張秋蘭,朱 智,溫子健,倪永年

南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院,江西 南昌 330031

引 言

熒光石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)具有良好的化學(xué)惰性和生物相容性,以及熒光發(fā)光可調(diào)和熒光上轉(zhuǎn)換等特性,已成為生物成像、藥物運(yùn)輸、疾病檢測和熒光探針等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1]。因GQDs在靶向藥物遞送和改變血腦屏障等方面的應(yīng)用受到了極大的關(guān)注,人們對評估GQDs在生物系統(tǒng)中的潛在毒性風(fēng)險(xiǎn)越來越感興趣[2]。已有文獻(xiàn)報(bào)道石墨烯納米材料可能導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞毒性和肺部疾病[3],但有關(guān)GQDs毒性研究或生物學(xué)效應(yīng)的報(bào)道較少。Huang等[4]和Lu等[5]分別研究了GQDs與人血清白蛋白和DNA的相互作用,為評價(jià)GQDs在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的毒性和生物學(xué)效應(yīng)提供了依據(jù)。然而,有關(guān)GQDs的毒理學(xué)研究還有待深入。

胰蛋白酶(trypsin,Tryp)是胰腺分泌的一種絲氨酸蛋白酶,其分子為23 300,由223個(gè)氨基酸殘基組成,在脊椎動(dòng)物的消化、蛋白質(zhì)成熟、凋亡、凝血、免疫反應(yīng)等生理過程中起著重要的作用。近年來,胰蛋白酶得到了廣泛的應(yīng)用,對胰蛋白酶的研究也時(shí)有報(bào)道,例如藥物分子和納米粒子與胰蛋白酶的相互作用[6-7],谷胱甘肽包裹的CdTe量子點(diǎn)和CdSe量子點(diǎn)與胰蛋白酶的作用[8-9]。然而,在分子水平上GQDs對胰蛋白酶的毒性研究尚未見報(bào)道。

納米材料與生物大分子作用以紫外可見分光光度法、熒光和紅外光譜、圓二色譜法等為主要技術(shù),由于生命作用體系都比較復(fù)雜,需要利用和發(fā)展化學(xué)計(jì)量學(xué)方法,把能對生命現(xiàn)象做出解釋的有用信息盡可能地從測量數(shù)據(jù)中挖掘出來。繼以往將化學(xué)計(jì)量學(xué)方法用于銀納米粒子與血清蛋白作用后研究[10],本工作將多維數(shù)據(jù)解析用于GQDs與胰蛋白酶的研究,為GQDs對人體健康的潛在毒性風(fēng)險(xiǎn)提供有價(jià)值的信息。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

石墨烯量子點(diǎn)(graphene quantum dots,GQDs,南京先豐納米材料科技有限公司,純度～90%,量子點(diǎn)<10 nm,量子產(chǎn)率～5%,分子量78)用二次蒸餾水配成1.0×10-2mol·L-1的溶液備用,4 ℃以下冰箱保存。胰蛋白酶(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分子量23 800,干燥失量≤10.0%,酶活力(μ·g-1)25 000,淡黃色粉末用二次蒸餾水溶解成2.5×10-3mol·L-1的溶液備用。N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽(上海生工,白色結(jié)晶或粉末,溶于水,純度大于98%,分子量342.82)用二次蒸餾水溶解成1.0×10-3mol·L-1的溶液備用。日立F-7000(日本日立公司)熒光分光光度計(jì)(配備1.0 cm熒光比色皿),狹縫寬度Ex=5 nm,Em=10 nm,掃描電壓為700 V,掃描速度2 400 nm·min-1; Agilent 8453紫外可見光光度計(jì)(美國安捷倫公司); 圓二色譜儀(法國Bio-Logic公司); 超級恒溫水槽ZC-10(寧波天恒儀器廠)。

1.2 方法

將3.0 mL pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液加入比色皿中,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要依次加入適量的GQDs和Tryp溶液。

