易 拓， 朱紅年， 孟 清

東華大學化學化工與生物工程學院，上海 201620

天然蛛絲具有獨特的力學性能，其機械性能可與鋼絲以及凱芙拉纖維媲美；同時還具有良好的生物相容性[1]，可作為生物材料應用于生物醫(yī)學領域，如制造血管支架[2]與人造皮膚支架[3]等。近年來還有研究發(fā)現(xiàn)蛛絲還蘊藏著優(yōu)異的光學特性[4]，是可以用來制作超級透鏡[4]的新材料。因此，蛛絲已成為天然高分子材料研究中的“熱點”。

圓網蜘蛛能分泌生產六種不同的蛛絲纖維和一種粘膠[5]，各自有著不同的用途。由于梨狀腺絲(pyriform silk)只是附著盤(attachment discs)的一個組份，而且很難將其從蜘蛛體內分離[6]，因此，相比于廣泛研究的拖絲(dragline)，目前鮮有關于天然梨狀腺絲的研究報道。附著盤的力學性能特點是具有極高的韌性(tougness)，韌性高達150.2～405.2 MJ/m3，但其楊氏模量僅為0.53～1.12 GPa[6]。目前為止，已經報道了A.argentata[7]與A.ventricosus[8]PySp1的全長編碼序列還有數(shù)種其他蜘蛛的PySp1的部分編碼序列[9]。A.ventricosusPySp1編碼序列長11 931 bp，編碼3 976個氨基酸。其一級結構包含兩端的C-terminal與N-terminal；中間的重復區(qū)段以及N-linker與C-linker，重復區(qū)氨基酸序列包含16個連續(xù)的重復單元[8]。除第16個非完全重復單元(177 aa)外，其余重復單元的氨基酸序列(213 aa)幾乎完全一致。A.argentataPySp1蛋白共有5 759個氨基酸殘基，其重復區(qū)由21個重復單元(234 aa)組成[7]。已報道的PySp1全長或部分序列分析顯示蛋白的重復區(qū)含有PXPX(X為Ala或者Arg)和QQ模塊[8]。有研究表明QQ模塊的功能可能參與梨狀腺絲蛋白在蜘蛛體內的自組裝或者聚集[10]，以及β-片層結構(β-Sheet)的形成[6]。PXPX模塊則被預測傾向形成無規(guī)則卷曲(random coil)[9]以賦予蛛絲彈性。

迄今，其余五種天然蛛絲的力學性能都已經被報道，但是尚無天然梨狀腺絲的力學性能數(shù)據。因此，研究重組梨狀腺絲的力學性能可以增進對天然梨狀腺絲的力學性能的了解?，F(xiàn)在普遍認為蛛絲的力學性能與蛛絲蛋白的重復區(qū)模塊有關[11，12]，所以在本研究中，以A.ventricosusPySp1的一個重復單元(213 aa)為基礎，通過無縫克隆技術獲得能夠表達含有2—3個相同重復單元的重組梨狀腺絲蛋白質粒，誘導表達純化獲得重組蛋白，使用濕法紡絲紡成連續(xù)的絲狀纖維。對制得的纖維進行力學性能測試、FTIR檢測以及熱重(TG)分析等進行表征。本實驗為后續(xù)重組梨狀腺絲的研究奠定了一定的理論基礎。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

本實驗所用重復單元DNA片段源自本實驗室篩選得到的A.ventricosusPySp1全長編碼DNA(GeneBank: MH376748)；實驗所用細菌菌株購自北京全式金生物技術有限公司；酶以及相關試劑購自Thermal Fisher Scientific公司(美國)；實驗相關試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；表達載體由本實驗室在商用載體pET-SUMO的基礎上進行改造；T載體Blunt-zero購自北京全式金生物技術有限公司；引物由生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 質粒的構建與鑒定

