李紅娟 宋鑫宏 程建青 馮磊

摘 ?要：近年來，激光共聚焦顯微成像技術(shù)發(fā)展迅速，新技術(shù)在提高分辨率、掃描速度、降低光毒性、活體觀察、大視野圖像拼接和三維重建等方面提升和擴展了其應(yīng)用功能。新技術(shù)帶來更多醫(yī)學相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，本研究梳理了所管理的兩臺大型精密儀器設(shè)備蔡司超高分辨率共聚焦顯微鏡（Laser Scanning Confocal Microscope with Airyscan， LSCM880 with Airyscan）和安道爾轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡（Andor Spinning-Disk Confocal Microscopy，SDCM）在成像原理、配置參數(shù)、成像特點及應(yīng)用領(lǐng)域等方面的不同，使研究人員熟悉和了解兩臺共聚焦顯微鏡的應(yīng)用特點，獲得更多的實驗方法及思路，更加直觀準確的展示實驗結(jié)果。

關(guān)鍵詞：激光理論;蔡司超高分辨率共聚焦;安道爾轉(zhuǎn)盤共聚焦;顯微成像技術(shù)

中圖分類號：TH742 文獻標志碼：A 文章編號：2095-2945（2020）32-0008-04

Abstract： The laser confocal microscopy has been developing rapidly over the past few years. The new technology enhances and expands its application functions in the field of improved resolution， scanning speed， reduced phototoxicity， in vivo observation， large-field image stitching and 3D reconstruction， thus bringing more potential in medical-rated fields. This study summarized the differences of imaging principles， configuration parameters， imaging characteristics and application fields between Zeiss Laser Scanning Confocal Microscope with Airyscan （LSCM880 with Airyscan） and Andor Spinning-Disk Confocal Microscopy （SDCM）. We aim to provide comprehensive information of the two instruments to researchers， allowing them to acquire more experimental methods and ideas， with more intuitive and accurate display of experimental data.

Keywords： laser theory; Zeiss LSCM880 with Airyscan; spinning-disk confocal microscopy; microscopic imaging technology

LSCM880 with Airyscan是卡爾蔡司顯微鏡部研發(fā)的一款配備Airyscan超高分辨率檢測器模塊的激光共聚焦顯微鏡[1]，使常規(guī)超分辨率顯微鏡與共聚焦熒光成像的優(yōu)勢相結(jié)合，從而使X、Y和Z的空間分辨率提高，為細胞內(nèi)蛋白質(zhì)定位、細胞器動力學和蛋白質(zhì)功能等方面研究提供了新的解決方法[2-4]。LSCM880 with Airyscan可以廣泛應(yīng)用在植物學[5]、基礎(chǔ)醫(yī)學[6]、生物工程學[7]和細胞生物學[8]等領(lǐng)域，適用于細胞爬片、組織切片、活細胞動態(tài)觀察[9]等，能夠?qū)崿F(xiàn)多色熒光通道、Tile、Z-stake和Time等功能研究[10，11]。Joseph Huff等[12-14]介紹了LSCM880 with Airyscan的超分辨功能，重點介紹了Airyscan成像原理與優(yōu)勢。王娟娟等[15，16]介紹了LSCM880的Position功能使用技巧以及溫度對LSCM880成像效果的影響。SDCM是英國安道爾公司研發(fā)的一款利用雙轉(zhuǎn)盤系統(tǒng)進行快速成像的共聚焦顯微鏡，適用于活細胞或組織內(nèi)相關(guān)信號分子如Ca2+動態(tài)檢測[17，18]，本文作者側(cè)重結(jié)合自己的管理經(jīng)驗，對兩臺共聚焦顯微鏡的成像特點及應(yīng)用研究進行比較，供科研人員和同行管理人員借鑒。

1 共聚焦成像原理及配置參數(shù)