實(shí)驗(yàn)1: 固定Tryp的濃度(4.00×10-6mol·L-1),再加入不同量的GQDs,使其濃度分別為0,1.67,3.33,…,13.33×10-5mol·L-1(濃度間隔1.67×10-5mol·L-1),放置5 min以達(dá)平衡,在298 K測其熒光光譜。

實(shí)驗(yàn)2: 固定Tryp的濃度(3.33×10-6mol·L-1),加入不同量的GQDs,使[GQDs]∶[Tryp]=0,5,10,15,20,在298 K測其圓二色譜。所得到的CD(circular dichroism,CD)譜為三次掃描的平均值,并通過緩沖信號進(jìn)行校正。

實(shí)驗(yàn)3: 固定Tryp的濃度(4.17×10-6mol·L-1),再加入GQDs,使[GQDs]∶[Tryp]=10,在298 K下測其三維熒光。

1.3 酶活性

實(shí)驗(yàn)4： N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽(BAEE)在波長253 nm下的紫外吸收遠(yuǎn)小于其水解產(chǎn)物N-苯甲酰-L-精氨酸(BA)的紫外吸收[11]。在胰蛋白酶的催化下,BAEE酯鍵水解產(chǎn)物BA逐漸增多,體系的紫外吸收也隨之增加。胰蛋白酶的活性以ΔA253 nm計(jì)算。在3.0 mL Tris-HCl緩沖溶液中固定Tryp的濃度(4.17×10-6mol·L-1),然后加入不同量的GQDs(0～8.33×10-5mol·L-1,間隔8.33×10-6mol·L-1),在37 ℃孵化2 h后,再加BAEE(1.67×10-4mol·L-1),測GQDs存在和不存在下的紫外吸收光譜。

1.4 擴(kuò)展矩陣數(shù)據(jù)的構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)5： (UV-Vis(ultraviolet visible,UV-Vis)法,DTryp): 固定Tryp的濃度(1.67×10-5mol·L-1),加入不同濃度的GQDs(0～3.33×10-4mol·L-1,間隔1.67×10-5mol·L-1)。

實(shí)驗(yàn)6： (UV-Vis法,DGQDs): 固定GQDs的濃度(1.67×10-5mol·L-1),加入不同濃度的Tryp(0～2.22×10-6mol·L-1,間隔1.11×10-7mol·L-1)。

以上紫外光譜數(shù)據(jù)采集范圍均為200～500 nm(間隔1 nm,301個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)),見表1。

表1 不同實(shí)驗(yàn)條件下得到的2個(gè)波譜數(shù)據(jù)矩陣Table 1 The experimental conditions to build up the extension matrixes

1.5 化學(xué)計(jì)量學(xué)方法: 多元曲線分辨-交替最小二乘法(MCR-ALS)

經(jīng)典的多元曲線分辨-交替最小二乘法(multivariate curve resolution-alternating least squares,MCR-ALS)法在處理體系測量數(shù)據(jù)時(shí)所得到的信息相對簡單孤立,Tauler對其進(jìn)行了拓展和改進(jìn)[12]。本工作通過UV-Vis技術(shù)采用兩種滴加方式獲得2個(gè)波譜數(shù)據(jù)矩陣(見表1)后,將這2個(gè)矩陣Dtrypsin(實(shí)驗(yàn)5)和DGQDs(實(shí)驗(yàn)6)在列的方向組成一擴(kuò)展矩陣,再用MCR-ALS解析; 多維數(shù)據(jù)解析方法最大的優(yōu)勢在于可獲得多維陣唯一的分解結(jié)果,即分辨出體系中感興趣組分的相對濃度和光譜趨勢圖。

(1)

2 結(jié)果與討論

2.1 GQDs與胰蛋白酶作用的熒光光譜

酶的熒光性質(zhì)來自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸殘基。固定胰蛋白酶,加入不同濃度的GQDs。表明GQDs可改變胰蛋白酶所處的微環(huán)境,使其疏水性增加[14]。與此同時(shí),GQDs濃度越高,胰蛋白酶熒光變化越明顯(1→9,下降了近16%),說明GQDs可與胰蛋白酶作用并改變大分子的二級結(jié)構(gòu)[15]。

