李佳琦 張忠 王旭光 薄威 梁伊靈 付星瑋 張珉

【摘要】 目的：研究FAM136A在胃腺癌（stomach adenocarcinoma，STAD）組織中的表達水平及其臨床病理學(xué)意義。方法：采用生物信息學(xué)方法在TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選出STAD中高表達的基因FAM136A。采用免疫組織化學(xué)染色法檢測62例STAD以及11例癌旁組織中FAM136A的表達情況并分析其與患者年齡、性別、腫瘤大小、病理分級、TNM分期等臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系。采用生物信息學(xué)方法分析STAD中FAM136A與其他調(diào)控腫瘤進展指標(biāo)間轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)性。結(jié)果：生物信息學(xué)分析顯示，STAD組織中FAM136A的mRNA轉(zhuǎn)錄水平高于癌旁組織（P<0.05）。免疫組織化學(xué)染色實驗顯示，F(xiàn)AM136A主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在STAD組織中的表達水平明顯高于癌旁組織（P=0.000 2）;在STAD組織中，年齡、性別的FAM136A表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），病理分級、T分期、N分期的FAM136A表達情況比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。生物信息學(xué)分析顯示，STAD中FAM136A表達與Cyclin D1、CDK4、MMP9及Snail1均呈正相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：FAM136A在STAD組織中高表達并與腫瘤進展密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 FAM136A 胃腺癌 腫瘤進展

[Abstract] Objective： To study the expression level of FAM136A in gastric adenocarcinoma and its clinicopathological significance. Method： Bioinformatics method was used to screen out genes that were high expressed in gastric adenocarcinoma from the TCGA database. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of FAM136A in 62 cases of gastric adenocarcinoma and 11 cases of adjacent cancer tissues， and the relationship between its expression and age， gender， tumor size， pathological grade， and TNM stage was analyzed. Bioinformatics methods were used to analyze the correlation between FAM136A and other markers regulating tumor progression in gastric adenocarcinoma. Result： Bioinformatics analysis showed that mRNA transcription level of FAM136A in gastric adenocarcinoma tissues was higher than that of adjacent tissues （P<0.05）. Immunohistochemical staining showed that FAM136A was mainly localized in the cytoplasm and its expression level in gastric adenocarcinoma tissues was significantly higher than that in adjacent tissues （P=0.000 2）; in STAD tissues， the expression of FAM136A by age and gender showed no statistically significant difference （P>0.05）， compared the expression of FAM136A in pathological grades， T stages and N stages， the differences were statistically significant （P<0.05）. Bioinformatics analysis showed that FAM136A expression was positively correlated with Cyclin D1， CDK4， MMP9 and Snail1 in gastric adenocarcinoma （P<0.05）. Conclusion： FAM136A is highly expressed in gastric adenocarcinoma and associated with tumor progression.

[Key words] FAM136A Gastric adenocarcinoma Tumor progression

First-authors address： Shenyang Medical College， Shenyang 110034， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.23.001

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率在常見惡性腫瘤中居于第三位，僅2018年全世界約有100萬新發(fā)病例且約有78.3萬人死于胃癌[1]。胃腺癌（stomach adenocarcinoma，STAD）是起源于胃黏膜腺上皮的惡性上皮性腫瘤，胃癌大約90%是腺癌。由于部分胃癌病例臨床表現(xiàn)不典型，就診被延誤，早期缺乏有效篩查手段，缺少有效治療技術(shù)等多種因素，深入研究胃癌發(fā)病機制，尋找關(guān)鍵致病因子將有助于胃癌的防控及臨床診治。如能找到調(diào)控胃癌進展的關(guān)鍵分子，明確其分子機制，將有利于胃癌早期發(fā)現(xiàn)，靶向治療，有利于降低病死率。因此，本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)分析TCGA數(shù)據(jù)庫中STAD及癌旁組織中差異表達的基因，篩選出136序列相似的家族成員A（family with sequence similarity 136 member A，F(xiàn)AM136A）基因，通過檢測其表達水平，以及與腫瘤進展相關(guān)資料之間的關(guān)系，探討FAM136A在STAD進展的調(diào)控作用，進一步通過生物信息學(xué)分析，探究在STAD中FAM136A的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2017年6月-2018年12月沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除后并經(jīng)病理診斷確診的62例STAD標(biāo)本以及11例癌旁組織?；颊吣挲g38～82歲，平均（60.87±11.62）歲，男35例，女27例，病理學(xué)分級Ⅰ級26例，Ⅱ、Ⅲ級36例，出現(xiàn)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合衛(wèi)生部2010年發(fā)布的《胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)》;②根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會與國際抗癌聯(lián)盟（AJCC）第八版進行TNM分期。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料不完整;②術(shù)前接受過放射治療、化學(xué)藥物治療及免疫治療等輔助治療;③合并其他組織器官癌變。經(jīng)沈陽醫(yī)學(xué)院倫理委員會同意，患者均簽署了知情同意書。

