梅桂林，陳 娜，姚 潔，夏成凱，方成武

(1.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 亳州 236800；2.安徽中醫(yī)藥科學(xué)院 亳州中醫(yī)藥研究所，安徽 亳州 236800；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012)

白術(shù)為菊科植物白術(shù)AtractylodismacrocephalaKoidz.的干燥根莖，為常用大宗中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品。白術(shù)性溫、味甘，入脾、胃二經(jīng)，具有健脾益氣、燥濕利水、固表止汗、安胎之功效[1](P103-104)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明白術(shù)具有調(diào)節(jié)腸胃運動，增強免疫及抗腫瘤等作用[2-3]。白術(shù)主要有效成分為揮發(fā)油和多糖，揮發(fā)油中主要成分為蒼術(shù)酮、蒼術(shù)醇及內(nèi)酯類成分等[4-6]。近年來，基于質(zhì)量標(biāo)志物的概念，有學(xué)者通過白術(shù)化學(xué)成分生源途徑及成分特異性分析、藥效、藥性和藥動學(xué)研究綜合推斷其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，推測其可能的質(zhì)量標(biāo)志物，確定白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 成分為白術(shù)質(zhì)量標(biāo)志物[7-9]。

氣味是中藥重要的性狀特征，也是傳統(tǒng)用于推斷藥物性質(zhì)的基本依據(jù)，隨著對中藥質(zhì)量研究的深入，化學(xué)成分被證實為中藥防病治病的物質(zhì)基礎(chǔ)，中藥氣味特征與所含化學(xué)成分密切相關(guān)，能直接反映其內(nèi)在質(zhì)量[10]。白術(shù)的傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別中特別重視“氣味”的差異。但傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別不可避免地會受到主觀差異的影響，且描述比較簡單，客觀性和準(zhǔn)確性難以保證，很難對其進(jìn)一步傳承、發(fā)展和應(yīng)用。

仿生電子鼻技術(shù)模擬人體嗅覺系統(tǒng)，能快速準(zhǔn)確地檢測分析混合氣體，液體或固體樣品，靈敏度高，重現(xiàn)性好，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制的各個階段[11-14]。目前有關(guān)白術(shù)藥材電子鼻檢測與內(nèi)酯類成分的相關(guān)性研究尚未見文獻(xiàn)報道，本實驗運用電子鼻技術(shù)實現(xiàn)白術(shù)藥材氣味的數(shù)字量化表達(dá)，并與白術(shù)內(nèi)酯類成分的含量進(jìn)行相關(guān)性分析，以實現(xiàn)對白術(shù)藥材品質(zhì)的快速鑒別，為白術(shù)氣味性狀標(biāo)準(zhǔn)化建立提供依據(jù)。

1 實驗器材

1.1 儀器

安捷倫1260高效液相色譜儀(美國)；電子鼻系統(tǒng)(PEN3，德國AIRSENSE)；101-E型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司)；WB500UC型數(shù)控超聲波清洗器(上海望標(biāo)儀器有限公司)；奧豪斯電子天平DV215CD(美國)；Direct-Q 5UV超純水機；高速粉碎機(浙江省永康市溪岸五金藥具廠)；標(biāo)準(zhǔn)篩(新鄉(xiāng)市金禾有限公司)。

1.2 材料

白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品(成都普菲生物技術(shù)有限公司，批號：18101804 18022606 18082201)；乙腈(美國)，甲醇(美國)，實驗用水均使用超純水。實驗用藥材于2019年11月采集于安徽太和、亳州譙城區(qū)十八里、大楊、十九里、魏崗等鄉(xiāng)鎮(zhèn)，具體樣品信息見表1，所有樣品經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)方成武教授鑒定為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的根莖。

表1 白術(shù)樣品信息

2 實驗方法

2.1 白術(shù)內(nèi)酯類成分檢測

2.1.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品0.01029 g、0.00995 g、0.00986 g置于10 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解，分別定容至 10 mL，制成濃度分別為 1.029 g/L、0.995 g/L、0.986 g/L 的單一對照品儲備液；分別精密量取對照品儲備液1 mL于25 mL容量瓶中，定容得到混合對照品溶液，其中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的濃度分別為 0.04116 g/L，0.0398 g/L，0.03944g/L。

(1：白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ；2：白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ；3：白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ)圖1 A：對照品白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ的HPLC色譜圖；B：白術(shù)樣品HPLC色譜圖

2.1.2 供試品溶液的制備

白術(shù)藥材粉碎過80目篩，精密稱定白術(shù)粉末0.5 g，置于50 mL的具塞錐形瓶中，用移液管精密量取25 mL甲醇于錐形瓶中并稱重記錄，適當(dāng)振搖加速溶解。將錐形瓶置于超聲波清洗儀超聲1 h。待錐形瓶中溶液冷卻后稱重，滴加甲醇以補足超聲過程中揮發(fā)的量。將超聲后的溶液用濾紙過濾，濾液置于另一50 mL的具塞錐形瓶中，再使用0.45 μm 微孔濾膜濾過置于進(jìn)樣瓶中，備用。

2.1.3 色譜條件

色譜柱：碳十八柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動相：乙腈(A)和水(B)洗脫：梯度洗脫程序：0至15 min：B—45%、A—55%；15至30 min：B—20%、A—80%；檢測波長：0至19 min：波長220 nm；19至20 min：波長276 nm；20至30 min：波長276 nm。其中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ檢測波長為220 nm，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的檢測波長為276 nm。進(jìn)樣量：20 uL；流速：1.0 uL/min；柱溫：30 ℃。

