羅遠(yuǎn) 蔣海忠

胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一，據(jù)2015 年我國癌癥中心統(tǒng)計(jì)，胃癌在惡性腫瘤死亡率排名第3 位［1-2］。近年來，microRNAs（miRNAs）作為腫瘤標(biāo)志物，參與胃癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及化療抵抗，受到學(xué)術(shù)界越來越多的關(guān)注［3］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA 發(fā)揮癌基因和抑癌基因的功能，參與細(xì)胞增殖、凋亡和分化的調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用［4-5］。其中，miR-124 在多種腫瘤中發(fā)揮抑瘤基因的功能，如膀胱癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌［6-9］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-124 在胃癌細(xì)胞及組織中表達(dá)下調(diào)（包括人胃癌細(xì)胞MGC803），且在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用［5，10］。但miR-124 對(duì)胃癌細(xì)胞MGC803 的生物學(xué)功能尚未深入。因此，本研究主要探討miR-124 對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC803 增殖、凋亡的影響，并進(jìn)一步研究其調(diào)控PI3K/AKt 信號(hào)通路的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）細(xì)胞株：胃癌細(xì)胞MGC803 購自通派（上海）生物科技有限公司。（2）主要試劑：Trizol? Reagent、Lipofectamine? 2000 試 劑 均 購 自Invitrogen 公 司；SYBR Green qPCR Mix、4×Reverse Transcription Master Mix 均 購 自TaKaRa 公 司；CCK8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TransWell小室購自上海子起生物科技有限公司；miR-124 模擬 物（miR-124 mimics）、 陰 性 對(duì) 照（mimics-NC）購自上海吉瑪公司；胎牛血清購自美國PeproTech公司；DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；PI3K、Akt、p-PI3K 和p-AKT 單 克 隆 抗 體、HRP 標(biāo) 記 山羊抗兔IgG 二抗均購自美國Abcam 公司；引物均由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)合成（其中miR-124 引物 序 列：Forward：5'-GCTAAGGCACGCGGTG-3'；Reverse ：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' ；U6 ：Forward：5'-GCTCGCTTCGGCAGCACA-3'；Reverse：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'）。（3）主要儀器：1658033 小型蛋白垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（武漢科昊佳生物科技有限公司）；ABI 7500 熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；美國SHELLAB 2406-2 CO2培養(yǎng)箱（美國SHELLAB 公司）；CLARIOstar 全功能多功能酶標(biāo)儀（德國BMG LABTECH 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：將胃癌細(xì)胞MGC803 培養(yǎng)在含10%的胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。（2）細(xì)胞轉(zhuǎn)染：分別設(shè)置miR-124mimics 組與陰性對(duì)照（miR-124NC）組，待MGC803 細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期時(shí)，使用胰酶消化細(xì)胞后，洗滌2遍后應(yīng)用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)至3.0×106個(gè)/ml，取200μl 細(xì)胞液接種至corning 6 孔板中培養(yǎng)24h。分別向三個(gè)EP 管中加入5μl LipofectamineTM2000，5μl LipofectamineTM2000+ 陰 性 質(zhì) 粒miR-124 NC，5μl LipofectamineTM2000+5μl miR-124 mimics，室溫靜置5min 后混合，加入不含血清的DMEM 培養(yǎng)基調(diào)整終體積至2ml，置于37℃、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)6h后，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，完成MGC803 細(xì)胞轉(zhuǎn)染，并繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（3）RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)miR-124 的表達(dá)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功后，采用RT-qPCR 技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)miR-124 的表達(dá)。收集細(xì)胞后，PBS 洗滌2 遍，離心取細(xì)胞沉淀，按照Trizol? Reagent 說明書提取胃癌細(xì)胞MGC803 的總RNA，依據(jù)4×Reverse Transcription Master Mix 試劑盒說明書將組織總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為總cDNA，按照SYBR Green qPCR Mix 試劑盒說明書操作，以cDNA 為模板，進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件：94℃ 2min，94℃20s，60℃ 30s，共40 個(gè)循環(huán)。以U6 為內(nèi)參，miR-124 基因的相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。（4）CCK8 檢測細(xì)胞增殖水平：待轉(zhuǎn)染后的MGC803 細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期時(shí)，使用胰酶消化細(xì)胞后，洗滌2 遍后應(yīng)用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)至3.0×103個(gè)/ml，每孔（96 孔板）接種100μl 細(xì)胞液。分別培養(yǎng)24h、48h、72h，加入配置好的CCK8 試劑（10μl CCK8 試劑+90μl 完全培養(yǎng)基）孵育2h，采用酶標(biāo)儀檢測OD450 值。（5）細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)：兩組細(xì)胞以200 個(gè)/皿接種于60mm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿（含10ml 培養(yǎng)液）中，置37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育，2 周后肉眼可見細(xì)胞克隆的形成。小心吸棄培養(yǎng)液，用PBS 洗滌2 次，將兩組細(xì)胞以4%的多聚甲醛固定15min，再用0.1%的結(jié)晶紫染色20min，用清水清洗染液并風(fēng)干，于熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野統(tǒng)計(jì)形成的細(xì)胞克隆數(shù)（＞50 個(gè)克隆數(shù)為有效克?。＃?）流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：消化MGC803 細(xì)胞后使用含血清DMEM 培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)至3×105個(gè)/ml，收集對(duì)數(shù)生長的各組細(xì)胞，據(jù)說明書進(jìn)行操作，采用Annexin V/PI 凋亡試劑盒檢測不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞的凋亡率。其中，各組樣品分別加入500μl Binding Buffer，5μl Annexin V，5μl PI，混勻，室溫避光反應(yīng)5～15min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平。（7）miR-124 對(duì)MGC803 細(xì)胞PI3K/Akt 信號(hào)通路的調(diào)控作用：按照1 ∶10（g/ml）的比例加入RIPA裂解液，按BCA 蛋白定量試劑盒說明書方法測定所提取的各組細(xì)胞的總蛋白含量，以確保每組樣本之間的上樣量相同。裂解、提取各組蛋白后，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素（PVDF）膜，將轉(zhuǎn)好的PVDF 膜于5%脫脂奶粉溶液中室溫封閉2h，TBST 洗滌液漂洗3～4 次。加入一抗，4℃孵育過夜。再漂洗3～4 次，加入HRP 標(biāo)記的二抗體，室溫孵育2h，漂洗3～4 次?；瘜W(xué)發(fā)光檢測底物ECL 工作液顯色，采用Image J 圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白顯影圖進(jìn)行灰度分析，以β-actin 為內(nèi)參，分析PI3K、Akt、p-PI3K 和p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)水平。再次收集MGC803 細(xì)胞后，PBS洗滌2 次，離心取細(xì)胞沉淀，按照Trizol? Reagent 說明書提取miR-124mimics 組與miR-124 NC 組胃癌細(xì)胞MGC803 的總RNA，按細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，均以β-actin 為內(nèi)參，分別檢測PI3K、Akt 的mRNA水平。引物由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)提供，引物序列見表1。

