曹冬英，李鷙，許文，隋利強(qiáng)，徐偉

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建省中藥炮制技術(shù)傳承基地，福建 福州 350122)

淡豆豉，為豆科植物大豆[Glycinemax(L.)Merr.]的成熟種子(黑豆)的發(fā)酵加工品[1]。性苦、辛，涼。歸肺、胃經(jīng)。具有解表，除煩，宣發(fā)郁熱的功效。可用于感冒，寒熱頭痛，煩躁胸悶，虛煩不眠等。淡豆豉中含有黃酮、皂苷、蛋白、多糖、氨基酸、纖溶酶等成分，其中黃酮類(lèi)成分被認(rèn)為是主要活性成分。淡豆豉具有降血糖、調(diào)節(jié)腸道菌群、抗菌、抗骨質(zhì)疏松及抗癌等藥理活性[2-6]。

前期課題組采用高效液相色譜法對(duì)市售不同廠家淡豆豉中黃酮類(lèi)成分進(jìn)行含量測(cè)定，建立了淡豆豉中6種黃酮類(lèi)成分的含量測(cè)定方法[7-8]，在試驗(yàn)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，不同廠家淡豆豉所用原料黑豆不同，外觀有明顯差異。經(jīng)市場(chǎng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前市售黑豆主要有4種，故收集4種市售黑豆，分析其黃酮類(lèi)成分含量，經(jīng)發(fā)酵后進(jìn)一步分析其制品淡豆豉中黃酮類(lèi)成分的差異，初步評(píng)價(jià)4種黑豆作為淡豆豉發(fā)酵原料的優(yōu)缺點(diǎn)，為淡豆豉的生產(chǎn)和原料控制提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；CPA225D型十萬(wàn)分之一分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；KQ-500E臺(tái)式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水儀(美國(guó)Millpore公司)。

1.2 材料與試劑 對(duì)照品大豆苷(批號(hào)：P14M10F83057)、黃豆黃苷(批號(hào)：P06J9F65073)、染料木苷(批號(hào)：P09M8F31018)、大豆苷元(批號(hào)：C06N6Y5504)、黃豆黃素(批號(hào)：G16J9C65571)、染料木素(批號(hào)：H30A9Z69019)，以上標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。黑豆(市售)，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)車(chē)蘇容副教授鑒定為豆科植物大豆[Glycinemax(L.)Merr.]的成熟種子；桑葉(北京本草方源藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：20170508)經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)車(chē)蘇容副教授鑒定為?？浦参锷Morusalba(L.)]的葉；青蒿(安徽順和堂中藥飲片有限公司，批號(hào)：171201)經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)車(chē)蘇容副教授鑒定為菊科植物黃花蒿[Artemisiaannua(L.)]的干燥地上部分。甲醇、乙腈為色譜純(德國(guó)Merck公司)；甲酸為色譜純(上海阿拉丁試劑有限公司)；其他試劑均為分析純。

4種市售黑豆，購(gòu)買(mǎi)自市場(chǎng)，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)車(chē)蘇容副教授鑒定3種為豆科植物大豆[Glycinemax(L.)Merr.]的成熟種子(黑豆)，分別習(xí)稱(chēng)黃心小黑豆、綠心黑豆、黃心大黑豆，1種為蝶形花科菜豆屬植物(Phaseolusvulgaris)的成熟種子，習(xí)稱(chēng)黑蕓豆。4種市售黑豆樣品見(jiàn)圖1。

樣1.黃心小黑豆;樣2.黑蕓豆;樣3.綠心黑豆;樣4.黃心大黑豆;樣1-1.黃心小黑豆淡豆豉;樣2-1.黑蕓豆淡豆豉;樣3-1.綠心黑豆淡豆豉;樣4-1.黃心大黑豆淡豆豉

2 方法

2.1 色譜條件 Welch Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～7 min，25%～30% A;7～12 min，30%～45% A；12～20 min，45%～45% A；20～27 min，45%～60% A；27～33 min，60%～75% A；33～35 min，75%～25% A；35～40 min，25%～25% A)，流速0.8 mL·min-1，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。6種對(duì)照品理論板數(shù)均大于5 000。樣品和對(duì)照品高效液相色譜(HPLC)色譜圖見(jiàn)圖2。

A.混合對(duì)照品；B.淡豆豉樣品 1.大豆苷；2.黃豆黃苷；3.染料木苷；4.大豆苷元；5.黃豆黃素；6.染料木素圖2 對(duì)照品及淡豆豉樣品HPLC色譜圖

2.2 溶液配制

2.2.1 混合對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取對(duì)照品大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素適量，加入甲醇超聲溶解，制成濃度分別為530、240、564、550、242和508 μg·mL-1的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。分別精密量取上述對(duì)照品溶液適量，置同一容量瓶中，加50%甲醇至刻度，即得大豆苷53 μg·mL-1、黃豆黃苷24 μg·mL-1、染料木苷56.4 μg·mL-1、大豆苷元55 μg·mL-1、黃豆黃素24.2 μg·mL-1和染料木素50.8 μg·mL-1混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備[1，7-11]將自制淡豆豉樣品60 ℃干燥,粉碎,精密稱(chēng)取1 g,置50 mL錐形瓶中，精密加入25 mL色譜甲醇，混勻,超聲處理30 min(功率250 W，頻率50 kHz)，放冷，再次稱(chēng)重，甲醇補(bǔ)足減失重，搖勻，進(jìn)樣前用0.22 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，得供試品溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱(chēng)取各標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇超聲溶解、定容5 mL容量瓶。大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素,稀釋用50%甲醇為不同梯度濃度的混合對(duì)照品溶液。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)r，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 淡豆豉中6中化合物的線性范圍考察

