邢體坤 王 斌 郭冰峰 宋路萍 楊振蘋(píng) 荊新蕊 郝一楠 張靜靜▲

1.華蘭生物工程股份有限公司研發(fā)中心，河南新鄉(xiāng) 453003；2.華蘭基因工程有限公司質(zhì)量控制部，河南新鄉(xiāng) 453000；3.華蘭生物工程股份有限公司血制研發(fā)部，河南新鄉(xiāng) 453003

DNA克隆技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究中應(yīng)用廣泛[1]。傳統(tǒng)酶切連方法耗時(shí)長(zhǎng)、耗費(fèi)高、效率低，不能滿足目前分子生物學(xué)發(fā)展需求[2-3]。為提高克隆技術(shù)連接效率，近年來(lái)開(kāi)發(fā)出多種新方法[4-6]。其中，無(wú)縫克隆是新技術(shù)中的典型代表[7]，位點(diǎn)選擇靈活、連接產(chǎn)物無(wú)冗余序列、連接效率高且簡(jiǎn)單快捷，受到廣大研究者的青睞[8-17]。本研究對(duì)比三個(gè)廠家試劑盒價(jià)格、總克隆數(shù)和陽(yáng)性克隆率，表明生工生物工程（上海）股份有限公司的無(wú)縫克隆試劑盒為最佳選擇。

1 材料與方法

1.1 供試品

pUC57-HNB2M11由金斯瑞生物科技有限公司合成，DH5a感受態(tài)購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，pET-26b載體由華蘭生物工程股份有限公司保存。

1.2 材料

蛋白胨購(gòu)自O(shè)XOID，酵母粉購(gòu)自BD，DH5a感受態(tài)、瓊脂粉購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，Nco I、Xho I購(gòu)自 Takara，Gene JET Plasmid Miniprep Kit購(gòu)自 Thermo，EasyPfu DNA Polymerase購(gòu)自 TransGen Biotech，Ready-to-Use Seamless Cloning Kit購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，Kit A購(gòu)自廠家A，KitB購(gòu)自廠家B。

1.3 儀器設(shè)備

搖床（HYG-A）購(gòu)自太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠，臺(tái)式離心機(jī)（1-15PK）購(gòu)自德國(guó)賽多利斯，水浴鍋（HWS-28）購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司，潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD）購(gòu)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，PCR（S100）反應(yīng)擴(kuò)增儀購(gòu)自BIO-RAD，紫外儀（WD-9403C）、電泳儀（DYY-10C）、電泳槽（DYCP-31DN）購(gòu)自北京六一生物科技有限公司，凝膠成像系統(tǒng)（AlphaImager HP）購(gòu)自 ProteinSimple，微量分光光度計(jì)（NanoDrop ONE）美國(guó) Thermo Fisher，渦旋混勻器（HYQ-2121A）購(gòu)自美國(guó)精騏有限公司，恒溫培養(yǎng)箱（BPX-272）購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.4 片段線性化

本研究目的基因HNB2M11插入原核表達(dá)載體pET26b的PelB信號(hào)肽開(kāi)放閱讀框（ORF），采用酶切或PCR擴(kuò)增連接片段線性化。

1.4.1 載體線性化 原核表達(dá)載體pET26b采用Nco I和Xho I雙酶切，膠回收純化獲得線性化載體。

1.4.2 目的基因線性化 無(wú)縫連接試劑盒要求目的基因HNB2M11兩端與pET26b載體末端形成15-25 bp同源序列。擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)要求引入15-25bp的載體末端序列形成重組位點(diǎn)，即5’-15-25bp同源序列-所需酶切位點(diǎn)序列-特異性引物序列-3’。具體序列如下：引物F：ccagccggcgatggccatgg-HNB2M11 5’端 20bp 序 列；引 物 R： tggtggtggtggtgctcgag-HNB2M11-XhoI- 3’端14bp序列（反向）。

1.5 目的片段與載體的重組

將目的DNA片段和線性化載體以一定的摩爾比加到PCR管中進(jìn)行重組反應(yīng)。組分加入量2×Seamless cloning Master Mix 10μL，線性化載體50～ 100ng，插入片段 10～ 30ng，ddH2O 補(bǔ)足至20μL，50℃反應(yīng)15～20min。反應(yīng)結(jié)束立即將離心管置于冰上冷卻2min，待轉(zhuǎn)化。

1.6 轉(zhuǎn)化

加5μL的反應(yīng)體系到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈數(shù)下，置冰上孵育30min。42℃水浴中熱激90s后快速放入冰上5min。加入500μL LB液體培養(yǎng)基，37℃孵育45～60min。4000rpm離心3min收集菌體去上清，均勻的涂布在含卡那霉素抗性固體培養(yǎng)板過(guò)夜37℃培養(yǎng)。

1.7 菌液PCR

挑取單個(gè)菌落至裝有20μL去離子水的離心管，100℃熱擊2min。取1μL上清為模板，T7和T7TER作為引物，20μL PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，凝膠核酸電泳觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 載體線性化

pET26b表達(dá)載體按照50μL體系酶切反應(yīng)（Xho I 2.5μL，Xho I 2.5μL，10×K Buffer 5μL，DNA ≤ 2μg，滅菌水加至 50μL）Nco I和 Xho I雙酶切 4 管，37℃孵育3h。制備1%瓊脂糖濃度的凝膠，待凝膠成形后上樣。調(diào)節(jié)8v/cm（電壓：150v，電流：300mA）電泳15～20min（圖1）。膠回收線性化pET26b載體，紫外吸收法檢測(cè)濃度核酸濃度為26.1ng/μL。