1.1 成像原理

LSCM880 with Airyscan成像原理與蔡司LSCM880等一系列共聚焦成像原理相似，是在傳統(tǒng)熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上，利用激光束作為光源對熒光樣品進行激發(fā)，利用針孔來排除非焦平面信號進入探測器，之后經(jīng)過一系列光電成像部件進行信息采集和信號放大，最后經(jīng)過信號處理輸出到計算機上得到整個圖像[19]。LSCM880 with Airyscan的檢測器并非傳統(tǒng)的物理針孔和單一陣列組成的檢測器PMT光電倍增管，而是利用32個通道的高靈敏度磷砷化鎵GaAsP-PMT檢測器來進行平面圖像檢測，相當于擁有32個檢測器元件，每個小的檢測器原件都相當于一個小針孔，從而可以提供具有1 AU針孔的傳統(tǒng)共聚焦無法獲得的高空間頻率信息的對比度[13]，與傳統(tǒng)共聚焦相比，分辨率可以提高約1.7倍，具體原理示意圖如圖1。

SDCM是采用雙轉(zhuǎn)盤共聚焦系統(tǒng)，包括微透鏡轉(zhuǎn)盤和針孔轉(zhuǎn)盤，針孔轉(zhuǎn)盤上有大量螺旋排列同等大小的針孔，當光線穿過微透鏡轉(zhuǎn)盤后會形成一定數(shù)量的微光束，這些微光束通過針孔轉(zhuǎn)盤照射到樣品上會同步激發(fā)同等數(shù)量的光信號，這些信號會沿著顯微鏡光路返回，當他們通過管鏡再次穿過小孔就會實現(xiàn)共聚焦過濾，所得到的焦平面信號通過兩個轉(zhuǎn)盤之間的二向色鏡轉(zhuǎn)移到EMCCD或者sCMOS上進行成像[20]，具體原理示意圖如圖2。

1.2 配置參數(shù)

LSCM880 with Airyscan和SDCM基本構(gòu)成部件相似，主要由激光器、掃描頭、顯微鏡、光學系統(tǒng)和計算機系統(tǒng)等構(gòu)成，兩臺共聚焦主要構(gòu)成部件對比如表1。

2 共聚焦成像特點及應(yīng)用領(lǐng)域

2.1 成像特點

LSCM880 with Airyscan和SDCM的基本應(yīng)用功能相似，兩者都可以進行單色、多色熒光通道拍攝，時間序列觀察、三維層掃等功能拍攝。但是根據(jù)兩臺儀器設(shè)備的配置參數(shù)，成像特點略有差異，本研究主要從分辨率、成像速度和信噪比三個方面進行比較，具體成像特點如表2。

2.1.1 分辨率

LSCM880 with Airyscan的xy分辨率可以達到120nm，其原因在于理論上最大分辨率的圖像獲得需要調(diào)整針孔大小為0.2AU，而針孔的減小使圖像的信號減弱，Airyscan檢測系統(tǒng)中32個蜂窩式針孔的組合可以使小針孔高分辨率成像與大針孔高信噪比采集效率相結(jié)合，而SDCM使用高速高分辨率的sCMOS相機，可以使XY方向分辨率達到235nm，但無法達到與LSCM880 with Airyscan相同的分辨率。

2.1.2 成像速度

SDCM探測器配有高速高分辨率sCMOS相機，轉(zhuǎn)盤的轉(zhuǎn)速可以達到6000rpm，使SDCM具有高速成像的特點，在樣本熒光較強，曝光時間為2.5ms時，通過多點同步快速掃描的方式其成像速度最高可達400fps（512*512）， 大大提高掃描效率，節(jié)省掃描時間，降低光毒性，而LSCM880 with Airyscan通過點掃描的方式，成像速度只能達到13fps（512*512）。

2.1.3 信噪比

SDCM探測器配有高靈敏度EMCCD相機，因其具有信號放大EM功能，且量子效率QE值達到了95%，LSCM880 with Airyscan這種點掃描共聚焦QE值在45%左右，所以在樣本熒光較弱時，使用SDCM的EMCCD相機更具有優(yōu)勢，具有更好的信噪比。