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素峰面積RSD分別為0.64%、0.43%、0.56%、0.63%、0.56%、0.58%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取以黃心小黑豆為原料發(fā)酵的淡豆豉粉末，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定各成分的峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的平均含量分別為236.0、47.67、355.1、385.6、38.23、236.9 μg·g-1，RSD分別為4.39%、4.27%、4.18%、1.65%、3.98%、2.21%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取以黃心小黑豆為原料發(fā)酵的淡豆豉粉末，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、和24 h按“1.2”項(xiàng)下測(cè)定大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的峰面積，結(jié)果RSD分別為0.81%、1.08%、1.40%、0.67%、1.57%、0.68%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取重復(fù)性試驗(yàn)同批次淡豆豉粉末約0.5 g，精密稱(chēng)定，平行6份，每份分別精密加入近似等量的6種對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下測(cè)定各成分的峰面積，計(jì)算各個(gè)化合物的回收率和回收率的RSD結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果表明該方法回收率良好。

表2 淡豆豉中6個(gè)黃酮類(lèi)成分回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2(續(xù))

3 結(jié)果

用上述建立的方法對(duì)4種黑豆及淡豆豉中6黃酮類(lèi)成分的含量進(jìn)行測(cè)定,對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 4種淡豆豉發(fā)酵前后異黃酮含量比較

將上述結(jié)果用柱形圖表示，如圖3。

1.黃心小黑豆;2.黑蕓豆;3.綠心黑豆;4.黃心大黑豆圖3 4種黑豆及發(fā)酵后淡豆豉中6種黃酮類(lèi)成分含量比較

4 討論

4.1 由圖2可知，2號(hào)樣品(黑蕓豆)中6種黃酮類(lèi)成分未檢測(cè)到，雖外形與黑豆相似，實(shí)際不能作為淡豆豉發(fā)酵原料。其余3種黑豆6種黃酮類(lèi)成分含量差異性大，其中黃心小黑豆中3種黃酮苷類(lèi)成分含量最高，黃心大黑豆次之，綠心黑豆黃酮苷類(lèi)成分含量最低；發(fā)酵后的淡豆豉中6種黃酮類(lèi)成分含量也有明顯差異，其中以黃心小黑豆中黃酮苷元含量最高，黃心大黑豆次之，綠心黑豆苷元含量最低。淡豆豉中苷元含量的高低與其療效密不可分，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道異黃酮類(lèi)苷元抗骨質(zhì)疏松作用優(yōu)于異黃酮苷類(lèi)[12]，此外，苷元與苷相比，更利于人體吸收，故黃心小黑豆作為淡豆豉的發(fā)酵原料可能更為適宜。

4.2 從淡豆豉本草考證中可以看出歷代本草發(fā)酵淡豆豉大多以黑豆作為原料[13-15]。明·陳嘉謨《本草蒙筌》云：“黑白種殊，惟取黑者入藥；大小顆粒，須求小粒煎湯。緊小者為雄豆，入藥方效”[16]，福州淡豆豉傳統(tǒng)制備方法中原料也以黃心小黑豆為主。在淡豆豉發(fā)酵過(guò)程中，幾種黑豆在洗去表面菌絲時(shí)，黃心小黑豆的質(zhì)地最為堅(jiān)硬，不易脫皮，更利于保持成品的外觀。故推測(cè)黃心小黑豆為淡豆豉發(fā)酵的較優(yōu)原料。

4.3 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[1,7-11,17]，淡豆豉中黃酮苷及苷元的提取方法有加熱回流法、索氏提取法、超聲波法等，所用溶劑包括甲醇、80%甲醇、70%乙醇。本試驗(yàn)主要為比較市售黑豆及成品淡豆豉中黃酮苷及苷元含量，前期試驗(yàn)表明，選用甲醇超聲提取法可滿(mǎn)足試驗(yàn)要求[8]。今后試驗(yàn)可通過(guò)不同提取方法比較、驗(yàn)證，對(duì)該方法進(jìn)行改進(jìn)。

本試驗(yàn)所測(cè)成分為大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素；桑葉中含槲皮素、紅景天苷、鼠李素-3-O-半乳糖苷等黃酮類(lèi)成分[18]，青蒿中含有蒿黃素、貓眼草黃素等黃酮類(lèi)成分[19]，但沒(méi)有大豆苷及大豆苷元等成分，淡豆豉加工所用輔料桑葉、青蒿對(duì)本試驗(yàn)所測(cè)成分不產(chǎn)生干擾。

致謝：感謝福建省中藥制劑與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心(Fujian Research Center of Preparation and Quality Control Engineering Technology of Traditional Chinese Medicine)為本試驗(yàn)提供科研平臺(tái)。