吳建躍 王衛(wèi)民 徐海松 張眉 程軍

內(nèi)臟痛（Visceral Pain，VP）是最為常見(jiàn)的疼痛類型之一，主要為刺激內(nèi)臟器官而產(chǎn)生疼痛，如心、肝、脾、腎、膀胱等疼痛［1］。內(nèi)臟痛患者常需要承受身體及心理上的雙重痛苦，生存質(zhì)量明顯降低，如何防治內(nèi)臟痛一直以來(lái)是臨床上所面臨的重要問(wèn)題［2-3］。隨著研究的不斷深入，結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在痛覺(jué)信號(hào)的產(chǎn)生及傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astrocyte，AST）為機(jī)體最大的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，被激活后可導(dǎo)致多種炎癥因子分泌增加，參與形成和維持痛覺(jué)過(guò)敏和觸誘發(fā)痛等中樞敏化過(guò)程［4］。三七總皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）是中藥三七的主要成分，具有多種生物療效，如活血化瘀、改善微循環(huán)、降低缺血再灌注、抑制心肌細(xì)胞凋亡等［5-6］。為進(jìn)一步探討AST 在內(nèi)臟疼痛中的作用及其機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)對(duì)SD 大鼠腹腔注射PNS 或者NS 預(yù)處理，然后建立炎性內(nèi)臟痛模型，通過(guò)注射PNS 和NS 對(duì)比，并探究不同組別GFAP 及RAS 蛋白的表達(dá)變化，進(jìn)而考察三七總皂苷對(duì)炎性內(nèi)臟痛大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：本次研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康大鼠30 只，均為雄性，體重200～300g。清潔級(jí)，由北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于無(wú)菌、恒溫及暗明交替的清潔級(jí)環(huán)境中（明暗各12h），自由飲食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7d，使其適應(yīng)環(huán)境，避免外界刺激。（2）實(shí)驗(yàn)儀器與試劑：①主要試劑：無(wú)菌生理鹽水（廠家：濰坊中匯有限公司）；冰醋酸（廠家：山西錦洋藥用輔料有限公司）；三七總皂苷（廠家：云南三七科技有限公司）。②主要儀器：高速低溫離心機(jī)（廠家：Sigma公司）；多功能酶標(biāo)儀（廠家：TECAN）；蛋白電泳儀（廠家：伯樂(lè)）；熒光成像系統(tǒng)（廠家：Odyssey CLx）。

