沙晶 楊麗娟 瑪依努爾·買買提 李紅燕

視神經脊髓炎譜系疾?。∟MOSDs）是一類主要由B 淋巴細胞（B 細胞）和抗體介導的中樞神經系統(tǒng)自身免疫性疾病［1］，表現為視神經和脊髓炎性脫髓鞘改變，以視神經和脊髓同時或相繼受累為主要臨床特征，呈復發(fā)-緩解病程，在反復發(fā)作后可遺留嚴重的神經功能缺損。多發(fā)性硬化亦是一類主要由細胞免疫介導的中樞神經系統(tǒng)自身免疫性疾病，主要表現為白質脫髓鞘改變［2］，因此NMOSDs 最初被認為是多發(fā)性硬化（MS）的一種亞型［3］。然而，自2004 年Lennon 等［4］首次確認 水 通道蛋白4（AQP4）抗體是NMOSDs 的特異性抗體以來，越來越多的學者意識到NMOSDs 的免疫學機制可能與多發(fā)性硬化并不一致。研究表明，淋巴細胞參與NMOSDs 發(fā)病與疾病演變的全過程，疾病早期T 淋巴細胞（T 細胞）浸潤靶器官和組織，隨著病情進展至中晚期B 細胞介入并產生相應抗體，誘導免疫炎癥反應。CD4-CD8-雙陰性T 淋巴細胞（DNT）僅占外周血T 細胞的1%～2%［5］，主要由T 細胞受體αβ和γδ（TCRαβ和TCRγδ）等亞群組成，源自CD4+T 細胞和CD8+T 細胞或特殊細胞譜系［6］，可能參與不同自身免疫性疾病的發(fā)病機制［7］，迄今尚無有關DNT 在NMOSDs 和多發(fā)性硬化兩種疾病中表達差異的研究報道。鑒于此，本研究對新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院近3 年診斷與治療的53 例NMOSDs 和20 例多發(fā)性硬化患者的臨床資料進行回顧分析，通過分析CD4-CD8-DNT 細胞數目，探討CD4-CD8-DNT 在兩種疾病中的表達差異。

對象與方法

一、研究對象

1. 納入與排除標準 （1）NMOSDs 診斷符合2015 年《NMOSDs 國際共識診斷標準》［8］，多發(fā)性硬化符合2017 年McDonald 診斷標準［9］。（2）患者入院至采集血液標本時間<24 h，且在采集腦脊液和血液樣本之前均未曾接受過皮質類固醇激素、免疫球蛋白或其他免疫抑制劑治療。（3）所有入組患者性別、年齡、誘因、臨床癥狀和基線數據等臨床資料完整。（4）新發(fā)神經功能缺損癥狀持續(xù)時間≥24 h，且距前次發(fā)作≥30 d［10］。（5）凡存在以下情況者均非本研究納入對象：同時合并結締組織病和（或）其他自身免疫性疾病、腫瘤、感染、獲得性免疫缺陷綜合征及其他傳染性疾病，以及臨床和實驗室數據不完整者。

2.一般資料 選擇2017 年1 月至2019 年12 月在我院神經內科住院治療的53 例NMOSDs 和20 例多發(fā)性硬化急性期患者。（1）NMOSDs 組：53 例，男性19 例，女性34 例；發(fā)病年齡16 ～66 歲，平均（36.72±17.04）歲；病 程 為1 ～8 年，中 位 病 程1.50（1.00，4.00）年。（2）MS 組：20 例，男性4 例，女性16 例；發(fā)病年齡為25 ～42 歲，平均（33.18±5.46）歲；病程為1 ～14 年，中位病程7.00（1.50，11.00）年。（3）正常對照組：選擇同期在我院進行體格檢查的健康志愿者共27 例，男性13 例，女性14 例；年齡18 ～45 歲，平均（35.25±15.05）歲。3 組受試者性別（χ2=3.952，P=0.139）和年齡（F=5.799，P=0.571）差異無統(tǒng)計學意義，NMOSDs 組與MS 組患者病程差異亦無統(tǒng)計學意義（Z=21.000，P=0.081），具有可比性。

二、研究方法

1.常規(guī)實驗室指標檢測 患者入院24 h 內采集外周靜脈血3 ～5 ml，排除腰椎穿刺禁忌證后留取腦脊液3 ～5 ml，儀器分析法測定紅細胞計數［（4.00 ～5.50）×1012/L］、白細胞計數［（3.50 ～9.50）×109/L］、中性粒細胞計數［（1.80 ～6.30）×109/L］；免疫層析法測定C-反應蛋白（0 ～8 mg/L）；酶耦聯法測定丙氨酸轉氨酶（7 ～45 U/L）、天冬氨酸轉氨酶（13 ～40 U/L）；反應速率法測定血尿素氮（2.50 ～7.50 mmol/L）、肌酐（41 ～73 μmol/L）；免疫比濁法測定補體C3（0.80 ～1.20 g/L）、C4（0.10 ～0.40 g/L），間接免疫熒光法測定抗核抗體、抗雙鏈DNA 抗體；蛋白定量分析法測定血清和腦脊液寡克隆區(qū)帶（OCB），細胞免疫熒光法（CBA）測定血清和腦脊液髓鞘少突膠質細胞糖蛋白（MOG）抗體、髓鞘堿性蛋白（MBP）抗體以及AQP4抗體。

