汪濤　董鈺婷　李熳　唐勇　張浩琳

摘要 自人類腦科學研究計劃開始以來，中醫(yī)藥以其獨特的優(yōu)勢逐漸與腦科學研究緊密結(jié)合。在此期間涌現(xiàn)了大量新理念、新技術(shù)及新成果，極大地促進了中醫(yī)藥新技術(shù)的開發(fā)，加快了中醫(yī)藥現(xiàn)代化的步伐。但是諸多的研究手段都有一定的局限性，導致中醫(yī)藥腦科學研究的進一步發(fā)展非常有限。近年來，光遺傳學技術(shù)和化學遺傳學技術(shù)具有細胞類型特異性、高精度時空分辨率、神經(jīng)網(wǎng)絡功能性解剖特性，在神經(jīng)科學領(lǐng)域得到了廣泛運用，為臨床治療腦部疾病提供了一種新的策略。因此，本文主要闡述光遺傳學技術(shù)和化學遺傳學技術(shù)的原理、應用以及助力中醫(yī)藥腦科學研究的進一步發(fā)展。

關(guān)鍵詞 光遺傳學技術(shù);化學遺傳學技術(shù);中醫(yī)藥;針灸;腦疾病

Abstract Since the beginning of human brain science research program，traditional Chinese medicine （TCM） has been closely integrated with brain science research due to its unique advantages.During this period，a large number of new concepts，new technologies and new achievements have emerged，which has greatly promoted the development of new technologies in TCM and accelerated the process of modernization of TCM.However，the further development of TCM in brain science research is hindered due to the certain limitations of research methods.In recent years，optogenetics and chemogenetics have been widely used in the field of neuroscience and provide a new strategy for clinical treatments because of specific cell-type，high-precision spatio-temporal resolution，and functional anatomical characteristics of neural networks.Therefore，this paper reviews the mechanism and application of optogenetics technique and chemogenetics and technique，aiming to promote the further development of TCM in brain science research.

Keywords Optogenetics technique; Chemogenetics technique; Traditional Chinese medicine; Acupuncture and moxibustion; Brain disease

中圖分類號：R2-03文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.11.004

經(jīng)過兩千多年的發(fā)展，中醫(yī)藥因其獨特的優(yōu)勢在醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)中發(fā)揮著不可替代的作用。其治療手段較多（比如中草藥、針刺、艾灸及拔罐等），對多種疾病的療效顯著，而且不良反應較少。因此，對中醫(yī)藥的研究也成了廣大科研人員工作的熱點，特別是深入探討中醫(yī)藥在腦科學領(lǐng)域的重要作用及內(nèi)在機制，將有利于人類腦科學研究計劃的進一步發(fā)展，凸顯我國中醫(yī)藥事業(yè)在全球腦科學研究中的特色與優(yōu)勢，推動中醫(yī)藥走向世界。

傳統(tǒng)的中醫(yī)藥腦科學研究手段如腦部核團損毀、功能性磁共振成像、經(jīng)顱磁刺激及藥物處理等在中醫(yī)藥腦科學的機制的研究中有一定的局限性，損毀腦部核團會引起腦組織不可逆的破壞，功能性磁共振成像不能區(qū)別不同亞型的神經(jīng)細胞的生理功能，經(jīng)顱磁刺激會引起不同程度的外周神經(jīng)損害等，這些研究手段尚不能實時、動態(tài)地揭示中醫(yī)藥腦科學的機制。

光遺傳學技術(shù)和化學遺傳學技術(shù)是20世紀初新興的生物工程技術(shù)，兩者都可以精確地調(diào)控特定類型的神經(jīng)細胞的活動。其中，光遺傳學技術(shù)可以在毫秒級的時間尺度上調(diào)控靶細胞，化學遺傳學技術(shù)可以在1 min到1 h不等的時間尺度上調(diào)控靶細胞，二者互為補充，改變了研究神經(jīng)環(huán)路的傳統(tǒng)思維，可以揭示某種特定行為的中樞機制，為中醫(yī)藥腦科學研究提供了一種全新的研究手段。