以A.ventricosusPySp1重復單元DNA序列為模板，設計2對特異性引物(表1)。DNA片段經BsaI 與Esp3 I酶切后產生的粘性末端可互補配對且不含有內切酶的識別序列，可以實現(xiàn)無縫連接。5′-GCT-3′為PySp1重復單元的第一個氨基酸Ala的密碼子；5′-GTA-3′為PySp1重復單元的最后一個氨基酸Val的密碼子。在PySp1重復單元序列的5′與3′分別引入Val密碼子、Ala密碼子，以實現(xiàn)多重復單元的無縫連接(表1)，兩種密碼子均簡記為3 bp。PCR產物編號及對應的引物如表2所示。PCR體系為50 μL：Q5 DNA polymerase 0.5 μL；正反向引物各2.5 μL；模板0.5 μL；5×Q5 Reaction Buffer 10 μL；2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，用ddH2O補齊至50 μL。反應條件：98 ℃，30 s預變性，98 ℃，10 s變性；60 ℃，30 s 退火；72 ℃，30 s延伸；72 ℃，120 s補平，4 ℃保存。最后對PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 引物序列

表2 PCR產物

BamHⅠ與Esp3Ⅰ酶切R-3bp；BsaⅠ與XhoⅠ酶切3bp-R；BsaⅠ與XhoⅠ酶切3bp-R-3bp；Blunt-zero、plx分別經BamHⅠ與XhoⅠ雙酶切。所有連接反應條件為T4 DNA ligase室溫連接1小時。熱擊轉化感受態(tài)細胞E.coliT1。所有重組片段經PCR產物回收試劑盒回收，質粒提取試劑盒提取質粒。

重組DNA片段2R的構建(圖1A)。連接R-3bp與3bp-R，得重組片段2R。Blunt-zero與2R連接得到Blunt-zero-2R，轉化E.coliT1。提取Blunt-zero-2R，經BamHⅠ與XhoⅠ酶切Blunt-zero-2R，回收2R。plx載體與2R連接獲得表達質粒plx-2R，轉化E.coliT1。篩選陽性克隆，過夜培養(yǎng)后再提取質粒并測序，4 ℃保存。

重組DNA片段3R的構建(圖1B)。連接R-3bp、3bp-R-3bp獲得重組片段2R-3bp。Blunt-zero與2R-3bp連接獲得Blunt-zero-2R-3bp。轉化E.coliT1并過夜培養(yǎng)。提取Blunt-zero-2R-3bp，BamHⅠ與XhoⅠ酶切Blunt-zero-2R-3bp，回收2R-3bp后用Esp3Ⅰ酶切，再與3bp-R連接獲得重組片段3R，最后與Blunt-zero連接獲得Blunt-zero-3R，轉化E.coliT1。過夜培養(yǎng)后提取質粒送測序。BamHⅠ與XhoⅠ酶切Blunt-zero-3R，回收3R后與plx相連獲得表達質粒plx-3R，轉化E.coliT1，過夜培養(yǎng)后提取質粒并測序。最后用BamHⅠ與XhoⅠ酶切鑒定過渡質粒Blunt-zero-2R、Blunt-zero3R與表達質粒plx-2R、plx-3R。

1.3 重組蛛絲蛋白2R與3R的誘導表達與純化

將測序正確的plx-2R、plx-3R質粒轉化E.coliBL21(DE3)后，涂布于含Amp(100 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，溫度為37 ℃。次日挑選單菌落接種至10 mL含Amp (100 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫搖床中200 r/min過夜培養(yǎng)。再以1∶100的比例將菌液接種到1 L含Amp(100 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8，加入IPTG使其終濃度為0.3 mmol/L。重組蛋白2R、3R的表達條件為25 ℃，20 h。