1.2 方法 （1）分組及給藥：大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=6）、生理鹽水組（n=12）、三七總皂苷組（n=12）。對(duì)照組的大鼠不進(jìn)行處理，生理鹽水組及三七總皂苷組的大鼠預(yù)先腹腔給藥14d，每隔12h 腹腔注射，三七總皂苷預(yù)處理組每只腹腔注射7mg/ml 的三七總皂苷和生理鹽水溶液2.86ml/kg，生理鹽水預(yù)處理組每只腹腔注射2.86ml/kg。（2）炎性內(nèi)臟痛模型的建立：第15 天建立大鼠疼痛模型，將小鼠放置于干凈透明的箱子中，注射1ml 1%醋酸建立急性腹膜炎模型。觀察大鼠的扭體反應(yīng)，處死大鼠，觀察其相關(guān)指標(biāo)。（3）RAS 檢查：采用western blot 檢測(cè)RAS 的含量，具體步驟如下。①每20～50mg 組織加入1ml 預(yù)冷的RIPA Buffer 低溫研磨（研缽提前放入液氮預(yù)冷）。使用前在每1ml 預(yù)冷的RIPA Buffer 加入10μl 磷酸酶抑制劑，10μl 蛋白酶抑制劑混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用。②置于4℃搖床平臺(tái)上，中速（100～150rpm）振蕩1h。14000rpm（15450g），4℃離心20min，取上清液為全蛋白提取物，蛋白定量和其他蛋白質(zhì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。③聚丙烯酰胺凝膠電泳：15%丙烯酰胺膠電泳，蛋白上樣量30～50μg。④轉(zhuǎn)膜：濕轉(zhuǎn)30～100min。⑤封閉：5%脫脂奶粉室溫封閉1h。⑥孵育一抗：4℃孵育一抗過(guò)夜，抗體稀釋比例：β-actin（1 ∶10000）；RAS（1 ∶5000）。⑦孵育二抗：羊抗兔二抗（1 ∶10000），羊抗鼠二抗（1 ∶10000）。⑧Odyssey CLx 顯影。（4）GFAP 檢測(cè)：采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠脊髓 GFAP表達(dá)情況，具體步驟如下。①挑選脊髓切片，進(jìn)行漂洗。②PBS 漂洗結(jié)束后，置脫色搖床中。③加一抗 GFAP（1 ∶1000），孵育2h 后，4℃過(guò)夜。④加羊抗鼠二抗（1 ∶200），孵育2h。⑤PBS 漂洗后，加三抗。⑥洗滌、脫水、封片。⑦觀察、計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以%表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 扭體次數(shù) 扭體反應(yīng)能夠在一定程度上反應(yīng)大鼠的疼痛程度，建立模型1h 后，觀察并記錄兩組大鼠的扭體次數(shù)，對(duì)照組的大鼠未出現(xiàn)扭體現(xiàn)象，生理鹽水組大鼠的扭體次數(shù)為（103.5±7.8）次，三七總皂苷組大鼠的扭轉(zhuǎn)次數(shù)為（67.6±10.6）次。與對(duì)照組比較，生理鹽水組及三七總皂苷組大鼠扭體次數(shù)明顯增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與生理鹽水組比較，三七總皂苷組大鼠的扭轉(zhuǎn)次數(shù)明顯減少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 RAS 表達(dá) 對(duì)三組大鼠體內(nèi)RAS 表達(dá)水平進(jìn)行研究分析，與對(duì)照組比較，生理鹽水組（NS+HAc+NS）及三七總皂苷組（PNS+HAc+PNS）大鼠的RAS 水平明顯上升，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與生理鹽水組比較，三七總皂苷組大鼠RAS 含量明顯降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05），具體結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3 GFAP 表達(dá) 對(duì)三組大鼠的腰骶膨大段脊髓GFAP表達(dá)水平進(jìn)行研究分析，與對(duì)照組比較，生理鹽水組及三七總皂苷組大鼠的GFAP 水平明顯升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；三七總皂苷組大鼠的GFAP 水平明顯低于生理鹽水組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），具體結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 三組大鼠RAS表達(dá)情況

圖2 三組大鼠GFAP表達(dá)情況

3 討論

GFAP 為星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，具有一定的特異性，當(dāng)機(jī)體受到侵損時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞大量釋放，GFAP 含量明顯升高，參與神經(jīng)損傷性疼痛［7］。RAS為神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)節(jié)因子參與脊髓痛覺(jué)的形成，為疼痛治療的新靶點(diǎn)。本次研究中，建立了疼痛模型的大鼠RSA、GFAP 含量明顯升高，與生理鹽水組比較，三七總皂苷組的大鼠RSA、GFAP 含量明顯降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0.6%～9%的冰醋酸可引發(fā)大鼠內(nèi)臟痛而產(chǎn)生扭體反應(yīng)，且扭體的次數(shù)與疼痛的程度關(guān)系密切，其中1%的冰醋酸所引發(fā)的大鼠扭體反應(yīng)較為穩(wěn)定，故通常選擇該濃度的冰醋酸建立大鼠內(nèi)臟疼痛模型，在本次研究中，大鼠內(nèi)臟疼痛模型建立成功。

三七總皂苷為三七的主要活性成分，具有多種藥理作用，被應(yīng)用于多種疾病的治療過(guò)程中。近年來(lái)研究表明三七總皂苷具有抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活性、促進(jìn)神經(jīng)原恢復(fù)的作用，表現(xiàn)出一定的鎮(zhèn)痛作用。在本資料中，對(duì)三組大鼠的扭體反應(yīng)、RAS、GFAP 水平進(jìn)行了考察，結(jié)果表明三七總皂苷能夠顯改善大鼠內(nèi)臟疼痛，這可能與抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性有關(guān)。綜上所述，三七總皂苷在內(nèi)臟痛的治療過(guò)程中具有良好的效果，能夠顯著降低臨床表現(xiàn)，改善相關(guān)癥狀。三七總皂苷在鎮(zhèn)痛方面具有較大的應(yīng)用價(jià)值，值得應(yīng)用及推廣。