1 光遺傳學技術(shù)和化學遺傳學技術(shù)簡介

1.1 光遺傳學技術(shù)簡介

光遺傳學是將基因遺傳學技術(shù)與光學技術(shù)結(jié)合起來的一種新型生物技術(shù)。早在20世紀70年代，Oesterhelt等[1]首次發(fā)現(xiàn)了微生物單成分光激活的離子泵細菌視紫紅質(zhì)，之后越來越多的微生物視蛋白被報道;2005年，斯坦福大學的Deisseroth等[2]在離體神經(jīng)元上轉(zhuǎn)染光敏蛋白，經(jīng)光照刺激后該神經(jīng)元活性可被精確調(diào)控;2006年，Deisseroth[3]將這一技術(shù)正式定義為“光遺傳學技術(shù)”。2011年，Nature Methods將光遺傳學技術(shù)譽為了21世紀神經(jīng)生物學中最具影響力的技術(shù)。

光遺傳學是利用細菌/綠藻視通道蛋白，使某一特定類型的神經(jīng)元被激活或抑制，從而特異性地調(diào)節(jié)這些神經(jīng)元的活動。這類對光敏感的蛋白根據(jù)不同的作用可以分為興奮性光敏感蛋白和抑制性光敏感蛋白。視紫紅質(zhì)2（Channelrhodopsin-2，ChR2）是目前最常用的興奮性光敏感蛋白，它能夠被藍光激活，陽離子內(nèi)流使細胞去極化，產(chǎn)生動作電位，提高細胞的興奮性[4];鹽細菌視紫紅質(zhì)（Natronomonas-pharaonishalorhodopsins，NpHRs）是一種常見的抑制性光敏感蛋白，在被黃光激活后氯離子泵入細胞，引起細胞膜超極化，從而抑制細胞的興奮[5]。見圖1。

光敏感蛋白在神經(jīng)細胞上成功表達后，通過不同強度的光照刺激即可特異性地操控神經(jīng)元的放電。光刺激既可以在毫秒級的時間尺度上精確控制光脈沖的寬度、頻率及潛伏期，又可以長時間操控神經(jīng)元。然后觀察光刺激后的動物行為并記錄信號，進行效應評估。近年來，光遺傳學技術(shù)還可以與雙光子[6]、膜片鉗等[7]技術(shù)結(jié)合，更加精確地解析環(huán)路結(jié)構(gòu)，為科研工作者提供更好的平臺;同時，新型光敏蛋白，新的光導入方法，光敏感蛋白靶向表達，轉(zhuǎn)基因動物品系的發(fā)展都為光遺傳提供更大的靈活性，為實驗研究提供更大的操作空間[8]。

1.2 化學遺傳學技術(shù)簡介

化學遺傳學是20世紀90年代開始興起的交叉學科，是利用遺傳學原理，通過生物活性小分子與蛋白相互作用來研究生物學系統(tǒng)功能的一種方法[9]。1998年，哈佛大學的Stuart Schreiber教授[10]發(fā)表名為《Chemical Genetics Resulting from a Passion for Synthetic Organic Chemistry》的綜述，把利用小分子活性化合物為探針、以多種方法影響靶蛋白的功能的方法定義為化學遺傳學。與經(jīng)典遺傳學類似，分為正向的化學遺傳和反向的化學遺傳，前者用動物細胞、微生物以及它們的裂解產(chǎn)物來尋找對生物過程產(chǎn)生影響的小分子，并確定相應的蛋白靶;后者則先高表達某種蛋白，尋找與蛋白結(jié)合或影響純蛋白功能的小分子，從而確定小分子在體內(nèi)對此蛋白的功能影響?；瘜W遺傳學具有高效、可逆、特異性地干擾靶標蛋白的功能，從而實現(xiàn)對生物學系統(tǒng)功能定量時空可控。