1.2 生物信息學(xué)分析 通過Rstudio分析在TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選出FAM136A在STAD組織中的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于癌旁組織，并進一步分析其在STAD組織中的轉(zhuǎn)錄水平與其他腫瘤調(diào)控分子轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)性。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

1.3.1 主要試劑 PBS磷酸鹽緩沖液（pH 7.2～7.6）、抗原修復(fù)緩沖液（檸檬酸法，pH 6.0）、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、非免疫山羊血清封閉液、即用型免疫組化EliVision plus試劑盒（鼠/兔）、DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒等均購置于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，F(xiàn)AM136A抗體（兔抗人）購于臺灣Abnova公司，抗體稀釋液購于美國Cell Signaling Technology公司。

1.3.2 主要方法 STAD及癌旁組織標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定后，進行石蠟包埋，制作成厚度為4 μm的組織切片，所有切片均在統(tǒng)一條件下進行后續(xù)實驗，操作方法如下：（1）采用二甲苯及梯度酒精脫蠟并水化切片;（2）加入檸檬酸（pH 6.0）抗原修復(fù)液通過微波熱修復(fù)法進行抗原修復(fù);（3）經(jīng)PBS洗滌后滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑;（4）PBS洗滌后滴加非免疫山羊血清進行抗原封閉;（5）滴加FAM136A一抗（1︰800）4 ℃過夜孵育，同時采用PBS代替一抗作為空白對照;（6）滴加EliVision plus試劑盒中反應(yīng)增強液;（7）PBS洗滌后滴加酶標(biāo)抗小鼠/兔IgG聚合物，再次PBS洗滌;（8）顯色，二氨基聯(lián)苯胺DAB結(jié)合辣根過氧化物酶顯色;（9）蘇木素復(fù)染細(xì)胞核;（10）脫水、透明、封片、鏡檢。結(jié)果判定：在每張免疫組織化學(xué)染色切片中，隨機選取10個視野（400×），并隨機計數(shù)200個細(xì)胞，進行FAM136A陽性結(jié)果判定，判定標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）染色強度：0為沒有陽性染色，1為淺黃色，2為棕色，3為棕褐色;（2）陽性染色范圍：陽性染色細(xì)胞數(shù)<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項評分相乘得最終評分（0～12分），得分≤6分為低表達，>6分為高表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗;計數(shù)資料用率（%）表示，采用字2檢驗及Fisher確切概率法，通過Spearman方法分析TCGA數(shù)據(jù)庫中各基因表達的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FAM136A在STAD組織中表達水平 通過Rstudio分析TCGA數(shù)據(jù)庫中STAD及癌旁組織中差異表達的基因，篩選出FAM136A在STAD中轉(zhuǎn)錄水平（5.57±0.58）明顯高于癌旁組織（4.45±0.33），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