圖1 GQDs與胰蛋白酶作用的熒光光譜圖Fig.1 The fluorescence spectra of the interactionof GQDs with trypsin

2.2 GQDs對胰蛋白酶構(gòu)象的影響

2.2.1 圓二色譜法

圓二色譜是一種準(zhǔn)確靈敏的檢測蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的方法。利用遠(yuǎn)紫外(200～260 nm)可測定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。在沒有和存在GQDs的情況下,胰蛋白酶的CD譜如圖2所示。胰蛋白酶在210 nm左右呈負(fù)譜帶,不存在正峰。在胰蛋白酶溶液中加入GQDs后,CD信號出現(xiàn)小幅下降,但峰的形狀和位置沒有明顯變化,說明與GQDs結(jié)合時(shí)胰蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)展開,但基本結(jié)構(gòu)保持完整。用公式[16]計(jì)算得到胰蛋白酶的α-螺旋結(jié)構(gòu)由19.12%下降至16.23%,進(jìn)一步說明GQDs加入可誘導(dǎo)胰蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使胰蛋白酶骨架松弛[17]。

2.2.2 三維熒光光譜法

三維熒光光譜可證明蛋白質(zhì)構(gòu)象特征的變化。圖3(a)和(b)是胰蛋白酶和石墨烯量子點(diǎn)的三維熒光光譜。峰1和峰2是瑞利散射峰(λex=λem)和二階散射峰(2λex=λem)[19]。峰a(λex=280 nm,λem=344 nm,I=1 548)與色氨酸和酪氨酸殘基從π→π*躍遷的熒光特性有關(guān),加入石墨烯量子點(diǎn)后[λex=280 nm,λem=337 nm,IF(fluorescence intensity)=1 529]反映了胰蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)變化。峰b(λex=225 nm,λem=322 nm,I=1 474)是胰蛋白酶多肽骨架結(jié)構(gòu)的熒光特征,主要是由n→π的躍遷引起的,表明石墨烯量子點(diǎn)存在下胰蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)變化(λex=225 nm,λem=318 nm,I=366)。加入GQDs后,胰蛋白酶峰a和峰b的熒光強(qiáng)度值明顯下降并出現(xiàn)藍(lán)移,這些數(shù)據(jù)表明GQDs與胰蛋白酶作用使胰蛋白酶構(gòu)象的變化[19]。

圖2 GQDs與胰蛋白酶作用的CD圖

圖3 GQDs與胰蛋白酶作用的三維熒光圖(a): cTryp=4.17×10-6 mol·L-1;(b): cTryp=4.17×10-6 mol·L-1; cGQDs=4.17×10-5 mol·L-1Fig.3 Three dimensional fluorescence spectra ofthe interaction of GQDs with trypsin(a): cTryp=4.17×10-6 mol·L-1;(b): cTryp=4.17×10-6 mol·L-1; cGQDs=4.17×10-5 mol·L-1

2.3 GQDs對胰蛋白酶活性的影響

隨著GQDs的加入,胰蛋白酶活性降低,但不能被完全抑制(圖4,縱坐標(biāo)為相對活性)。通過GQDs酶活性下降的半抑制濃度IC50為4.35×10-6mol·L-1,說明GQDs對胰蛋白酶活性相對較弱的抑制作用。這可能是GQDs在酶中有較高的高生物利用度,胰蛋白酶的活性位點(diǎn)被GQDs穩(wěn)定和保護(hù)[20]。