2.1.4 線性關(guān)系考察

精密量取不同體積的混合對照品溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成一系列不同濃度梯度的白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的混合對照品溶液，在上述色譜條件下分別進(jìn)行檢測，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ線性回歸方程，分別為Y=0.0195x-0.3332 (r=0.9994)Y=0.0146x-0.1006(r=0.9985)；Y=0.0195x-0.3332(r=0.9995)。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ分別在0.00014116 mg～0.00112928 mg、0.0000398 mg～0.0003184 mg、0.00003944 mg～0.00031552 mg范圍內(nèi)線形良好。

2.1.5 精密度考察

按照上述色譜條件，將混合對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣量為20 uL，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量RSD值分別為：0.4%、0.3%、0.5%。表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性實驗

取同一批次白術(shù)藥材粉末，精密稱定5份，每份為0.5 g，按照2.1.2項下方法制得供試液，按上述色譜條件檢測，測得5次白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量的RSD值分別為：2.5%、3.2%、2.8%，實驗重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗

將上述白術(shù)供試品溶液，分別在第0、2、4、6、8、10、24小時后進(jìn)樣檢測，測得白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量的RSD值分別為：2.1%，1.9%，2.9%，可見供試品溶液在24內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 白術(shù)氣味檢測

2.2.1 供試品制備

將白術(shù)藥材打粉后過80目篩，精密稱取2 g白術(shù)粉末，置于同規(guī)格頂空進(jìn)樣瓶內(nèi)，室溫25 ℃條件下孵化10 min，測量時用電子鼻進(jìn)樣針針頭插入進(jìn)樣瓶中固定位置，進(jìn)行樣品氣味信號采集，每個樣品重復(fù)測定3次，記錄120 s時的信號值，取平均值。

2.2.2 檢測條件

通過預(yù)實驗確定最佳儀器檢測參數(shù)，建立最優(yōu)檢測方法：室溫25 ℃，稱樣量2 g，空氣流速300 mL/min，數(shù)據(jù)獲取持續(xù)時間 120 s，清洗時間100 s。

2.2.3 電子鼻精密度考察

PEN3 型電子鼻有 10根金屬傳感器，其編號及敏感成分為：W1C對芳香成分敏感，W5S對氮氧化合物敏感，W3C對氨水、芳香成分敏感，W6S對氫氣有選擇性，W5C對烷烴、芳香成分敏感，W1S對甲烷敏感，W1W對含硫氧化合物敏感，W2S對乙醇敏感，W2W對芳香成分及有機硫化物敏感，W3S對烷烴類敏感。電子鼻輸出的檢測信號是10條不同顏色曲線，以采樣時間為橫坐標(biāo)，響應(yīng)信號值為縱坐標(biāo)，標(biāo)示出10根傳感器在響應(yīng)時間120 s內(nèi)的信號變化，見圖2，為考察儀器精密度，對同一樣品重復(fù)測定6次，結(jié)果顯示各傳感器響應(yīng)值RSD <2.0%，說明儀器精密度良好。

圖2 白術(shù)樣品電子鼻信號曲線

3 結(jié)果與分析

3.1 實驗結(jié)果

按照上述2.1項下實驗條件對白術(shù)樣品中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量檢測結(jié)果見表2；按照上述2.2項下實驗條件對白術(shù)樣品的氣味檢測信號值見表3。

3.2 相關(guān)性分析

利用SPSS19.0軟件對白術(shù)氣味電子鼻信號值與白術(shù)內(nèi)酯類成分含量進(jìn)行相關(guān)性分析，采用雙變量pearson分析法，結(jié)果見表4。

表2 白術(shù)樣品中白術(shù)內(nèi)酯類成分檢測結(jié)果(%)

表3 白術(shù)樣品氣味的電子鼻信號值(R)

表4 相關(guān)性分析結(jié)果

由表4結(jié)果可知，除了W1W傳感器以外，其余9個傳感器與白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的含量呈正相關(guān)，其中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ與W3S傳感器信號值相關(guān)性達(dá)到顯著性水平，說明W3S傳感器信號值越高，樣品中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的含量越高；白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ含量與10個傳感器信號值均成正相關(guān)，其中與W5S傳感器信號值相關(guān)性達(dá)到顯著性水平，說明W5S傳感器信號值越高，樣品中白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ含量越高；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ與10個傳感器的相關(guān)性均未達(dá)到顯著性水平。

4 討論

性狀與化學(xué)成分含量是評價中藥品質(zhì)的兩個重要指標(biāo)，目前在中藥的氣味分析方面依然以傳統(tǒng)的人工鑒別為主，缺乏客觀指標(biāo)，無法進(jìn)行中藥性狀的標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)。電子鼻技術(shù)可實現(xiàn)中藥的“氣味”特征數(shù)字化表達(dá)，檢測速度快、靈敏度高。本實驗采用仿生電子鼻技術(shù)，實現(xiàn)了白術(shù)“氣味”特征的數(shù)字量化表達(dá)；并對白術(shù)氣味電子鼻信號值與白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果表明，W3S與W5S傳感器信號值分別與白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的含量呈顯著正相關(guān)，傳感器響應(yīng)值越高，樣品中對應(yīng)的內(nèi)酯類成分含量越高。因此通過電子鼻W5S與W3S 傳感器信號值可快速判定白術(shù)樣品中白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ與白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的含量，為白術(shù)性狀鑒別的標(biāo)準(zhǔn)化與現(xiàn)代化提供依據(jù)，電子鼻技術(shù)可作為快速鑒別白術(shù)品質(zhì)的新方法加以開發(fā)利用。