2.流式細胞術測定DNT 細胞數目 （1）主要試劑與儀器：免疫試劑Ⅰ抗工作液［含多甲藻黃素葉綠素蛋白（PerCP）標記的小鼠抗人CD3 單克隆抗體（CD3-PerCP）、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的小鼠抗人CD4 單克隆抗體（CD4-FITC）和藻紅蛋白（PE）標記的小鼠抗人CD8 單克隆抗體（CD8-PE）］，溶血素均購自美國BD 公司。BY-80C 型離心機由北京白洋醫(yī)療器械有限公司提供，FACS Canto Plus 流式細胞儀為美國BD 公司產品。（2）檢測方法：將采集的外周靜脈血標本置于含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的EP 管，6 h 內分別滴加CD3-PerCP（20 μl）、CD4-FITC（20 μl）和CD8-PE（20 μl），混勻、室溫避光孵育15 min，加入溶血素（2 ml）10 min 后于離心半徑5 cm、轉速1500 r/min 離心5 min，去上清液，磷酸鹽緩沖液2 ml 洗滌，再于離心半徑5 cm、轉速1500 r/min 離心5 min，去上清液、加入磷酸鹽緩沖液（500 μl）重懸細胞，流式細胞術測定CD4-CD8-DNT細胞數目，FlowJo v10.0 軟件進行數據分析。

3.神經功能缺損程度評價 入院后24 h 采用擴展殘疾狀態(tài)量表（EDSS）［11］進行殘疾程度評價，包括視覺功能（6 分）、腦干功能（5 分）、錐體功能（6 分）、小腦功能（5 分）、感覺功能（6 分）、膀胱和直腸功能（6 分）、大腦功能（5 分）及行動（6.50 分）共8 項內容，每項評分經轉化后計為總評分，總評分10 分，評分越高、殘疾程度越嚴重。

4. 統(tǒng)計分析方法 本研究采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數據處理與分析。計數資料以相對數構成比（%）或率（%）表示，采用χ2檢驗。呈正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用兩獨立樣本的t檢驗或單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；呈非正態(tài)分布的計量資料以中位數和四分位數間距［M（P25，P75）］表示，行Mann-WhitneyU檢驗或Kruskal-Wallis 檢驗（H檢驗），兩兩比較行Mann-WhitneyU檢驗。以P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

表1 各組受試者常規(guī)實驗室指標的比較Table 1. Comparison of the laboratory indicators of the 3 groups

結 果

對各組受試者實驗室指標比較，血清C-反應蛋白差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.033）,其中NMOSDs 組高于正常對照組（Z=1.456，P=0.029），但與多發(fā)性硬化組之間差異無統(tǒng)計學意義（Z= 0.312，P=1.000）；多發(fā)性硬化組血清寡克隆區(qū)帶陽性率高于NMOSDs 組（P=0.000）；NMOSDs 組血清AQP4 抗體陽性率高于多發(fā)性硬化組（P=0.000）；其余各項指標組間差異無統(tǒng)計學意義（均P> 0.05，表1）。NMOSDs 組EDSS 評分為1 ～8 分、中位評分2.50（2.00，6.50）分，多發(fā)性硬化組EDSS 評分2 ～6 分、中位評分4.50（2.75，5.25）分，組間差異有統(tǒng)計學意義（Z=45.000，P=0.700）。

各組受試者外周血DNT 細胞數目差異有統(tǒng)計學意義（P=0.015），其中NMOSDs 組DNT 細胞數目分別高于正常對照組（P= 0.018）和MS 組（P=0.023），而MS 組與正常對照組DNT 細胞數目差異無統(tǒng)計學意義（P=0.881；表2，3）。

討 論

AQP4 抗體的發(fā)現讓人們逐漸認識到，由B 細胞介導的體液免疫在NMOSDs 的發(fā)病機制中發(fā)揮至關重要的作用［11］，但是目前針對外周血B 細胞的治療藥物如利妥昔單抗等尚無法完全阻止NMOSDs 的進展［12］，表明B 細胞介導的體液免疫并非唯一致病因素，T 細胞介導的細胞免疫或其他免疫因素也參與其中且發(fā)揮重要作用。本研究結果顯示，NMOSDs患者外周血DNT 細胞數目高于正常對照者和多發(fā)性硬化患者，據此推測外周血DNT 細胞數目增加可能提示NMOSDs 處于疾病的急性期。

表2 各組受試者外周血DNT 細胞數目的比較（x±s，×106/L）Table 2. Comparison of the number of DNT cells in NMOSDs group, MS group and control group (x±s, ×106/L)

表3 各組受試者外周血DNT 細胞數目的兩兩比較Table 3. Pairewise comparison of the number of DNT cells in NMOSDs group, MS group and control group