2.2 STAD組織中FAM136A的蛋白表達情況及其臨床病理學(xué)意義 STAD組織中FAM136A主要定位于細(xì)胞漿中（圖2）。62例STAD患者中38例（61.3%）為高表達，24例（38.7%）為低表達。分析臨床資料顯示，病理學(xué)分級Ⅰ級26例，其中12例（46.2%）FAM136A高表達，14例（53.8%）FAM136A低表達;Ⅱ、Ⅲ級共36例，其中26例（72.2%）FAM136A高表達，10例（27.8%）低表達（P=0.038）。分析T分期顯示，T1期為39例，其中20例（51.3%）FAM136A高表達，19例（48.7%）低表達;T2～4期為23例，其中18例（78.3%）FAM136A高表達，5例（21.7%）為低表達（P=0.035）。N0期為33例，其中16例（48.5%）FAM136A高表達，17例（51.5%）低表達，N1～3期為29例，其中22例（75.9%）FAM136A高表達，7例（24.1%）FAM136A低表達（P=0.027）。在STAD組織中，年齡、性別的FAM136A表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），病理分級、T分期、N分期的FAM136A表達情況比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。STAD組織中FAM136A蛋白表達水平（7.24±2.95）顯著高于癌旁組織（3.64±1.96），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000 2），見圖3。

2.3 FAM136A與STAD進展相關(guān)性的生物信息學(xué)分析 對TCGA數(shù)據(jù)庫中STAD數(shù)據(jù)分析顯示，F(xiàn)AM136A轉(zhuǎn)錄水平與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1（圖4A）、周期蛋白依賴性蛋白激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）（圖4B）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）（圖4C）及Snail1等促進腫瘤進展的關(guān)鍵分子轉(zhuǎn)錄水平均呈正相關(guān)（圖4D）（P<0.05）。

3 討論

FAM136A又可稱為FLJ14668，基因定位于染色體2p13.3，編碼蛋白表達于線粒體，蛋白序列在物種間高度保守，含有138個氨基酸，分子質(zhì)量為16 kDa，其確切生物功能尚不十分明確。據(jù)報道，F(xiàn)AM136A蛋白在人內(nèi)耳中表達，在內(nèi)耳發(fā)育過程中，F(xiàn)AM136和DTNA同時存在于耳蝸和前庭器官，F(xiàn)AM136A蛋白在小鼠內(nèi)耳中有差異表達[2-4]。在美尼爾綜合征中，發(fā)現(xiàn)FAM136A發(fā)生突變，F(xiàn)AM136A可能是早期內(nèi)耳發(fā)育的重要蛋白[5]。也有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM136A的表達與重癥肌無力的眼肌麻痹相關(guān)[6]。但其在腫瘤中的表達水平及表達意義尚未被揭示。序列相似家族成員中，有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM136B在維吾爾族食管癌患者中高表達，通過負(fù)向調(diào)控K乙酰轉(zhuǎn)移酶5發(fā)揮作用[7]。FAM83A在肺腺癌組織中高表達且與不良預(yù)后呈正相關(guān)[8-11]。這些研究提示序列相似家族成員在腫瘤中的調(diào)控作用需深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM136A蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，其在STAD組織中高表達并與腫瘤臨床分期、腫瘤浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。這提示FAM136A對STAD進展發(fā)揮促進作用，為進一步探究FAM136A調(diào)控STAD腫瘤進展的分子機制，筆者通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在STAD組織中，F(xiàn)AM136A轉(zhuǎn)錄水平與Cyclin D1、CDK4、MMP9及Snail1轉(zhuǎn)錄水平均呈正相關(guān)。Cyclin D1和CDK4為細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，Cyclin D1在G1早期表達，是細(xì)胞周期的啟動因子，也是生長感受器，Cyclin D1可與CDK4等蛋白結(jié)合，激活CDK激酶活性，促進細(xì)胞從G1到S期轉(zhuǎn)換，加速細(xì)胞增殖。在胃癌等多種腫瘤組織中，常發(fā)生Cyclin D1和CDK4過度表達活化進而加速腫瘤增殖[12-13]。FAM136A與Cyclin D1、CDK4轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)，提示FAM136A可能通過調(diào)控細(xì)胞周期促進STAD腫瘤增殖。在胃癌組織中，癌細(xì)胞常通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）破壞細(xì)胞間接觸并獲得運動轉(zhuǎn)移能力，Snail是EMT正向調(diào)節(jié)因子，常在胃癌等惡性腫瘤組織中高表達，通過抑制E-cadherin表達破壞細(xì)胞間接觸，Snail高表達常與腫瘤組織分級及局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14-17]。EMT轉(zhuǎn)化過程中，癌細(xì)胞還通過分泌并活化MMP9等蛋白酶破壞細(xì)胞外基質(zhì)，便于腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[18-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM136A在STAD組織高表達且與腫瘤組織學(xué)分級、局部浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，結(jié)合生物信息學(xué)分析提示FAM136A可能通過調(diào)控Cyclin D1、CDK4、MMP9及Snail1等分子促進腫瘤增殖，加速EMT轉(zhuǎn)化，促進腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移，其具體調(diào)控分子機制尚需進一步深入研究。