表1 PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵基因引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t 檢驗(yàn)比較兩組間各指標(biāo)水平差異，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后MGC803 細(xì)胞miR-124 的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響 MGC803 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124 模擬物后，miR-124 的表達(dá)量為（4.15±0.18），顯著高于miR-124NC 組（2.01±0.14）（t=17.984，P=0.006）。 轉(zhuǎn) 染24h、4h 和72h 后，miR-124mimics 組 細(xì) 胞的OD450值分別為（0.46±0.09）、（0.86±0.08）和（1.08±0.13）；其中，轉(zhuǎn)染48h 和72h 后，miR-124mimics 組顯著低于miR-124 NC 組 的（1.25±0.14） 和（1.72±0.17）（t=8.245，14.257，P=0.027、0.008），結(jié)果見圖1。說明轉(zhuǎn)染miR-124 后，人胃癌細(xì)胞MGC803 的增殖能力降低。

圖1 miR-124對(duì)MGC803細(xì)胞增殖的影響

2.2 miR-124 對(duì)MGC803 細(xì) 胞 克 隆 實(shí) 驗(yàn) miR-124 mimics 組細(xì)胞克隆形成數(shù)為（71.3±4.5），顯著低于miR-124 NC 組（103.8±10.1），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.450，P＜0.001）。說 明 轉(zhuǎn) 染miR-124 后MGC803細(xì)胞的克隆能力降低，進(jìn)一步反映miR-124 可抑制人胃癌MGC803 細(xì)胞增殖。結(jié)果見圖2。

圖2 miR-124對(duì)胃癌MGC803細(xì)胞克隆的影響

2.3 miR-124 對(duì)MGC803 細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞轉(zhuǎn) 染24h、48h 和72h 后，miR-124mimics 組 細(xì) 胞凋 亡 率 分 別 為（12.70±5.14）、（51.80±8.14）% 及（70.40±7.14）%。其中細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48h 和72h 的細(xì)胞凋亡率顯著高于miR-124 NC 組的（24.81±7.41）%和（33.21±8.29）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.565、18.147，P=0.007、0.005），結(jié) 果 見 圖3。提 示 轉(zhuǎn) 染miR-124 后MGC803 細(xì)胞凋亡率提高，且凋亡率隨時(shí)間而不斷增高。

2.4 miR-124 對(duì)MGC803 細(xì)胞PI3K/Akt 信號(hào)通路的影響 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，miR-124 mimics 組PI3K/Akt 信號(hào) 通 路 中 關(guān) 鍵 靶 點(diǎn)PI3K、Akt、p-PI3K 和p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)分別為（0.87±0.05）、（0.95±0.11）、（0.89±0.09） 和（0.91±0.10）， 均 顯 著 低 于miR-124 NC 組（1.25±0.13）、（1.34±0.08）、（0.95±0.12）和（1.12±0.09）（t=13.542、15.224、4.159、12.357，P=0.007、0.008、0.035、0.006）。 同 時(shí)，miR-124 mimics 組PI3K/Akt 信號(hào)通路中PI3K 及Akt 基因相對(duì)表達(dá)分別為（0.73±0.08）和（0.64±0.11），均顯著低于miR-124 NC 組（0.87±0.15）和（0.94±0.10）（t=8.365、10.324，P=0.007、0.009）。提示miR-124 可抑制胃癌細(xì)胞MGC803 的PI3K/Akt 信號(hào)通路。結(jié)果見圖4。