目前，對于DNT 細胞的起源及其在免疫機制中的作用尚未完全闡明。DNT 細胞因表面分子不同而表達多樣，可分泌大量細胞因子，提示其不同來源或分化途徑［13］。有文獻報道，外周血DNT 細胞主要來源于胸腺和脾［14］，較少來源于不依賴胸腺的途徑，如活化的外周血CD4+和（或）CD8+T 細胞［15］。Priatel 等［16］研究顯示，T 細胞受體（TCR）信號強度是DNT 細胞發(fā)育的重要因素，較低強度的TCR 信號可誘導生成成熟的CD4+和（或）CD8+T 細胞，而較高強度的TCR 信號則對胸腺DNT 細胞的存活或逃逸具有促進作用。正常人外周血中亦可以檢出DNT 細胞，通常少于總淋巴細胞的2.5%［13］，但是這一小部分DNT 細胞具有同源異質性，分別表達TCRγδ和TCRαβ［13，17］。目前對于DNT 細胞的病理生理學機制尚不完全清楚，有證據顯示其可以識別寄生蟲、細菌（尤其是分枝桿菌）或應激的哺乳動物細胞表達的應激蛋白和熱休克蛋白（HSP）［6］。2019 年來自德國的一項研究顯示，DNT 很可能通過作用于T 細胞的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）以影響其代謝和功能［18］。因此，DNT 細胞可能通過識別自身應激反應所誘導的分子在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用［19］。

在本研究中，NMOSDs 急性期患者外周血DNT細胞數目增加，而多發(fā)性硬化患者則無明顯改變，提示DNT 細胞可能參與NMOSDs 的發(fā)病機制。臨床上NMOSDs 患者表現出的更高的復發(fā)率和更快的疾病進展速度，亦不能完全排除與DNT 細胞相關。目前，國內外尚無關于DNT 細胞在NMOSDs 中表達變化的研究，但有些學者已經開始關注DNT 細胞在自身免疫性疾病中的作用機制。Reinhardt 和Melms［20］在重癥肌無力（MG）患者的外周血中檢測到DNT 細胞，并發(fā)現切除胸腺瘤后DNT 細胞數目可隨乙酰膽堿受體（AChR）抗體滴度的下降和臨床癥狀的好轉而逐漸恢復正常，高度提示DNT 細胞參與免疫調節(jié)機制。Crispín 和Tsokos［21］發(fā)現，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血DNT 細胞數目顯著增加，同時可促進白細胞介素-17（IL-17）的分泌。而最新研究顯示，系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病后紊亂的細胞因子和凋亡碎片可以導致CD8 細胞向DNT 細胞轉變，同時促進IL-17 的生成［22］。一項針對自身免疫性淋巴細胞增生綜合征（ALPS）的研究顯示，外周血DNT 細胞比例從1%增至40%［17］。上述研究均表明，DNT 細胞具有通過調節(jié)免疫和炎癥穩(wěn)態(tài)的多種功能在系統(tǒng)性自身免疫性疾病的發(fā)病中發(fā)揮作用。然而，DNT 細胞在中樞神經系統(tǒng)的作用仍未知。Matsumoto 等［23］于1996 年最早描述了自身免疫性腦脊髓膜炎動物模型DNT 細胞的特點，提出蛛網膜下腔DNT 細胞是脊髓病變的T 細胞前體，并在T 細胞浸潤中樞神經系統(tǒng)實質的過程中發(fā)生表型轉換。此后，關于DNT細胞在神經系統(tǒng)疾病中的描述較少。2019 年，南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院徐運教授團隊的研究顯示，腦卒中患者腦組織和外周血DNT 細胞數目顯著增加，浸潤的DNT 細胞通過調節(jié)FasL/PTPN2/腫瘤壞死因子-α（TNF-α）信號轉導通路以增強腦組織免疫炎癥反應，進而加重缺血性腦損傷［24］。Gagliani等［25］在神經炎癥的再溶解過程中發(fā)現，某些獨特的T 細胞亞群如輔助性T 細胞17（Th17）可在腦組織中轉變?yōu)榱硪籘 細胞亞群——調節(jié)性T 細胞（Treg），但并不知曉缺血性卒中期間是否可從其他T 細胞亞群轉變?yōu)镈NT 細胞。此外，在中樞神經系統(tǒng)炎癥中表達上調的諸如自身抗原的刺激物也可以導致T 細胞原位增殖和擴增［26］，這也可能是DNT 細胞在缺血性卒中增多的原因之一。在一些疾病中，DNT 細胞可在周圍神經系統(tǒng)生成TNF-α，進一步加劇炎癥反應，促進疾病進展［26］。DNT 細胞參與免疫炎癥反應的機制還可能與其分泌炎性因子IL-17 有關［22］。本研究未進一步探討TCR 信號和細胞因子與DNT 細胞間的關系，推測TCR 信號和部分細胞因子表達變化可能引起NMOSDs 患者DNT 細胞數目變化，尚待今后擴大樣本量進一步深入研究。

綜上所述，NMOSDs 患者外周血DNT 細胞數目顯著增加，可能與免疫功能紊亂有關。進一步研究NMOSDs 患者外周血DNT 細胞生物表型和功能特征將對了解其發(fā)病機制，以及探索免疫治療潛在靶標和途徑具有重要意義。