綜上所述，F(xiàn)AM136A在STAD組織中高表達且與腫瘤進展密切相關(guān)，F(xiàn)AM136A有可能成為STAD臨床診斷及治療的新靶點。

參考文獻

[1] Bray F，F(xiàn)erlay J，Soerjomataram I，et al.Global cancer statistics 2018： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].CA Cancer J Clin，2018，68（6）：394-424.

[2] Gallego-Martinez A，Lopez-Escamez J A.Genetic architecture of Meniere's disease[J].Hear Res，2019：107872.

[3] Lopez-Escamez J A，Batuecas-Caletrio A，Bisdorff A.Towards personalized medicine in Ménières disease[J].F1000 Res，2018，7：1295.

[4] Frejo L，Giegling I，Teggi R，et al.Genetics of vestibular disorders： pathophysiological insights[J].J Neurol，2016，263（Suppl 1）：S45-53.

[5] Requena T，Cabrera S，Martín-Sierra C，et al.Identification of two novel mutations in FAM136A and DTNA genes in autosomal-dominant familial Menieres disease[J].Hum Mol Genet，2015，24（4）：1119-1126.

[6] Nel M，Prince S，Heckmann J M.Profiling of patient-specific myocytes identifies altered gene expression in the ophthalmoplegic subphenotype of myasthenia gravis[J].Orphanet J Rare Dis，2019，14（1）：24.

[7] Liu J，Zhu J L，Zhang Y L，et al.Expression pattern of FAM135B and K （lysine） acetyltransferase 5 in esophageal squamous cell carcinoma in uygur patients[J].Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2018，38（2）：224-228.

[8]萬俊，王倩，趙倩茹，等.肺腺癌組織中FAM83A的表達[J].鄭州大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2018，53（6）：785-787.

[9]萬俊.FAM83A在肺腺癌中的表達及臨床意義[D].鄭州：鄭州大學(xué)，2019.

[10]何大川，龔道明，朱小波，等.肺腺癌組織FAM83A基因表達與預(yù)后相關(guān)性[J].中華腫瘤防治雜志，2019，26（4）：239-244.

[11]趙貝，常祺，錢凱，等.新基因FAM172A對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].暨南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版），2018，39（4）：287-298.

[12] Fan H N，Zhu M Y，Peng S Q，et al.Dihydroartemisinin inhibits the growth and invasion of gastric cancer cells by regulating cyclin D1-CDK4-Rb signaling[J].Pathol Res Pract，2019：152795.

[13] Moradi B M，Bahrami A，Khazaei M，et al.The prognostic value of cyclin D1 expression in the survival of cancer patients： A meta-analysis[J].Gene，2020，728：144283.

[14] Qu S，Yang Z，Tao H，et al.Semaphorin 6D and Snail are highly expressed in gastric cancer and positively correlated with malignant clinicopathological indexes[J].Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2019，35（10）：932-937.

[15] Zhang Y，Yuan Y，Zhang Y，et al.SNHG7 accelerates cell migration and invasion through regulating miR-34a-Snail-EMT axis in gastric cancer[J].Cell Cycle，2020，19（1）：142-152.

[16] Meza-Lopez M M，Siemann E.Warming alone increased exotic snail reproduction and together with eutrophication influenced snail growth in native wetlands but did not impact plants[J].Sci Total Environ，2020，704：135271.

[17] Horton A A，Newbold L K，Palacio-Cortés A M，et al.Accumulation of polybrominated diphenyl ethers and microbiome response in the great pond snail Lymnaea stagnalis with exposure to nylon （polyamide） microplastics[J].Ecotoxicol Environ Saf，2020，188：109882.

[18] