劉 楊， 張志平， 彭道榮， 宋瀏偉， 葛勝祥， 郝曉柯， 劉家云

（空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710032）

乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的外膜蛋白，主要用于HBV感染的篩查[1]。血清HBsAg定量檢測(cè)已成為臨床抗病毒治療療效監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)?；瘜W(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法（chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA）是一種高特異性、高靈敏度、重復(fù)性好的檢測(cè)方法，無放射性污染，可快速檢測(cè)血清中的小分子物質(zhì)及腫瘤標(biāo)志物等[2-3]。目前，我國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的是進(jìn)口化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)。由于絕大部分慢性乙型肝炎患者血清HBsAg水平較高，目前臨床常用的檢測(cè)系統(tǒng)需對(duì)樣本先進(jìn)行稀釋，然后再檢測(cè)，不僅降低了工作效率，也加大了檢測(cè)成本。為此，本研究擬建立定量檢測(cè)中、高值血清HBsAg的CMIA，并對(duì)其進(jìn)行初步的性能評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2014年12月—2015年12月空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的HBV感染患者268例，其中男135例、女133例，年齡21～67歲，無甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）、梅毒螺旋體（Treponema pallidum，TP）、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）等合并感染。選取同期空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的表觀健康者146名，其中男75名、女71名，年齡23～74歲。本研究所用的血清樣本均為常規(guī)檢測(cè)后的剩余血清，-20 ℃保存待檢。

1.2 儀器和試劑

重組HBsAg、羊抗HBsAg多克隆抗體Ab1和7株抗-HBsAg小鼠單克隆抗體（Ab2～Ab8）均購(gòu)自廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司，hepatitis E virus（HEV），human immunodeficiency virus（HIV），human T-lymphotropic virus（HTLV），cytomegalovirus（CMV）and Epstein-Barr virus（EBV）positive samples did not cross-react with this assay. The prepared reagent could be stable for 6 d at 37 ℃，it could be stable for 4 weeks after opening lid at 2-8 ℃，and it could be stable for 6 months when stored in a sealed container at 2-8 ℃. The correlation and consistency between self-established CMIA and electrochemiluminescence method were good（r=0.978，P＜0.001）.ConclusionsThe self-established CMIA has a wide linear range for determining HBsAg，high concentration samples can be directly determined without dilution，and the determination performance is good，which has certain clinical application prospects.

Key words：Hepatitis B surface antigen；Hepatitis B virus；Chemiluminescent microparticle immunoassay；Performance evaluation純度均＞90%。HBsAg突變株WT、G119R、P120T、C124Y、I126S、Q129R、S136P、C139R、T140I、P144A、G145A、G145R、M204U、M204I購(gòu)自廈門大學(xué)國(guó)家傳染病與疫苗工程技術(shù)研究中心。磁微粒（直徑約3 μm，微粒表面為羧基修飾）購(gòu)自上海立馳高化工有限公司。碳二亞胺鹽酸鹽[1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide，EDC]和N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxy succinimide，NHS）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Caris 200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（廈門優(yōu)邁克醫(yī)學(xué)儀器有限公司），cobas e601全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（瑞士羅氏公司）及配套HBsAg試劑盒（電化學(xué)發(fā)光法）。

1.3 自建CMIA試劑的制備

自建CMIA主要有2種試劑，一種是磁微粒與鼠抗-HBsAg單克隆抗體偶聯(lián)制備的MB試劑，磁微粒與抗體的化學(xué)偶聯(lián)通過EDC和NHS兩者聯(lián)用進(jìn)行，步驟參照磁微粒使用說明書；另一種是吖啶酯標(biāo)記抗-HBsAg多克隆抗體，配制成SEA試劑，步驟如下：將50 μg抗體與5 μL吖啶酯溶液（5 mmol/L）在300 μL磷酸鹽緩沖液（pH值8.0）中避光反應(yīng)30 min，加入終止緩沖液（5%甘氨酸）反應(yīng)30 min，最后避光透析去除游離吖啶酯。

1.3.1 自建CMIA的檢測(cè)程序 自建CMIA檢測(cè)原理為雙抗體夾心法，檢測(cè)程序：（1）向反應(yīng)杯中加入一定量的樣本、MB試劑和反應(yīng)稀釋液，混勻后37 ℃孵育15 min；（2）儀器內(nèi)置磁鐵對(duì)反應(yīng)杯中的磁微粒進(jìn)行集磁，然后對(duì)磁微粒洗滌2次；（3）加入SEA試劑混勻重懸磁微粒，37 ℃孵育10 min；（4）儀器內(nèi)置磁鐵對(duì)反應(yīng)杯中的磁微粒進(jìn)行集磁，然后對(duì)磁微粒洗滌4次；（5）反應(yīng)杯中加入預(yù)激發(fā)液和激發(fā)液，并檢測(cè)光子信號(hào)。

1.3.2 反應(yīng)的最佳體系 取重組HBsAg抗原用20%嬰牛血清（newborn bovine serum，NBS）進(jìn)行梯度稀釋，得到10份陽(yáng)性系列標(biāo)準(zhǔn)品（依次編號(hào)為S1～S10）。5份表面健康者血清樣本依次編號(hào)為N1～N5。觀察S1～S10的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度（relative light unit，RLU）值與樣本濃度的線性關(guān)系。將S1～S10的平均RLU值（記為P值）除以N1～N5的平均RLU值（記為N值），得出P/N比值，綜合分析上述線性關(guān)系及P/N比值，篩選出最佳反應(yīng)體系。

1.3.3 抗體篩選 將羊抗HBsAg多克隆抗體Ab1標(biāo)記吖啶酯制備成SEA試劑，7株抗-HBsAg小鼠單克隆抗體（Ab2～Ab8）包被磁微粒制備為MB試劑，將MB試劑與SEA試劑配對(duì)檢測(cè)1例HBsAg陽(yáng)性血清樣本（P）、1例HBsAg陰性樣本（N），以及不同HBsAg突變株，評(píng)估不同原料對(duì)不同樣本的檢出能力。

1.3.4 抗體最適濃度的篩選 將不同濃度的磁微?？贵w（0.2、0.4、0.8 mg/mL）與不同稀釋比例的吖啶酯抗體（1∶100、1∶200和1∶500）進(jìn)行兩兩配對(duì)篩選，通過P/N比值及標(biāo)準(zhǔn)品的RLU與濃度的線性關(guān)系篩選出抗體的最適濃度。

1.3.5 反應(yīng)稀釋液的用量 分別設(shè)置0、25、50、100 μL反應(yīng)稀釋液用量，對(duì)S1～S10系列標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，通過P/N比值及標(biāo)準(zhǔn)品的RLU與濃度的線性關(guān)系篩選出反應(yīng)稀釋液的最適用量。

1.3.6 樣本加樣量的選擇 分別設(shè)置20、50、80 μL樣本加樣量，對(duì)S1～S10進(jìn)行檢測(cè)，通過P/N比值及標(biāo)準(zhǔn)品的RLU與濃度的線性關(guān)系篩選出樣本最適加樣量。

1.3.7 試劑用量的選擇 設(shè)置25、50、100 μL試劑用量，分別評(píng)價(jià)MB試劑與SEA試劑的用量對(duì)試劑檢測(cè)范圍的影響，通過P/N比值及標(biāo)準(zhǔn)品的RLU值與濃度的線性關(guān)系篩選出試劑最適用量。

1.3.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將HBsAg純品梯度稀釋，制備成6個(gè)不同濃度（100 000、20 000、4 000、800、160、32 IU/mL）的標(biāo)準(zhǔn)品（依次編號(hào)為S0～S5），測(cè)定S0～S5的RLU值，用四參數(shù)擬合方式對(duì)校準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 自建CMIA的性能評(píng)價(jià)

參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP6-A文件[4]、EP15-A2文件[5]、EP5-A2文件[6]、EP7-A2文件[7]評(píng)價(jià)自建CMIA的檢測(cè)性能。

1.4.1 線性范圍 將高濃度HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋，得到10個(gè)濃度（100 000、50 000、10 000、5 000、1 000、500、100、20、10、5 IU/mL）的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度樣本平行檢測(cè)4次，計(jì)算。將每個(gè)濃度的和RLU值采用Log-Logit數(shù)學(xué)模型處理后得到劑量-反應(yīng)曲線及r值。

時(shí)間等不起，造價(jià)出不起。只有一個(gè)辦法，自己動(dòng)手。工程師劉家林、施工隊(duì)長(zhǎng)李德銘和大家一起，研究出一個(gè)新的方案：原設(shè)計(jì)要求在路基2.5米以下用直徑1560毫米的鋼筋混凝土保護(hù)管穿越路基，改用直徑377毫米的鋼管代替混凝土管，可把管底深度由4.04米減少到2.88米，穿越長(zhǎng)度由70米縮短到35米。但是，長(zhǎng)距離穿越，稍有疏忽就會(huì)造成彎曲，即使縮短為30多米，仍有相當(dāng)長(zhǎng)的距離，如稍有彎曲就會(huì)損傷路基。因此，大家仍是提心吊膽，兢兢業(yè)業(yè)，采取了非常嚴(yán)密的措施，并自己設(shè)計(jì)制造了一個(gè)24米長(zhǎng)的頂推滑道，以避免管道穿彎，還選用D80推土機(jī)，挑選駕駛技術(shù)最熟練的推土機(jī)手，把頂推的位置固定死。

1.4.2 檢測(cè)限 檢測(cè)HBsAg零濃度值的標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)檢測(cè)20次，計(jì)算RLU的和s，將+2s代入劑量-反應(yīng)曲線方程，求出對(duì)應(yīng)的濃度值，即為最低檢測(cè)限。

1.4.3 精密度 分別重復(fù)檢測(cè)高、低值HBsAg陽(yáng)性樣本10次，連續(xù)檢測(cè)10 d，計(jì)算批內(nèi)和批間精密度[以變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）表示]。

1.4.4 準(zhǔn)確度 檢測(cè)配制的準(zhǔn)確度參考品，測(cè)量相對(duì)偏差=（實(shí)測(cè)值-理論值）/理論值×100%。

1.4.5 交叉反應(yīng) 選擇可能與自建CMIA檢測(cè)HBsAg發(fā)生交叉反應(yīng)的其他病毒陽(yáng)性樣本，如HAV、HCV、HIV、人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒（human T-lymphotropic virus，HTLV）、巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）、EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV），通過檢測(cè)特異性觀察自建CMIA是否會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)。

1.4.6 干擾實(shí)驗(yàn) 在HBsAg陽(yáng)性樣本中加入不同濃度的干擾物質(zhì)（血紅蛋白、膽紅素、三酰甘油、類風(fēng)濕因子、抗凝劑）制備成干擾樣本，對(duì)照樣本加入同等體積的0.9%氯化鈉溶液，同時(shí)檢測(cè)干擾樣本和對(duì)照樣本，計(jì)算相對(duì)偏差，相對(duì)偏差=（干擾樣本-對(duì)照樣本）/對(duì)照樣本×100%。如相對(duì)偏差≤10%，可認(rèn)為該濃度的干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)無干擾。

1.4.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將配制好的試劑在37 ℃條件下放置6 d，評(píng)估試劑的熱穩(wěn)定性。將試劑2～8 ℃密封保存6個(gè)月，每3個(gè)月檢測(cè)1次，觀察試劑的長(zhǎng)期保存穩(wěn)定性。將試劑在儀器上冷藏（2～8 ℃）保存4周，每周檢測(cè)1次，評(píng)價(jià)試劑的機(jī)上保存穩(wěn)定性。穩(wěn)定性評(píng)估通過檢測(cè)系列標(biāo)準(zhǔn)品、陰陽(yáng)性參考品及高值、低值樣本，以線性、準(zhǔn)確度、檢出限、精密度等指標(biāo)體現(xiàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件和Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Pearson相關(guān)分析及Bland-Altman一致性檢驗(yàn)評(píng)價(jià)2種方法的相關(guān)性和一致性。

2 結(jié)果

2.1 抗體篩選

7株抗HBsAg小鼠單克隆抗體中Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6和Ab8對(duì)陽(yáng)性樣本和陰性樣本的區(qū)分度較好。進(jìn)一步檢測(cè)不同HBsAg突變株，結(jié)果顯示Ab3、Ab4、Ab6和Ab8對(duì)不同突變株具有互補(bǔ)檢出能力，可用于包被磁微粒，制備MB試劑。見圖1、圖2。

圖1 不同抗體反應(yīng)性評(píng)估

圖2 不同抗體對(duì)不同HBsAg突變株的檢測(cè)能力

2.2 最適反應(yīng)條件

2.2.1 抗體最適濃度的篩選 磁微粒抗體最適濃度為0.4 mg/mL，吖啶酯抗體最適稀釋比例為1∶200（濃度為250 ng/mL）。

2.2.2 反應(yīng)稀釋液最適用量 當(dāng)反應(yīng)稀釋液用量為100 μL時(shí)，試劑檢測(cè)范圍最優(yōu)。見圖3。

圖3 不同反應(yīng)稀釋液用量下RLU與HBsAg濃度的關(guān)系

2.2.3 樣本加樣量 隨著樣本加樣量的增加，試劑檢測(cè)上限逐漸降低，檢測(cè)范圍逐漸縮小，故樣本最適加樣量選擇20 μL。見圖4。

圖4 不同樣本加樣量下RLU和HBsAg濃度的關(guān)系

2.2.4 試劑用量 MB試劑用量和SEA試劑用量對(duì)檢測(cè)范圍的影響較小，因此2個(gè)主要試劑的用量均為50 μL。

2.3 性能評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3.1 線性范圍 自建CMIA檢測(cè)HBsAg的線性范圍為20～100 000 IU/mL，線性回歸方程為Y=0.722X+3.591（r=0.993，P＜0.001）。見圖5。

圖5 自建CMIA檢測(cè)HbsAg的劑量-反應(yīng)曲線

2.3.2 最低檢測(cè)限 將零濃度標(biāo)準(zhǔn)品的RLU代入劑量-反應(yīng)方程，得到自建CMIA的最低檢測(cè)限為9.9 IU/mL。

2.3.3 精密度 自建CMIA檢測(cè)高、低值HBsAg樣本的批內(nèi)CV分別為8.2%、8.4%，批間CV分別為8.9%、8.7%，均符合要求（CV＜10.0%）。

2.3.4 交叉反應(yīng) 自建CMIA對(duì)其他病毒陽(yáng)性樣本均無明顯交叉反應(yīng)，HBsAg均＜20 IU/mL，特異性為100%。

2.3.5 干擾實(shí)驗(yàn) Hb＜400 mg/L、膽紅素＜4 mg/L、類風(fēng)濕因子＜800 IU/mL、三酰甘油＜2 mg/L、檸檬酸鈉＜22 mmol/L、乙二胺四乙酸（ethylenediamineteraacetic acid，EDTA）＜8 mmol/L對(duì)自建CMIA檢測(cè)HBsAg無干擾，相對(duì)偏差均＜10%。見表1。

表1 自建CMIA干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 配制好的試劑在37 ℃可穩(wěn)定6 d，開蓋后上機(jī)（2～8 ℃）保存可穩(wěn)定4周，2～8 ℃密封保存可穩(wěn)定6個(gè)月。見表4。

表4 自建CMIA試劑的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.7 方法學(xué)比較 自建CMIA與電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)HBsAg的相關(guān)性良好，線性回歸方程為Y=1.001X-0.018（r=0.978，P＜0.001），見圖6。Bland-Altman散點(diǎn)圖顯示266份樣本中僅有3份（1.13%）樣本在95%一致性界限外，低于臨床可接受要求（2.5%），2種方法的一致性良好，見圖7。

圖6 自建CMIA與電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)HBsAg的相關(guān)性

圖7 自建CMIA與電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)HBsAg的Bland-Altman散點(diǎn)圖

3 討論

HBV是一種嗜肝性DNA病毒，60%的肝硬化和80%的肝癌是由HBV感染所致[8]。HBsAg是慢性乙型肝炎患者診斷和治療監(jiān)測(cè)重要的血清學(xué)指標(biāo)，HBsAg由陽(yáng)性轉(zhuǎn)為陰性是患者免疫清除的最終目標(biāo)[9]。有研究結(jié)果顯示，血清HBsAg基線水平和治療后血清HBsAg水平的下降幅度都可較好地預(yù)測(cè)患者抗病毒治療的療效和預(yù)后[10-11]。根據(jù)電化學(xué)發(fā)光法試劑說明書的聲明，611例HBV感染者中約有80%的患者血清HBsAg水平分布于100～100 000 IU/mL。ARCHITECT iR2000全自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)（美國(guó)雅培公司）的靈敏度較高，但線性范圍很窄，僅為0.05～250 IU/mL，高于250 IU/mL的樣本需設(shè)置500倍稀釋重檢或手工稀釋后重檢，這大大降低了檢測(cè)效率。cobas e601全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀在首次檢測(cè)HBsAg時(shí)需強(qiáng)制進(jìn)行400倍稀釋，線性范圍為20～52 000 IU/mL，低于20 IU/mL的樣本需原倍重檢，高于52 000 IU/mL的樣本需手工稀釋后重檢。有研究結(jié)果顯示，與ARCHITECT i2000全自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)相比，cobas e601全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對(duì)HBsAg突變株的檢測(cè)能力具有明顯優(yōu)勢(shì)[12-13]。

綜上所述，本研究建立的檢測(cè)血清HBsAg的CMIA在精密度、特異性、穩(wěn)定性等方面均符合臨床檢測(cè)要求，與電化學(xué)發(fā)光法有較好的相關(guān)性和一致性。自建CMIA的優(yōu)勢(shì)是具有更寬的線性范圍（20～100 000IU/mL），可覆蓋臨床上絕大部分乙型肝炎患者血清HBsAg水平的范圍，既降低了因稀釋樣本造成的實(shí)驗(yàn)誤差，又降低了檢測(cè)成本，提高了檢測(cè)效率。該法的不足之處在于檢測(cè)＜20 IU/mL的低值樣本時(shí)有一定的局限性，但這是在提高檢測(cè)上限時(shí)無法避免的問題。臨床上血清HBsAg＜20 IU/mL的HBV感染患者很少，針對(duì)這部分樣本本研究建立了針對(duì)低值樣本的檢測(cè)方法。在指導(dǎo)慢性乙型肝炎患者抗病毒治療的用藥選擇上，臨床對(duì)高值樣本的檢測(cè)需求遠(yuǎn)高于低值樣本，因此該局限性并不影響自建CMIA的臨床應(yīng)用價(jià)值。另外，自建CMIA的試劑原料大部分為國(guó)產(chǎn)，成本較低，獲取方便。因此，自建CMIA具有較好的臨床應(yīng)用前景。