在神經(jīng)科學領(lǐng)域，2007年，Roth觀察組報道了基于人類毒蕈堿型乙酰膽堿受體改造的G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein Coupled Receptors，GPCRs）只能被特定的設計藥物激活，而不能被內(nèi)源性配體激活，這些受體被稱作DREADDs（Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs），即由特定藥物激活的受體。GPCRs是由800多個基因編碼的跨膜蛋白，主要分為Gq、Gi、Gs以及G12 4個家族，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)參與了多個生理過程，常用的化學遺傳受體為Gq與Gi。Gq主要通過偶聯(lián)人毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3，其激活導致細胞去極化，細胞興奮性增強，細胞放電增加;Gi主要通過偶聯(lián)人毒蕈堿型乙酰膽堿受體M4，其激活將導致細胞超極化，抑制細胞的放電活動[11]。見圖1。根據(jù)啟動子的不同類別，化學遺傳受體可以靶向不同種類的神經(jīng)元，如谷氨酸能、GABA能、膽堿能、多巴胺能等神經(jīng)元[12-13]，還可以調(diào)節(jié)膠質(zhì)細胞的電活動[14-15]。

通過病毒轉(zhuǎn)導（例如啟動子特異性相關(guān)病毒）、轉(zhuǎn)基因動物或者結(jié)合兩者將化學遺傳受體遞送至目標區(qū)域并表達，然后經(jīng)腹腔注射或者經(jīng)飲用水給予化學遺傳配體CNO（Clozapine N-oxide）即可激活受體[16]?；瘜W遺傳配體CNO一直以來被認為是一種惰性藥物[17-18]，只與化學遺傳受體DREADDs結(jié)合而不會與內(nèi)源性受體結(jié)合。腹腔注射1 mg/kg CNO 15 min后即可達到血漿濃度峰值并且持續(xù)2 h左右[19]，因此可以有效地長時程控制神經(jīng)元的活動。而近年來，有研究表明，CNO與DREADDs的親和率低，而CNO的代謝產(chǎn)物氯氮平與DREADDs卻有很高的結(jié)合率[20]。

2 光遺傳學技術(shù)和化學遺傳學技術(shù)在中醫(yī)藥腦科學研究中的應用

光遺傳學技術(shù)和化學遺傳學技術(shù)具有高度時間、空間特異性及細胞類型特異性等優(yōu)點，在腦科學領(lǐng)域的研究中發(fā)揮著重要作用。目前，這兩項技術(shù)在中醫(yī)藥腦科學的研究逐漸增多，并且取得了許多重要的進展，這些研究提示著光遺傳學技術(shù)和化學遺傳學技術(shù)在中醫(yī)藥腦科學研究中的運用是可行的，并且具有廣闊的運用前景。

2.1 藥物成癮

近年來，由于中醫(yī)藥在治療藥物成癮方面具有不良反應小、效果好及可防止復吸等優(yōu)勢[21]，其機制研究也得以迅速發(fā)展。先前的研究表明，在毒品成癮動物模型中，中腦邊緣的多巴胺釋放增加，針刺“神門”穴、“太沖”穴及“筑賓”穴等能夠緩解毒品誘導的成癮行為，減少伏隔核多巴胺的釋放[22-23]，逆轉(zhuǎn)毒品誘導的多巴胺能神經(jīng)元放電頻率降低[24]，提示針刺治療藥物成癮與中腦邊緣系統(tǒng)的多巴胺信號有關(guān)。2020年，Kim團隊運用光遺傳學技術(shù)具體地闡述了杏仁核的多巴胺信號系統(tǒng)在針刺治療冰毒成癮的具體作用[25]。該研究先將攜帶有eNpHR3.0的腺相關(guān)病毒表達在小鼠的杏仁核腦區(qū)，在針刺“神門”穴的同時使用黃光抑制杏仁核區(qū)的神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)針刺緩解成癮癥狀的作用被逆轉(zhuǎn)，停止黃光刺激后，針刺激活杏仁核的神經(jīng)元，抑制多巴胺的釋放，緩解冰毒誘導的成癮行為;隨后，研究者探究激活杏仁核區(qū)的神經(jīng)元的能否模擬出針刺的療效，于是將攜帶有ChR2的腺相關(guān)病毒注射到杏仁核相同部位，發(fā)現(xiàn)使用綠光激活神經(jīng)元后能模擬針刺的效應，即抑制了冰毒誘導的活動增強;另外，針刺能抑制成癮小鼠的伏隔核釋放多巴胺，而電損毀杏仁核后，針刺的該作用被逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明，杏仁核區(qū)的神經(jīng)元在針刺緩解成癮癥狀時發(fā)揮著重要的作用。

