合PacBio SMRT 和Illumina 測(cè)序數(shù)據(jù)，生成高質(zhì)量的金烏賊轉(zhuǎn)錄組，包含177,951 條全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本(Zhang et al, 2019)，以此作為分析數(shù)據(jù)。

1.3 金烏賊EST-SSR 的篩選

為檢測(cè)金烏賊的SSR 位點(diǎn)，利用MISA(v1.0) (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)對(duì)其Unigene 序列進(jìn)行分析。SSR 位點(diǎn)包含了單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸以及六核苷酸重復(fù)。判斷的標(biāo)準(zhǔn)為單核苷酸重復(fù)至少12 次；二核苷酸重復(fù)至少6 次；三核苷酸重復(fù)至少5 次、四核苷酸重復(fù)至少5 次、五核苷酸重復(fù)至少4 次、六核苷酸重復(fù)至少4 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 金烏賊轉(zhuǎn)錄組SSR 位點(diǎn)數(shù)量與分布

金烏賊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得177,951 條全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，序列總長(zhǎng)度為198,175,926 bp。檢索Unigene 序列，共發(fā)現(xiàn)161,327 個(gè)SSR 位點(diǎn)，分布在64,933 條Unigene 中，發(fā)生頻率(含SSR 的Unigene 數(shù)與Unigene總數(shù)之比)為36.49%，出現(xiàn)頻率(SSR 數(shù)目與Unigene總數(shù)之比)為90.66%，平均每1,228 bp 含有1 個(gè)SSR位點(diǎn)。此外，有33,136 條Unigene 含超過(guò)1 個(gè)SSR位點(diǎn)，33,260 條Unigene 含有復(fù)合型SSR(表1)。

金烏賊EST-SSR 類型豐富，從表2 可以發(fā)現(xiàn)，單核苷酸到四核苷酸重復(fù)最多，占總SSR 位點(diǎn)數(shù)量的99.55%，其中，單核苷酸和二核苷酸所占的比例較大，分別占總數(shù)的46.00%和39.93%；其次為三核苷酸和四核苷酸，分別為9.48%和4.14%。五、六核苷酸重復(fù)率總計(jì)0.448%，數(shù)量很少。

2.2 金烏賊SSR 重復(fù)基元的序列組成

金烏賊SSR 中，單核苷酸重復(fù)以A/T 重復(fù)基序最多，占總SSR 的44.79%；二核苷酸重復(fù)以AT/AT和AC/GT 重復(fù)基序?yàn)橹饕愋停舱糞SR 總數(shù)的34.73%；三核苷酸重復(fù)則以AAT/ATT 和ATC/ATG出現(xiàn)頻率最高，共占 4.71%；四核苷酸重復(fù)則以AAAG/CTTT 居多，AGAT/ATCT 次之。其他五核苷酸和六核苷酸重復(fù)基元類型較多，數(shù)量非常少，出現(xiàn)頻率很低，見表3。

表2 金烏賊EST-SSR 不同重復(fù)基元分布情況Tab.2 Distribution of different repeat motifs in S. esculenta

表3 金烏賊EST-SSR 重復(fù)基元的類型Tab.3 Type of EST-SSR repeat motifs in S. esculenta

2.3 金烏賊轉(zhuǎn)錄組中的SSR 重復(fù)次數(shù)

重復(fù)片段的長(zhǎng)度會(huì)影響SSR多態(tài)性，而SSR重復(fù)次數(shù)可以決定重復(fù)片段的長(zhǎng)度。金烏賊SSR的堿基重復(fù)次數(shù)很廣泛，整體波動(dòng)在5～100次范圍內(nèi)，多集中于5～29次。單核苷酸重復(fù)12～102次；二核苷酸重復(fù)6～50次；三核苷酸重復(fù)5～24次；四核苷酸重復(fù)6～19次；五核苷酸重復(fù)6～19次；六核苷酸重復(fù)6～12次。重復(fù)12次的頻率最高，共有18,289條，占總SSR數(shù)的11.34%，其次是重復(fù)6次(10.98%)、13次(7.73%)、7次(6.82%)、14次(6.28%)，30次以上(含30)占3.40%。總體上，金烏賊轉(zhuǎn)錄組SSR的重復(fù)次數(shù)以11～20次最多，占總SSR比例為47.92%，4～10次次之，為35.03%；重復(fù)次數(shù)21～30次為14.24%；重復(fù)次數(shù)大于30次為2.80% (圖1)。