圖3 miR-124對(duì)MGC803細(xì)胞凋亡的影響

圖4 miR-124對(duì)MGC803細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

3 討論

目前，胃癌已成為我國發(fā)病率和病死率最高的常見惡性腫瘤之一［11］，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國每年胃癌新發(fā)患者達(dá)70 萬人［12］。由于胃癌的發(fā)病隱匿及診斷水平限制，多數(shù)胃癌患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)展為中晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，即使早期胃癌患者在接受手術(shù)治療后仍有可能發(fā)生局部 復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致治療失敗。故尋找新的藥物靶點(diǎn)已成為近年來的研究熱點(diǎn)，為胃癌的治療尋找新的突破。近年研究表明miRNA 可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和分化，促進(jìn)或抑制腫瘤的惡性表型，相比正常細(xì)胞，腫瘤組織中miRNA 存在異常表達(dá)，這些異常表達(dá)的miRNA 在腫瘤形成中可能扮演重要角色，可作為生物學(xué)特性、腫瘤病因?qū)W、組織分型和臨床分級(jí)分期的分子標(biāo)志物［13］。

miRNA 是一類微小非編碼RNA，其長約20～22個(gè)核苷酸［11］。在眾多miRNAs 中，miR-124 是一種新發(fā)現(xiàn)與胃癌有關(guān)的miRNA，與胃癌發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系［5，10］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，miR-124 在多種腫瘤包括消化系統(tǒng)腫瘤的細(xì)胞或組織中均表達(dá)下調(diào)。Xie 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，通過上調(diào)miR-124 表達(dá)水平，高濃度的miR-124 不僅可抑制胃癌細(xì)胞增殖，還可促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的作用；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與5-氟尿嘧啶聯(lián)合使用后，miR-124 對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用更加明顯，這為miR-124 作為胃癌治療的潛在藥物靶點(diǎn)提供了有力的證據(jù)。但目前國內(nèi)關(guān)于miR-124 與胃癌發(fā)生發(fā)展及相關(guān)機(jī)制的研究報(bào)道較少。基于此，本研究成功將miR-124 轉(zhuǎn)染至人胃癌MGC803 細(xì)胞中，并進(jìn)一步考察miR-124 對(duì)胃癌細(xì)胞MGC803 增殖及凋亡的影響，結(jié)果顯示miR-124mimics 組中細(xì)胞的miR-124 高表達(dá)；轉(zhuǎn)染48h 后miR-124mimics 組MGC803 細(xì)胞的增殖較miR-124 NC 組顯著降低；同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，miR-124 mimics 組MGC803 細(xì)胞凋亡率較miR-124 NC 組顯著提高。由此可見，miR-124 可抑制胃癌細(xì)胞MGC803 增殖并促進(jìn)MGC803 細(xì)胞凋亡。

為了進(jìn)一步探討miR-124 對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC803增殖及凋亡的作用機(jī)制，本研究采用Western blotting法和RT-qPCR 法測定PI3K/Akt 信號(hào)通路關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白和mRNA 水平。研究證實(shí)，PI3K/Akt 信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡等重要活動(dòng)，其調(diào)控的失衡與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及耐藥密切相關(guān)，已成為值得深入研究的治療靶點(diǎn)［15］。Akt 蛋白處于PI3K/AKt 信號(hào)通路的中心位置，經(jīng)磷酸化后被激活形成p-AkT，后者進(jìn)一步使多個(gè)Akt 下游蛋白發(fā)生磷酸化（包括PI3K 等），從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡等［16］。有學(xué)者分別檢測胃癌干細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中PI3K、Akt 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胃癌干細(xì)胞中PI3K、Akt 蛋白與mRNA 的表達(dá)明顯高于胃癌細(xì)胞，推測PI3K/Akt 信號(hào)通路與胃癌進(jìn)展密切相關(guān)［17］。本研究考察了miR-124 對(duì)人胃癌MGC803 細(xì)胞PI3K、Akt、p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)及PI3K、Akt 基因水平，發(fā)現(xiàn)miR-124mimics 組上述蛋白及基因表達(dá)均較miR-124NC 組顯著降低。提示miR-124 可抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路，從而促進(jìn)人胃癌MGC803 細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞增殖，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［16，18］。

綜上所述，miR-124 可抑制人胃癌細(xì)胞MGC803的增殖，提高其細(xì)胞凋亡，其可能機(jī)制與抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路表達(dá)有關(guān)。本研究可為胃癌的診斷與基因治療提供參考。