2.2 疼痛

針刺鎮(zhèn)痛是中醫(yī)治療疼痛的重要組成部分，針刺鎮(zhèn)痛的中樞神經(jīng)環(huán)路是該領(lǐng)域的主要研究方向。先前關(guān)于中樞神經(jīng)環(huán)路的研究大多是基于神經(jīng)電生理方法等開展的。和傳統(tǒng)電生理技術(shù)相比，光遺傳學技術(shù)和化學遺傳技術(shù)可以更直觀、精確地反映大腦不同類型的神經(jīng)元之間的相互作用。2019年，華中科技大學李熳團隊運用化學遺傳技術(shù)研究針刺鎮(zhèn)痛的中樞機制[26]。研究發(fā)現(xiàn)，在慢性坐骨神經(jīng)損傷模型和膝骨關(guān)節(jié)炎模型中，用化學遺傳學技術(shù)抑制小鼠腹外側(cè)中腦導水管灰質(zhì)（vlPAG）中的GABA能神經(jīng)元，模擬了電針“環(huán)跳”穴、“陽陵泉”穴的鎮(zhèn)痛作用，即都能減輕2種模型的機械痛閾值和熱痛閾值;隨后，他們又發(fā)現(xiàn)激活vlPAG中的GABA能神經(jīng)元只能部分減弱電針的鎮(zhèn)痛效應，同時激活vlPAG中的GABA能神經(jīng)元及抑制vlPAG中的谷氨酸能神經(jīng)元則可以有效地拮抗電針的鎮(zhèn)痛效應，該研究提示了vlPAG中的不同類型的神經(jīng)元在針刺鎮(zhèn)痛中的作用不同。

另外，光遺傳學技術(shù)在疼痛的研究中也取得了很大的進展。有研究表明，用光遺傳學技術(shù)特異性地激活臂旁核投射至中央杏仁核的興奮性通路，小鼠的痛敏感性顯著降低[27];在神經(jīng)病理痛模型中，用光遺傳學技術(shù)抑制脊髓投射至前扣帶皮層的谷氨酸能神經(jīng)元，能顯著抑制小鼠的機械痛閾值[28];Zhou等[29]運用光遺傳學技術(shù)證明前額葉皮層投射至伏隔核的興奮性通路參與慢性病理性疼痛的調(diào)節(jié)，通過在前額葉皮層的興奮性神經(jīng)元上表達NpHR，在光刺激時即可選擇性地抑制這些神經(jīng)元向伏隔核的投射，結(jié)果顯示大鼠的痛感覺加重。再結(jié)合目前針刺鎮(zhèn)痛的研究逐漸涉及到中樞層面[30-31]，以及局部核團損毀術(shù)不具有特異性，故何俏穎等[32]具體闡述了光遺傳學技術(shù)在針刺鎮(zhèn)痛的研究中的可行性及研究范式，并且主張將光遺傳學技術(shù)運用到針刺鎮(zhèn)痛的研究中，以推動針刺鎮(zhèn)痛的研究水平進入新的階段。