4 000 r/min，4 ℃收集誘導后菌液，離心15 min。每升菌體加入50 mL的lysis buffer(20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，pH 8.0)重懸。用高壓均質儀(JN-3000 plus，廣州聚能生物科技有限公司)120 MPa破碎菌體，重復三次。4 000 r/min，4 ℃離心裂解液15 min，棄上清，收集沉淀。向每升菌液的沉淀中加入50 mL的wash buffer (20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，2 mol/L尿素，pH 8.0)重懸，將重懸液置于冰水浴中進行超聲破碎(功率設定為250 W，工作5 s，間隔為8 s，重復30次，每個樣品超聲破碎1次)。4 ℃，4 000 r/min離心重懸液30 min，棄上清收集沉淀。往每升菌液的沉淀中加入50 mL dissolution buffer (20 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L尿素，pH 8.0)，置于室溫30 min。最后4 ℃、12 000 r/min離心溶液30 min，收集上清。用透析袋(分子截留量為14 000)連續(xù)透析72 h，每隔3 h換一次透析液，透析液為超純水。透析完成后取少量樣品進行15% SDS-PAGE電泳與考馬斯亮藍染色以檢測樣品純度與分子量。最后凍干蛋白。

1.4 濕法紡絲及力學性能測試

使用六氟異丙醇(HFIP)溶解凍干的蛋白粉，置于磁力攪拌器上20 r/min連續(xù)攪拌24 h制成紡絲液，其質量體積比為10%。在開始濕紡前，于30 ℃以10 000 r/min 轉速離心紡絲液30 min以去除不溶性雜質。用1 mL的注射器吸取500 μL的紡絲液，LSP01-3A微量注射泵[蘭格恒流泵有限公司(上海)]以恒定流速(0.6 mL/h)將紡絲液推入凝固浴中，凝固浴為25 ℃恒溫的100%甲醇。用鑷子將凝固浴內成型的蛛絲夾出，沿紡絲槽拉伸一段距離后再拉出液面并纏繞于線軸上，期間從低速向高速調整馬達轉速使絲纖維連續(xù)不斷地收集在線軸上，最終收集裝置的馬達轉速設定為49 r/min。所獲得的絲纖維置于通風櫥過夜去除殘余的化學試劑。

每種纖維制備50個樣品并固定在自制紙質框架上，用高倍率光學顯微鏡(萊卡)觀察纖維樣品，選取直徑分布均勻且表面光滑的樣品，每個樣品隨機選取三個部位測量平均直徑。用T150 universal納米拉伸儀(UTM, KLA-Tencor Inc., Oak Ridge, USA)進行拉伸測試，測試環(huán)境為25 ℃、相對濕度為45%。測試參數(shù)設定為拉伸速率10-2s-1。力學性能的楊氏模量、最大應力和應變與韌性由機器自帶的軟件Nanosuit計算。用OriginPro9.1繪制應力-應變曲線。蛛絲纖維的微觀形態(tài)與表面微觀結構由Phenom Pure desktop SEM(Phenom-world BV, Netherlands)檢測。

1.5 顯微紅外與熱重分析

使用FTIR-micro Nicoletn10MX spectrometer(Thermo Fisher Scientific有限公司)檢測纖維的二級結構[13]，測試過程中維持恒溫(20 ℃)干燥的環(huán)境。peakFit4.12軟件對酰胺Ⅰ帶(1 600 cm-1～1 700 cm-1)的紅外光譜求二階導，波峰擬合算法選擇GaussAmp，baseline correction算法選擇Initial,Final lin，多次擬合使殘差值最小(r2≥0.996)。分峰處理參數(shù)設定為1 628 cm-1(β-sheet)、1 646.5 cm-1(random coil)、1 659.5 cm-1(α-helix)、1 679.5 cm-1(β-turn)和1 695 cm-1(β-sheet)[14-18]。用Origin9.1對處理后的數(shù)據繪圖。確定各子峰與各二級結構對應的關系，并根據其積分面積計算出二級結構的百分比含量。

熱重分析儀(TG 209 F 1 Libra，NETZSCH)測試絲纖維的熱穩(wěn)定性。測試條件為：氮氣保護下，從25 ℃升溫至900 ℃，升溫速率為10 ℃/min，測試樣品質量為5 mg。記錄的數(shù)據以Excel格式導出，最后用origin 9.1繪制TG、DTG圖。

2 實驗結果

2.1 PCR產物的鑒定

使用表2中的引物組合擴增出三種PCR產物：3bp-R(667 bp)、3bp-R-3bp(676 bp)與R-3bp(667 bp)。1%瓊脂糖凝膠電泳結果(圖2)表明目的條帶大小與預期大小相一致。