2.4 MCR-ALS解析結(jié)果分析

紫外-可見吸收是測定小分子與生物分子相互作用的一種簡單而常用的技術(shù)。如圖5(a)所示,胰蛋白酶在大約215和276 nm處呈現(xiàn)出兩個(gè)吸收峰,在215 nm處的吸收峰隨著GQDs的加入逐漸向220 nm移動(dòng)直至平衡,而在276 nm處的吸收峰基本保持不變。從圖5(b)可知,隨著胰蛋白酶的加入,GQDs的峰強(qiáng)度明顯增加,峰位移不明顯。圖5(a)和(b)的光譜重疊嚴(yán)重,難以區(qū)分GQDs-胰蛋白酶復(fù)合物的光譜而無法分析反應(yīng)過程。通常利用化學(xué)計(jì)量學(xué)擴(kuò)展多元曲線分辨-交替最小二乘法(MCR-ALS)可從復(fù)雜系統(tǒng)的重疊波譜信號中提取較多的額外信息,例如組分的濃度分布、純光譜、特別是確定GQDS-胰蛋白酶復(fù)合物等方面的信息。

圖4 不同濃度GQDs存在下Tryp的活性

圖5 Tryp與GQDs反應(yīng)的紫外吸收光譜

圖6 由MCR-ALS解析紫外光譜得到的GQDs與胰蛋白酶 作用體系光譜圖(a)和濃度趨勢圖(b)和(c)Fig.6 Recovered UV-Vis spectra (a) andconcentration profiles (b) and (c)

通過實(shí)驗(yàn)5和實(shí)驗(yàn)6得到擴(kuò)展光譜數(shù)據(jù)矩陣[Dtrypsin,DGQDs],然后利用奇異值分解(SVD)方法計(jì)算矩陣,得到與化合物相關(guān)重要因子個(gè)數(shù),得到的前4個(gè)特征值分別為113.6，30.7，10.3和1.4,說明反應(yīng)體系中有3個(gè)主要因素可能與3個(gè)化合物有關(guān),分別為胰蛋白酶、GQDs和GQDs-胰蛋白酶復(fù)合物。MCR-ALS法提取的胰蛋白酶和GQDs的光譜[虛線,圖6(a)]與實(shí)測圖(實(shí)線)吻合較好。此外,還得到了GQDs-胰蛋白酶復(fù)合物的紫外-可見吸收光譜(虛線)。計(jì)算與實(shí)測光譜曲線吻合較好,說明MCR-ALS解析得到的濃度曲線合理可靠。如圖6(b)所示,隨著GQDs的加入,GQDs-胰蛋白酶復(fù)合物濃度逐漸升高,同時(shí)胰蛋白酶濃度下降,在[GQDs]∶[胰蛋白酶]=15時(shí),體系趨于平衡; 從圖6(c)可知,隨著胰蛋白酶的加入,GQDs濃度呈逐漸下降趨勢,GQDs-胰蛋白酶復(fù)合物濃度增加直至體系基本平衡。MCR-ALS法的解析結(jié)果為進(jìn)一步了解GQDs與胰蛋白酶相互作用的動(dòng)力學(xué)過程提供了依據(jù),說明GQDs可以與胰蛋白酶相互作用,并形成GQDs15-胰蛋白酶復(fù)合物。

3 結(jié) 論

采用光譜法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法研究GQDs與胰蛋白酶的相互作用。三維熒光光譜法和圓二色譜實(shí)驗(yàn)說明GQDs的存在不僅改變了胰蛋白酶所處的微環(huán)境并使胰蛋白酶的構(gòu)象發(fā)生變化。運(yùn)用多元曲線分辨-交替最小二乘法(MCR-ALS)解析擴(kuò)展光譜數(shù)據(jù)矩陣,進(jìn)一步認(rèn)識GQDs與胰蛋白酶在作用中達(dá)到平衡時(shí)各組分的狀態(tài)和整個(gè)動(dòng)態(tài)變化過程。而酶活性實(shí)驗(yàn)表明GQDs會(huì)影響胰蛋白酶的活性。該研究從分子水平研究GQDs與生物大分子的作用機(jī)制,并為GQDs的毒副作用研究提供了有價(jià)值的信息。下一步計(jì)劃研究不同尺寸和層數(shù)的石墨烯量子點(diǎn)對生物大分子構(gòu)象和蛋白酶活性的影響。