2.3 應用展望

除了在藥物成癮和疼痛方面的研究，光遺傳學技術(shù)和化學遺傳學技術(shù)在其他疾病模型中的應用也非常廣泛。例如，在癲癇的研究中，Krook等[33]發(fā)現(xiàn)，無論用NpHR抑制海馬興奮性神經(jīng)元或用ChR2激活GABA能神經(jīng)元，用光激活時都會迅速抑制顳葉癲癇的發(fā)作，而用化學遺傳學技術(shù)激活內(nèi)側(cè)隔-海馬之間的膽堿能回路也能減輕癲癇發(fā)作[34];在阿爾茲海默癥的研究中，Etter等[35]利用光遺傳學技術(shù)激活內(nèi)側(cè)隔小白蛋白神經(jīng)元，可以明顯改善阿爾茲海默癥模型小鼠的記憶功能，Cordella等[36]將興奮性DREADDs受體表達在阿爾茲海默癥模型小鼠的海馬中，利用CNO激活后發(fā)現(xiàn)小鼠的記憶和認知功能得到了很大的改善;另外，在抑郁癥的研究中也取得了很大的進展，Son等[37]證明，用光遺傳學技術(shù)選擇性激活前額葉皮質(zhì)（Prefrontal Cortex，PFC）中的谷氨酸能神經(jīng)元能顯著改善抑郁樣癥狀，而用化學遺傳學技術(shù)激活成年小鼠PFC中5-羥色胺（5-HT）陽性的神經(jīng)元，能緩解小鼠在出生早期暴露于5-HT再攝取抑制劑引起的抑郁癥狀[38]。這些研究表明，將光遺傳學技術(shù)和化學遺傳學技術(shù)應用于中醫(yī)藥腦科學研究的前景是十分客觀的。

目前，關(guān)于中藥、針灸作用的神經(jīng)環(huán)路和信號通路的研究成為了一大焦點。例如，王浩等人認為針刺調(diào)節(jié)胃功能可能與迷走背核復合體、藍斑、小腦頂核及下丘腦視旁核等有關(guān)，但是這些核團之間是否具有某種聯(lián)系尚不清楚，如果將光遺傳學技術(shù)和化學遺傳學技術(shù)運用于該神經(jīng)環(huán)路的研究中，將更有利于明確針刺在調(diào)節(jié)胃功能中的作用機制[39]。通過光遺傳學技術(shù)和化學遺傳學技術(shù)特異性地操控神經(jīng)環(huán)路，再檢測實驗動物的行為學變化，可以更加直觀地反應大腦不同核團、不同神經(jīng)元群體及不同的環(huán)路在中藥、針刺信號中的作用，使中醫(yī)藥腦科學研究進入一個新的高度。見圖2。

近年來，有學者開始運用光遺傳技術(shù)和化學遺傳技術(shù)進行中醫(yī)藥腦科學研究并且逐漸與神經(jīng)電生理技術(shù)、系統(tǒng)生物學技術(shù)等多種研究方法的聯(lián)合運用[6-7]，在更深入地揭示中醫(yī)藥的腦科學理論機制的同時，與應用研究緊密相連，探析腦內(nèi)小分子化合物、神經(jīng)元及其生物學效應，揭示了生命的基本活動規(guī)律，為候選藥物和治療儀器的開發(fā)提供了科學的依據(jù)。

3 小結(jié)

光遺傳學技術(shù)在神經(jīng)細胞中表達光敏感蛋白，通過光刺激來激活光敏感蛋白，可以在毫秒級的時間尺度上特異性地操控靶細胞;化學遺傳學技術(shù)在神經(jīng)細胞中表達改造后的G-蛋白偶聯(lián)受體，通過腹腔注射或飲用水給予外源性配體來激活G蛋白偶聯(lián)受體，可以長時間調(diào)控靶細胞的放電活動。目前，這兩項技術(shù)在針灸治療藥物成癮及電針鎮(zhèn)痛等方面已經(jīng)取得了重要的進展。比如，針刺通過激活杏仁核的神經(jīng)元，抑制多巴胺的釋放，從而緩解冰毒誘導的成癮行為;中腦導水管灰質(zhì)的GABA能神經(jīng)元和谷氨酸能神經(jīng)元在針刺鎮(zhèn)痛中扮演著重要的角色。這些研究在清醒的動物實驗中將神經(jīng)細胞與針刺效應聯(lián)系起來，開闊了傳統(tǒng)中醫(yī)藥腦科學研究的思路，為光遺傳學技術(shù)和化學遺傳學技術(shù)在中醫(yī)藥腦科學研究的應用奠定了基礎(chǔ)。