圖1 pET26b酶切線性化核酸電泳圖注 ：M:MarkerDL10000;1 ～ 4: pET26b Nco I和Xho I雙酶切線性化四個(gè)重復(fù)上樣孔

2.2 目標(biāo)片段擴(kuò)增

金斯瑞合成pUC57-HNB2M11作為模板，引物F和R作為引物，按照50μL PCR反應(yīng)體系[EasyPfu Buffer(10×) 5μL，dNTPs（2.5mM）2μL，引 物F（10μM）1μL，引 物 R（10μM）1μL，EasyPfu DNA Polymerase（2.5U/μL）1μL，模板 DNA（20～50ng/μL）2μL，加水至50μL]擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5min激活 Taq聚合酶； 95℃變性 30s，60℃退火 30s，72℃延伸 1min，共 30 個(gè)循環(huán)。經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)結(jié)果顯示擴(kuò)增出條帶單一，片段大小符合預(yù)期（圖2）。PCR產(chǎn)物濃度519.1ng/μL。

2.3 重組反應(yīng)

參考生工生物工程（上海）股份有限公司的Ready-to-Use Seamless Cloning Kit，Kit A 和 Kit B說(shuō)明書(shū)，按照表1體系和反應(yīng)條件進(jìn)行重組，重組完成后冰凍2min，待轉(zhuǎn)化。

2.4 菌液PCR鑒定

生工、廠家A和廠家B三種無(wú)縫克隆試劑盒連接體系轉(zhuǎn)化DH5α后，分別長(zhǎng)出107、86和16個(gè)克隆。挑22、22和16個(gè)克隆菌液PCR鑒定。生工挑取22個(gè)單克隆菌液PCR鑒定，其中20個(gè)為陽(yáng)性克隆，見(jiàn)圖3。

圖2 pET26b和HNB2M11線性化產(chǎn)物鑒定核酸電泳圖注：1.pET26b Nco I+Xho I純化后圖譜；2.HNB2M11 PCR 產(chǎn)物圖譜

表1 生工、廠家A和廠家B無(wú)縫克隆試劑盒評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)重組體系與條件

圖3 生工無(wú)縫克隆試劑盒評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)菌液PCR鑒定核酸電泳圖注：其中1 ～ 22為生工Seamless cloning Master Mix試劑盒的22個(gè)單克隆菌液PCR鑒定的結(jié)果，最后一個(gè)為陰性

圖4 廠家A無(wú)縫克隆試劑盒評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)菌液PCR鑒定核酸電泳圖注：其中1 ～ 22為Kit A的22個(gè)單克隆菌液PCR的結(jié)果，最后一個(gè)為陰性

圖5 廠家B無(wú)縫克隆試劑盒評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)菌液PCR鑒定核酸電泳圖注：其中1 ～ 16為Kit B的16個(gè)單克隆菌液PCR鑒定的結(jié)果，最后一個(gè)為陰性

廠家A挑取22個(gè)單克隆菌液PCR鑒定，其中16個(gè)為陽(yáng)性克隆，見(jiàn)圖4。

廠家B挑取16個(gè)單克隆菌液PCR鑒定，其中7個(gè)為陽(yáng)性克隆，見(jiàn)圖5。

從轉(zhuǎn)化總克隆數(shù)量，商品價(jià)格及陽(yáng)性克隆百分比三方面考慮，生工的 Seamless cloning Master Mix無(wú)縫克隆試劑盒為文庫(kù)構(gòu)建最佳選擇，見(jiàn)表2。

3 討論

無(wú)縫克隆是一種新型、快速、簡(jiǎn)潔的克隆方法，可同時(shí)將1～4個(gè)DNA片段克隆到任何載體中，陽(yáng)性率達(dá)到95%以上。實(shí)驗(yàn)時(shí)只需插入的DNA片段末端引入載體末端15～25個(gè)同源堿基序列，反應(yīng)時(shí)間短至20min，即可在載體的任意位點(diǎn)完成克隆重組。本研究利用該技術(shù)完成多種表達(dá)質(zhì)粒和噬菌體篩選文庫(kù)構(gòu)建，證實(shí)其技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：（1）依賴末端同源片段重組連接，位點(diǎn)選擇靈活，無(wú)需考慮酶切位點(diǎn)等限制因素；（2）陽(yáng)性率高，本研究在His6標(biāo)簽堿基重復(fù)區(qū)域重組，陽(yáng)性率仍在90%以上；（3）大大簡(jiǎn)化了DNA克隆的實(shí)驗(yàn)步驟，顯著提高了基因克隆的成功率。影響無(wú)縫試劑盒連接效率因素繁多：同源序列GC含量，重復(fù)序列，目標(biāo)片段大小、純度、定量方法、感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率等。目前，不同廠家無(wú)縫克隆的試劑盒質(zhì)量參差不齊，選擇合適產(chǎn)品成為一種挑戰(zhàn)。本研究選擇三個(gè)廠家的無(wú)縫克隆試劑盒對(duì)比其單克隆的數(shù)量和連接效率，評(píng)價(jià)方法簡(jiǎn)單高效。此外，本次評(píng)價(jià)在未經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物，含His6標(biāo)簽同源序列（GC含量大于60%且重復(fù)）等不利條件下進(jìn)行，評(píng)價(jià)結(jié)果相對(duì)客觀可信。最后，結(jié)合商品性價(jià)比綜合考慮，生工無(wú)縫克隆的試劑盒為文庫(kù)構(gòu)建等陽(yáng)性率要求嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)的最佳選擇。

表2 生工、廠家A和廠家B無(wú)縫克隆試劑盒評(píng)價(jià)匯總