泳道1: DNA marker,泳道2：R-3bp (667 bp), 泳道3：3bp-R-3bp(676 bp),泳道4：3bp-R (667 bp)圖2 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

2.2 過渡質粒與表達質粒的鑒定

所有成功構建的陽性克隆經雙酶切、1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果如圖3所示。3A與3B分別為過渡質粒Blunt-zero-2R、Blunt-zero-3R的鑒定圖；3C與3D分別為plx-2R、plx-3R的鑒定結果。將不經雙酶切處理的質粒設定為陰性對照，與經過雙酶切處理的質粒進行電泳鑒定。電泳結果表明重組片段2R、3R成功插入Blunt-zero與plx。測序結果經比對后，與原設計序列一致。

(A)Blunt-zero-2R雙酶切鑒定結果(B)與Blunt-zero-3R雙酶切鑒定結果(C)plx-2R雙酶切鑒定結果(D)plx-3R雙酶切鑒定結果 其中：泳道1: DNA marker、泳道2: 質粒未經雙酶切的陰性對照、泳道3: 質粒雙酶切后的混合產物圖3 質粒的雙酶切鑒定結果

2.3 重組蛛絲蛋白的表達與純化

重組蛋白2R與3R的理論分子量見表3。經過蛋白提純、凍干等步驟后，重組蛋白2R與3R的平均產量為70 mg/L和66 mg/L。15% SDS-PAGE檢測重組蛋白(圖4A和圖4B)。結果顯示重組蛋白2R的相對分子量稍大于45 000；3R的相對分子量接近66 200。這種目的蛋白表觀分子量比理論分子量偏大的現(xiàn)象并不鮮見，類似現(xiàn)象也出現(xiàn)在其他蛋白的SDS-PAGE結果中，如SUMO[19]、含正電荷氨基酸殘基的?；d體蛋白(ACP)[20]以及其他已報道的重組梨狀腺絲蛋白[21]。造成這種現(xiàn)象的可能原因是蛋白內的高脯氨酸含量以及SDS與蛋白的不充分結合[21]。在圖4中，誘導前(泳道2)與誘導后(泳道3)對比，表明兩種蛋白均在大腸桿菌中表達。上清(泳道4)與沉淀(泳道5)相比，表明兩種蛋白均存在于沉淀(包涵體)中，表明這兩種蛋白在大腸桿菌內的合成速度較快，以至于不能正確折疊[22]。因此用尿素變性純化法純化蛋白。

表3 重組蛛絲蛋白的分子量

2.4 纖維2R與3R的表征

重組蛋白2R與3R溶解于HFIP后可以濕紡成連續(xù)的絲狀纖維。高倍率光學顯微鏡觀察顯示纖維2R和3R的直徑分布較均勻，纖維2R表面有不規(guī)則凸起，3R的表面較光滑，兩者的平均直徑分別為11.5 μm、14.4 μm(圖5)。

(A) 2R；(B) 3R。其中：泳道1: protein marker; 泳道2: IPTG誘導前細胞裂解液; 泳道3: IPTG誘導后細胞裂解液; 泳道4:細胞裂解液離心后上清; 泳道5:細胞裂解液離心后沉淀; 泳道6: 純化后的目的蛋白圖4 重組蛋白的誘導表達與純化檢測結果