圖1 金烏賊轉(zhuǎn)錄組EST-SSR 不同重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)Fig.1 Repeat numbers of EST-SSR with different motifs in transcriptome of S. esculenta

2.4 金烏賊轉(zhuǎn)錄組SSR 的長(zhǎng)度

SSR位點(diǎn)中重復(fù)基元的長(zhǎng)度是影響其多態(tài)性高低的重要因素，當(dāng)SSR≥20 bp時(shí)，其多態(tài)性高；重復(fù)基元長(zhǎng)度12≤SSR＜20 bp時(shí)，多態(tài)性中等；而低于12 bp時(shí)，多態(tài)性極低。本研究中去除了12 bp以下的SSR，長(zhǎng)度≥12 bp的SSR共有161,327個(gè)。從金烏賊轉(zhuǎn)錄組中SSR基元長(zhǎng)度分布情況可以看出，其中，重復(fù)基元長(zhǎng)度在12～19 bp的SSR位點(diǎn)最多，共有95,323個(gè)，占SSR總數(shù)的59.09%；其次為20～30 bp，共有43,977個(gè)，占SSR總數(shù)的27.26%；長(zhǎng)度在31～40 bp的，共10,931個(gè)，占SSR總數(shù)的6.78%；長(zhǎng)度在41～ 50 bp的，共5,588個(gè)，占SSR總數(shù)的3.46%；基元長(zhǎng)度大于50 bp的數(shù)量最少，共5,508(3.41%)。根據(jù)該結(jié)果，可推測(cè)該研究中Ⅱ型SSR(長(zhǎng)度為12～20 bp)的SSR的比例為59.09%，具有中等多態(tài)性，有較高的潛在可用性。而具有高度多態(tài)性的I型SSR(長(zhǎng)度≥20 bp)中，含有低級(jí)基元(二、三核苷酸重復(fù))SSR位點(diǎn)數(shù)量占優(yōu)，這部分SSR位點(diǎn)具有豐富的多態(tài)性(圖2)。

圖2 金烏賊轉(zhuǎn)錄組SSR 位點(diǎn)重復(fù)基元序列長(zhǎng)度分布頻率Fig.2 Frequency of SSR repeat sequence length distribution in transcriptome of S. esculenta

3 討論

本研究以金烏賊轉(zhuǎn)錄組信息對(duì)其EST-SSR 進(jìn)行開發(fā)。結(jié)果顯示，金烏賊轉(zhuǎn)錄組中含有豐富的SSR位點(diǎn)。從金烏賊轉(zhuǎn)錄組的177,951 條Unigene 中，共搜索出161,327 個(gè)SSR，分布在64,933 條Unigene 中，SSR 的出現(xiàn)頻率為90.66%。與其他水生動(dòng)物SSR 的出現(xiàn)頻率相比，明顯高于扁玉螺(Neverita didyma)(86.53%) (盧瑋筱等, 2018)、黃姑魚(Nibea albiflora)(39.30%) (龔詩(shī)琦等, 2016)、翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)(27.51%) (袁文成等, 2015)、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii) (45.91%) (王傳聰?shù)? 2018)、無(wú)針烏賊(Sepiella japonica) (48.70%) (呂振明等, 2017; 管奧等,2018)、馬氏珠母貝(Pinctada martensii) (13.34%)(王忠良等, 2015)、櫛江珧(Atrina pectinata) (8.2%)(李東明等, 2017)、縊蟶(Sinonovacula constricta)(8.89%) (劉博等, 2012)、泥蚶(Tegillarca granosa)(14.83%) (周小龍等, 2013) (表5)。