2.2 應(yīng)用領(lǐng)域

除了基本的成像之外，LSCM880 with Airyscan還可以進行Tile大視野拼圖，熒光共振能量轉(zhuǎn)移等相關(guān)研究。根據(jù)兩臺儀器設(shè)備的應(yīng)用特點，其在不同的科學實驗及研究領(lǐng)域中發(fā)揮獨特的作用，如L. Scipioni等[2]利用Airyscan檢測系統(tǒng)的超高分辨率特點對穩(wěn)定表達EGFP的NIH-3T3細胞隔室進行全面動態(tài)分析。Xiu-Tang Cheng等[4]利用Airyscan的超高分辨率特點，探討了神經(jīng)系統(tǒng)中細胞溶酶體的標志物-溶酶體相關(guān)膜蛋白1（LAMP1），并全面分析了LAMP1在神經(jīng)元溶酶體細胞器中的分布，解釋了在病理和生理條件下LAMP1的運輸分布與溶酶體降解的相關(guān)性。Jing Shao等[21]利用LSCM880 with Airyscan的Time時間序列模式檢測了姜黃素對細胞內(nèi)Ca2+濃度的影響。相比之下，SDCM的應(yīng)用范圍相對小一些，但是由于它采用靈敏度極高的EMCCD做探測器，在極低的激光照射強度下即可采集到高品質(zhì)圖像，降低了系統(tǒng)的光漂白和光毒性，同時配有高速成像的sCMOS，使其在短暫的電生理過程（如鈣火花）、3D細胞內(nèi)熒光蛋白動力學、活細胞分子相互作用、活體模式生物觀察（斑馬魚、小鼠等）相關(guān)領(lǐng)域有相對優(yōu)勢。如Swapnil K等[22]利用SDCM檢測小鼠血管內(nèi)皮細胞中的鈣火花，驗證了通過調(diào)節(jié)TRPV4參與介導(dǎo)的鈣內(nèi)流可以調(diào)節(jié)血管舒張等功能特點，Yvonne NTalini等[18]利用SDCM成功驗證了GCaMP2小鼠血管內(nèi)皮細胞中的鈣波。

3 共聚焦維護管理

3.1 實驗室日常維護

激光共聚焦顯微鏡屬于大型精密儀器設(shè)備，正確的維護清潔和保養(yǎng)能有效延長設(shè)備使用壽命，也可以使設(shè)備處于最佳工作狀態(tài)。LSCM880 with Airyscan和SDCM分別位于江南大學醫(yī)學院大樓兩個單獨避光無窗的實驗室，管理員每天早晚各巡查一次，保證室內(nèi)空調(diào)、除濕機等正常運作，保證溫度控制在22±2℃，濕度40～60%;檢查基本物資如鏡油、棉簽、擦鏡紙、光盤和無水乙醇等耗材的正常供應(yīng);檢查兩臺精密儀器的使用登記情況;每周定期打掃實驗室衛(wèi)生，對實驗臺面和地面等進行清理;由于激光共聚焦顯微鏡對房間潔凈度要求比較高，所以要求實驗人員進入前均需要穿戴一次性鞋套，保證實驗室的潔凈度。

3.2 儀器軟硬件日常維護

管理員除了保證潔凈的實驗室工作環(huán)境，還需要對兩臺顯微鏡軟硬件進行日常維護保養(yǎng)，保養(yǎng)內(nèi)容包括：每周用無水乙醇逐一對實驗物鏡、目鏡、載物臺等進行清潔;每周獨自操作一遍設(shè)備，檢查儀器操作參數(shù)的設(shè)置是否正常，保證UPS穩(wěn)壓器、防震臺和電動載物臺等正常工作;檢查實驗數(shù)據(jù)按照規(guī)定的CZI格式和文件名稱存儲到指定路徑，并要求實驗人員用光盤進行數(shù)據(jù)刻錄，嚴禁使用U盤拷貝數(shù)據(jù)，定期對實驗數(shù)據(jù)進行備份后清理，保證電腦運行速度。

