張萬紅，馮 佳，ALI Kamran，羅健達(dá)，楊舉田，王術(shù)科，宗 浩，申莉莉，李 瑩，王鳳龍，張石飛，楊金廣*，金 軻

[1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.山東臨沂煙草有限公司，山東 臨沂 276001；3.山東濰坊煙草有限公司，山東 濰坊 261061；4.紅云紅河煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，昆明 650231；5.恩施市煙葉分公司，湖北 恩施 445000]

煙草（Nicotiana tabacum）是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在山東省種植面積較大。病毒病是一類嚴(yán)重危害煙草品質(zhì)及產(chǎn)量的病害，由于其防治困難，發(fā)病嚴(yán)重，往往造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）屬于布尼亞病毒目（Bunyaviridae）正番茄斑萎病毒屬（Orthotospovirus），是布尼亞病毒目唯一侵染植物的病毒屬。TSWV 由薊馬取食傳播，其中西花薊馬（Frankliniella occidentalis）是主要傳播介體。西花薊馬于19 世紀(jì)在美國發(fā)現(xiàn)，并逐漸發(fā)展成為世界性的害蟲之一，在我國山東、云南等多個省份均有發(fā)現(xiàn)且為害嚴(yán)重[1-2]。

TSWV 寄主范圍廣泛，在番茄、馬鈴薯、辣椒、花生等作物上均有發(fā)現(xiàn)[3-4]，是危害植物的十大病毒之一[5]。1951 年首次在澳大利亞發(fā)現(xiàn)TSWV 的侵染為害[6]，隨后在美國、韓國、巴西等國家發(fā)現(xiàn)[7-9]，并在中國云南、北京、黑龍江等多個省市地區(qū)的許多作物上均有發(fā)現(xiàn)[10-13]。

筆者所在研究團(tuán)隊前期通過siRNA 測序技術(shù)對山東不同煙區(qū)的煙草病毒病侵染種類進(jìn)行了初步測定，在山東臨沂樣品中發(fā)現(xiàn)了疑似TSWV 的侵染。為進(jìn)一步明確TSWV 在山東煙區(qū)的侵染現(xiàn)狀，參照文獻(xiàn)[7]的TSWV 分離物基因組序列設(shè)計引物，分段法克隆得到該分離物的全基因組序列，明確該分離物的基因組結(jié)構(gòu)特性和遺傳進(jìn)化情況，顯示其屬于TSWV 的一個分離物?；谏綎|臨沂分離物序列信息設(shè)計了TSWVN基因的特異性引物，建立RT-PCR 檢測體系，本研究為番茄斑萎病毒的精準(zhǔn)測報與防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

供試樣品為山東省臨沂市平邑縣疑似受TSWV 侵染的典型性狀煙草葉片，于2019 年6 月采集。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取 將發(fā)病煙葉液氮冷凍處理后研磨成粉末，加入1 mL Trizol Reagent 后混勻，室溫靜置5 min。加入200 μL 三氯甲烷，上下劇烈振蕩15 s，4 ℃靜置5 min。4 ℃ 12 000 r/min 離心15 min。取上層水相并加入等體積異丙醇，混勻，4 ℃靜置10 min。4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min，棄上清，加入75%乙醇，振蕩使沉淀懸浮，洗滌沉淀。4 ℃ 12 000 r/min 離心5 min，棄上清，瞬離，吸出多余乙醇，4 ℃放置超凈臺中干燥3 min。加入30 μL DEPC 水溶解，檢測RNA 的濃度和純度，-80 ℃保存。

1.2.2 RT-PCR 用HiScript III RT SuperMix for qPCR 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系：模板RNA 2.0 μL、4× gDNA wiper Mix 4 μL、RNase-free ddH2O 10 μL，42 ℃孵育2 min 后，向體系中加入5×HiScript III qRT SuperMix 4 μL，反應(yīng)條件37 ℃ 15 min、85 ℃5 s，得到cDNA，-20 ℃保存。