(A)與(B) 分別為SEM圖、光學顯微鏡圖圖5 絲纖維的光學顯微鏡與掃描電子顯微鏡觀察結果

UTM測試結果表明(圖6與表4)，纖維2R與3R都表現(xiàn)出與天然蜘蛛絲類似的應力-應變行為。它們在初始階段具備抗拉伸的彈性，隨著纖維不斷地被拉伸，超過屈服點后，纖維發(fā)生了塑性變形。纖維2R與3R都具有高延展性，最大斷裂應變分別為84%和139%，均高于天然拖絲(25%～35%[23])、次壺腹腺絲(5%)[24]、管狀腺絲(20%)[24]與葡狀腺絲(80%)[24]。與其他類型的重組梨狀腺絲纖維相比，纖維2R與3R具有更好的力學性能。比如，HPy2[21]為不含C-terminal、N-terminal的重組梨狀腺絲纖維，其包含兩個重復單元，共477個氨基酸殘基。纖維2R、3R與HPy2相比，這兩種纖維的楊氏模量與延展性均比HPy2的強(表4)。此外，纖維2R與3R同重組葡狀腺絲纖維相比也表現(xiàn)出了優(yōu)異的特點。W2[25]包含兩個AcSp1重復單元；W3[26]包含3個AcSp1重復單元。纖維2R與3R的楊氏模量與延展性均比W2、W3的高(表4)。這些力學能的差異一方面源自重組蛛絲蛋白結構的差異[27]，另一方面源自紡絲條件的不同[28]。

為了獲知纖維2R與3R的二級結構組成，因此采用FTIR分析重組纖維。測試結果表明(圖7與表5)，纖維2R與3R的二級結構組成基本一致。纖維2R與3R的無規(guī)則卷曲(random coil)含量分別為26.57%、25.0%，均高于天然AcSp的18%、 MaSp的12%[29]、與Flag的13%～15%[30]。這可能是因為PySp1蛋白內的(PX)nmotif傾向于形成無規(guī)則卷曲[9]。這兩種重組纖維的α-helix含量均與天然梨狀腺絲的相近[29]。

圖6 纖維2R(A)與3R(B)的應力-應變曲線匯總圖

表4 重組蛛絲纖維機械性能匯總表

圖7 纖維2R與3R的酰胺Ⅰ區(qū)FTIR測試分峰擬合示意圖

表5 纖維2R與3R的二級結構組成

2.5 纖維2R與3R的熱重分析

熱重分析(thermal gravity analysis，TGA)是一種分析材料熱行為(thermal behavior)的方法。不同的材料在不同的溫度范圍內表現(xiàn)出熱穩(wěn)定性，表現(xiàn)為質量不會改變、不發(fā)生氧化反應等[31]。一旦溫度超出這個范圍，材料的微觀結構會因高溫而崩潰。鑒于纖維2R與3R有較理想的機械性能，因此本實驗對其進行熱行為分析。TGA結果顯示，當溫度在200 ℃～340 ℃之間時，纖維2R、3R的質量大幅度減少，這與之前其他種類的重組蛛絲的熱穩(wěn)定性的研究一致[32]。在100 ℃之前，這兩種纖維的質量均降低約6%左右(圖8A)，推測是纖維中的水分或者六氟異丙醇由于高溫蒸發(fā)所致[33]。在100 ℃～200 ℃的區(qū)間內，纖維2R與3R的質量沒有明顯下降。當溫度為320 ℃時，此兩種纖維的熱重損失達到最大，即這一刻纖維降解的速度最快。當溫度高于200 ℃時，纖維2R與3R的質量開始持續(xù)下降，原因可能是維持纖維晶體區(qū)域的氫鍵網格在200 ℃時已被破壞[34]，進而開始熱分解(thermal decomposition)。以上結果表明纖維2R、3R的熱行為與多數(shù)聚合物的類似，能夠在≤200 ℃的溫度范圍內保持穩(wěn)定[32]。

(A)纖維2R與3R的TGA圖；(B)纖維2R與3R的DTG圖。圖8 纖維2R與3R的熱重分析圖

3 總結

本實驗以大腹圓蛛梨狀腺絲蛋白的一個重復單元為基礎，成功構建了表達質粒，表達純化獲得了重組蛛絲蛋白2R與3R，并使用濕紡方法獲得連續(xù)的絲狀纖維。這些重組絲纖維表現(xiàn)出良好的力學性能，并具有和天然蛛絲纖維相類似的二級結構和與一般聚合物類似的熱穩(wěn)定性。本課題拓展了對重組蛛絲纖維的研究，為后續(xù)有關重組A.ventricosusPySp1纖維的研究與應用提供了理論基礎。