3.3 儀器日常預(yù)約管理

兩臺儀器設(shè)備均屬于江南大學固定資產(chǎn)，對醫(yī)學院、江南大學附屬醫(yī)院、校內(nèi)其他學院及校外合作單位提供全面開放共享機制。使用人員可以在E江南大儀系統(tǒng)上進行儀器培訓申請和使用預(yù)約，管理員每月組織一次儀器使用培訓考核并開通使用權(quán)限，儀器設(shè)置了電腦控制端口，使用時需登錄賬號密碼，后臺會自動記錄儀器使用具體時間并進行相應(yīng)扣費。

4 結(jié)束語

LSCM880 with Airyscan和SDCM能基本滿足醫(yī)學、生物工程學及食品科學等學科涉及到顯微成像的科學研究，已參與相關(guān)研究課題發(fā)表在National Science Review（IF：13.22）等權(quán)威雜志期刊上。在實際操作過程中兩臺儀器設(shè)備還存在一些不足，比如兩臺設(shè)備均沒有配備活細胞工作站，這就在超長時間觀察活細胞動態(tài)分析實驗時有所局限;由于可見光的穿透能力有限，單光子掃描深度無法滿足較厚樣本的成像;高強度激光的漂白和毒性導(dǎo)致一些細胞器如活細胞線粒體等產(chǎn)生形態(tài)改變、熒光淬滅等情況，無法穩(wěn)定對活細胞中線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等亞細胞器進行深入動態(tài)研究;SDCM儀器操作相對復(fù)雜，參數(shù)設(shè)置較多，實驗人員在選擇上仍然會優(yōu)先考慮LSCM880 with Airyscan。雖然兩臺設(shè)備的分辨率已經(jīng)遠超普通的熒光顯微鏡，但在細胞微觀結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域仍然存在局限性，隨著成像技術(shù)的不斷更新完善，已經(jīng)逐步有一些新的方法或技術(shù)如：蔡司新一代激光片層掃描顯微系統(tǒng)Lightsheet7，蔡司Elyra 7 with Lattice SIM技術(shù)等被應(yīng)用于共聚焦顯微鏡，以滿足對大體積樣品任意深度范圍內(nèi)感興趣的區(qū)域進行高效快速分析的要求，為亞細胞結(jié)構(gòu)、細菌、神經(jīng)元或活細胞內(nèi)信號分子動態(tài)分析等提供更多研究可能。

[14]Huff J. The Fast mode for ZEISS LSM 880 with Airyscan： high-speed confocal imaging with super-resolution and improved signal-to-noise ratio[J]. Nature Methods， 2016，13（11）：1548-7105.

[15]王娟娟，魏學紅.激光共聚焦顯微鏡的Position功能使用技巧[J].中國激光醫(yī)學雜志，2019，28（3）：169-172.

[16]王娟娟，魏學紅.溫度對激光掃描共聚焦成像效果的影響[J].影像科學與光化學，2018，36（5）：443-452.

[17]張彥麗，代亞麗，陳亞蘭，等.利用轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡進行快速實驗的新方法[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2019，19（19）：3784.

[18]Tallini Y N， Brekke J F， Shui B， et al. Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo： measurements in Cx40BAC GCaMP2 transgenic mice [J]. Circulation Research， 2007，101（12）：1300-1309.

[19]黃體冉，馬蘭青，劉續(xù)航，等.激光掃描共聚焦顯微鏡在生物醫(yī)學中發(fā)展與應(yīng)用[J].科教文匯，2017，7：184-186.

[20]Oreopoulos J， Berman R， Browne M. Spinning-disk confocal microscopy： present technology and future trends [J]. Methods in Cell Biology， 2014，123：153-175.

[21]Shao J， Han J， Zhu Y， et al. Curcumin Induces Endothelium-Dependent Relaxation by Activating Endothelial TRPV4 Channels[J]. Journal Of Cardiovascular Translational Research， 2019，12（6）：600-607.

[22]Sonkusare S K， Bonev A D， Ledoux J， et al. Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function [J]. Science， 2012，336（6081）：597-601.