1.2.3 引物設(shè)計及全基因組克隆策略 TSWV 為多分體RNA 病毒，其基因組含有3 條RNA 鏈，為進(jìn)一步驗證上述結(jié)果，依據(jù)已公開的TSWV 基因組序列，設(shè)計全基因組擴(kuò)增引物，L RNA 設(shè)計9 對引物，M RNA 設(shè)計5 對引物，S RNA 設(shè)計3 對引物（表1），對3 條RNA 鏈分段進(jìn)行克隆，通過相鄰片段的重疊部分拼接獲得全基因組序列（圖1）。以獲得的cDNA 為模版進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，按照擴(kuò)增片段大小進(jìn)行膠回收?；厥债a(chǎn)物連接到T 載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞當(dāng)中，篩選陽性克隆，送至上海生工生物公司測序。

1.2.4 序列分析及測定 利用DNAMAN 分別對3條RNA 進(jìn)行拼接，獲得TSWV 全基因組序列。通過NCBI 中的BLAST 進(jìn)行序列同源性分析，并使用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 TSWV 樣品鑒定

對疑似TSWV 侵染樣品總RNA 進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，并將PCR 產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果顯示，樣品中能夠擴(kuò)增出特異性條帶，并且條帶大小與預(yù)期一致，約為274 bp，通過克隆測序和BLAST 在線比較分析，結(jié)果表明臨沂煙區(qū)疑似樣品中含有TSWV 病毒，該病毒分離物初步命名為TSWV-SDLY2。

2.2 TSWV 全基因組結(jié)構(gòu)分析

RT-PCR 和克隆測序結(jié)果顯示（圖 1），TSWV-SDLY2 分離物含有3 條RNA。其中RNA L為反義鏈，全長8911 bp（GenBank:MN833242），其互補(bǔ)鏈能夠編碼依賴于RNA 的RNA 聚合酶RdRp，分子量大小為331.5 kDa，兩端非編碼區(qū)存在互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，且序列保守，形成鍋柄狀結(jié)構(gòu)。RNA M 為雙義編碼RNA 鏈，全長4773 bp（GenBank:MN870629），正義編碼移動蛋白NSm（33.6 kDa），互補(bǔ)鏈編碼Gn（78.0 kDa）、Gc（58.0 kDa）兩種糖蛋白。RNA S也為雙義編碼RNA 鏈，全長2971 bp（GenBank:MN861978），正義編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSs（52.4 kDa），互補(bǔ)鏈編碼病毒的核衣殼蛋白N（28.8 kDa）。

圖1 TSWV 全基因組克隆策略Fig.1 The cloning strategy for TSWV fragments

2.3 TSWV 全基因組序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

對獲得的TSWV-SDLY2 分離物的3 條RNA 鏈進(jìn)行BLAST 比對分析，利用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，采用鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，距離模型選擇差異位點(diǎn)比例（p-distance），自舉法（Bootstrap）100 次進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗。分析結(jié)果顯示，TSWV-SDLY2 分離物3條RNA 鏈與已發(fā)表的TSWV 其他分離物的同源性均在99%以上。TSWV-SDLY2 分離物RNA L 與已發(fā)布的其他 9 個 TSWV 分離物（GenBank：MF805766，MF590700，MG878873，KM657122，MF422032，MF422032,MF590699，KM657120，KM657121）在同一分支上，并與其中的云南分離物（GenBank:MF805766）序列相似度最高，為99.35%，與正番茄斑萎病毒屬（Orthotospovirus）其他種：花生環(huán)斑病毒（Groundnut ringspot virus,GRSV）、鳳仙花壞死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus,INSV）、花生芽壞死病毒(Groundnut bud necrosis virus,GBNV）等聚類到不同的分支上（圖2）。RNA M 與山東分離物（GenBank:KM657118）序列相似度最高，為99.69%，RNA S 與云南分離物（GenBank:HQ402595）序列相似度最高，為99.53%，該分離物RNA M與RNA S均與其他TSWV分離物在同一分支上，與其他同屬不同種的分離物聚類到不同分支上（圖3、4）。