4 討論

傳統(tǒng)的中醫(yī)藥腦科學研究常運用藥理學、分子生物學及蛋白組學等技術(shù)，雖取得了一定的進展，但是無法實現(xiàn)在活體動物內(nèi)進行研究，不能對神經(jīng)細胞進行實時動態(tài)的調(diào)控，不能精確直觀地揭示中醫(yī)藥信號在中樞的傳遞過程。光遺傳學技術(shù)和化學遺傳學技術(shù)的出現(xiàn)扭轉(zhuǎn)了這一局面，通過這兩項技術(shù)可以觀察中醫(yī)藥干預在活體動物內(nèi)對細胞信號的調(diào)控，實現(xiàn)對神經(jīng)環(huán)路的“開關(guān)”;通過比較“開關(guān)”前后的行為學變化，明確中醫(yī)藥的中樞機制;光刺激或配體激活都有可逆性，對神經(jīng)環(huán)路的“開關(guān)”操作具有可重復操作的特點，使實驗結(jié)果可雙向驗證，進而提高實驗數(shù)據(jù)的科學性、精確性和穩(wěn)定性。另外，光遺傳學技術(shù)和化學遺傳學技術(shù)與神經(jīng)電生理、有機合成技術(shù)的聯(lián)合應用，可以更精確地將行為學與神經(jīng)細胞的電活動聯(lián)系起來，更深入地解析神經(jīng)環(huán)路的功能。因此，光遺傳學技術(shù)和化學遺傳學技術(shù)在中醫(yī)藥腦科學研究中具有無可替代的優(yōu)勢與前景。

但是，這兩項技術(shù)在使用過程中也存在以下問題，例如：光遺傳學技術(shù)中使用的視蛋白和化學遺傳學技術(shù)中使用的改造后的GPCRs都是外源性蛋白，在沒有激光刺激或配體激活的情況下仍具有一定的生物活性及細胞毒性[40-41];光遺傳學技術(shù)在使用激光刺激組織時會產(chǎn)生熱量，對細胞造成影響[42];化學遺傳學技術(shù)在使用配體去激活GPCRs時，配體的代謝產(chǎn)物會產(chǎn)生不同的不良反應[43-44]。針對這些問題，研究者會在實驗過程中設置熒光標記組來觀察手術(shù)及外源性蛋白對實驗結(jié)果是否有影響，縮短光照刺激的時間以減少熱量的產(chǎn)生，盡可能地使用小劑量的化學遺傳配體以減少不良反應的產(chǎn)生。明確這兩項技術(shù)存在的問題及相關(guān)的解決方案，將更有利于這兩項技術(shù)在中醫(yī)藥腦科學研究中的應用。

綜上所述，中醫(yī)藥治療腦部疾病具有良好的臨床療效，但是傳統(tǒng)的研究手段尚不能在活體動物模型中精確、直觀地揭示其內(nèi)在的機制;光遺傳學技術(shù)和化學遺傳學技術(shù)在神經(jīng)科學領(lǐng)域具有靶向性、高時空精確性和可重復操作等優(yōu)勢，為中醫(yī)藥腦科學研究提供了一種新的思路，為今后的研究提供借鑒，從而推動中醫(yī)藥腦科學研究的進一步發(fā)展。

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（2020-05-10收稿 責任編輯：徐穎）