SSR 檢索標(biāo)準(zhǔn)、數(shù)據(jù)庫(kù)豐富程度以及物種差異，都會(huì)影響SSR 的出現(xiàn)頻率(Varshney et al, 2005)。如張秀英等(2012)采用不同檢索條件從櫛孔扇貝BES文庫(kù)篩選SSR，表明SSR 出現(xiàn)頻率隨檢索標(biāo)準(zhǔn)的提高而降低。數(shù)據(jù)庫(kù)豐富程度也會(huì)影響EST-SSR 位點(diǎn)出現(xiàn)頻率，石耀華等(2008)和王忠良等(2015)先后從馬氏珠母貝6,979 和74,007 條EST 序列中篩選得到243 和9,872 個(gè)EST-SSR 位點(diǎn)，位點(diǎn)出現(xiàn)頻率分別為3.48%和13.34%。Franklin 等(2005)和王艷紅等(2011)對(duì)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)不同數(shù)量的EST序列進(jìn)行EST-SSR 篩選，其出現(xiàn)頻率分別為4.9%和7.8%。

表5 目前已獲得EST-SSRs 出現(xiàn)頻率的部分水生動(dòng)物Tab.5 Some aquatic animals that have obtained the frequency of EST-SSRs

大量研究表明，在已開發(fā)的EST-SSR 標(biāo)記中，二核苷酸和三核苷酸重復(fù)基元類型最為豐富。蝦夷扇貝和櫛江珧的EST-SSR 均以二核苷酸重復(fù)基元所占比例最高，分別占40.54%和77.08% (李云峰等, 2010;李東明等, 2017)；縊蟶SSR 以三核苷酸重復(fù)SSR 比例最高，為37.13% (劉博等, 2012)。本研究發(fā)現(xiàn)，金烏賊EST-SSR 重復(fù)類型中，以單核苷酸重復(fù)基元最多，比例達(dá)到46.00%，其次為二核苷酸，為39.93%。這和無(wú)針烏賊(呂振明等, 2017)、馬氏珠母貝(王忠良等, 2015)、羅氏沼蝦(王傳聰?shù)? 2018)和扁玉螺(盧瑋筱等, 2018)中單核苷酸重復(fù)基元是主導(dǎo)類型的研究結(jié)果相似。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，金烏賊轉(zhuǎn)錄組中，SSR位點(diǎn)最多的是單核苷酸的重復(fù)基元A/T，占總SSR 的44.79%；其次為二核苷酸的AT/AT 和AC/GT，共占SSR 總數(shù)的34.73%。此外，金烏賊轉(zhuǎn)錄組SSR 位點(diǎn)重復(fù)基元序列長(zhǎng)度在20 bp 以上的SSR 位點(diǎn)共有66,004 個(gè)，占SSR 總數(shù)的40.91%，并且其中含有低級(jí)基元(二、三核苷酸重復(fù)) SSR 位點(diǎn)數(shù)量占優(yōu)，這部分SSR 可能具有較高的利用價(jià)值。

4 結(jié)論

整體而言，金烏賊轉(zhuǎn)錄組SSR 出現(xiàn)頻率較高且類型豐富，共檢測(cè)出161,327 個(gè)SSR 位點(diǎn)，分布在64,933 條Unigene 中，SSR 位點(diǎn)發(fā)生頻率為36.49%，出現(xiàn)頻率高達(dá)90.66%。這些SSR 在提高物種遺傳多樣性潛能方面發(fā)揮著重要的作用。研究結(jié)果為下一階段開發(fā)金烏賊多態(tài)性SSR 分子標(biāo)記提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為開展金烏賊種質(zhì)資源保護(hù)利用、遺傳多樣性評(píng)價(jià)和未來(lái)分子標(biāo)記輔助育種等研究奠定基礎(chǔ)。