圖2 RNA L 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of RNA L complete sequence

圖3 RNA M 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of RNA M complete sequence

圖4 RNA S 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of RNA S complete sequence

3 討 論

據(jù)我們前期實(shí)地調(diào)查，TSWV 侵染引起的煙草病毒病已經(jīng)由云南煙區(qū)擴(kuò)展到廣西、貴州、四川、湖南和河南等地，為害范圍呈擴(kuò)大蔓延的趨勢。本研究基于前期siRNA 測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)山東煙區(qū)存在TSWV 侵染的風(fēng)險。為確定該結(jié)果，對山東兩個煙區(qū)臨沂和濰坊進(jìn)行實(shí)地采樣調(diào)查，首次在山東臨沂平邑縣采集到疑似病樣，并通過RT-PCR 和全基因組序列測定，明確了TSWV 在山東煙區(qū)的侵染。這是首次在山東臨沂煙區(qū)發(fā)現(xiàn)TSWV 的侵染。將該分離物全基因組序列與其他發(fā)表的TSWV 分離物序列進(jìn)行比較和遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)山東分離物與云南等地的TSWV 相似度較高，與我國的TSWV 分離物均處于同一分支上，說明山東臨沂檢出的TSWV 可能是由云南煙區(qū)帶毒介體的遷飛而傳入的。因此，有必要加強(qiáng)對煙區(qū)病毒病的檢疫與監(jiān)控，特別是帶毒介體薊馬的精準(zhǔn)快速檢測，控制病毒的傳播以避免造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[14]。

TSWV 侵染導(dǎo)致的煙草斑萎病毒病是近年來在西南煙區(qū)為害最為嚴(yán)重的病害之一，TSWV 在侵染煙草后，可引起煙株中下部葉片產(chǎn)生顏色大小不同的壞死斑點(diǎn)或斑紋，并呈現(xiàn)環(huán)狀或同心輪紋狀，植株矮化萎蔫，生長發(fā)育受限等典型癥狀[15]，影響煙草的品質(zhì)及產(chǎn)量，嚴(yán)重田塊可直接導(dǎo)致煙葉絕產(chǎn)。山東臨沂煙區(qū)感染TSWV 加劇了該病毒在全國范圍內(nèi)的蔓延，有效的病毒檢測方法對TSWV 的防治至關(guān)重要。RT-PCR 檢測植物病毒是當(dāng)前使用較多的一種檢測方式，具有快速、成本低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效檢測病毒，及時預(yù)防病毒病的大面積發(fā)生和流行[16]。在本研究中所應(yīng)用的RT-PCR 檢測體系可以作為實(shí)驗室檢測該病毒的方法，但生產(chǎn)上依然需要更加方便快捷、特異性強(qiáng)的檢測體系，例如免疫膠體金層析檢測法等[17]。

TSWV 的大面積發(fā)生與其傳播介體昆蟲的大量繁殖擴(kuò)散有不可分割的聯(lián)系，TSWV 的主要傳播介體西花薊馬可通過取食侵染多種寄主，這使防治TSWV 病毒的難度加大。生產(chǎn)上主要通過控制西花薊馬的蟲口數(shù)量來防治TSWV 病毒病[18-19]。因此，非常有必要在山東建立單頭薊馬TSWV 的快速檢測體系，為該病毒病精準(zhǔn)預(yù)警和有效防控提供技術(shù)保障。

4 結(jié)論

結(jié)果表明，番茄斑萎病毒已在山東臨沂煙區(qū)侵染發(fā)生，這使得該病毒在山東省其他煙區(qū)的侵染風(fēng)險增加，并對山東省的煙草種植生產(chǎn)構(gòu)成新的威脅。遺傳進(jìn)化分析顯示山東臨沂煙區(qū)檢出的番茄斑萎病毒可能由云南煙區(qū)傳入。因此開發(fā)更加快速靈敏的病毒檢測方法，加大煙區(qū)之間的檢疫力度，控制介體昆蟲薊馬的傳播等問題亟待解決。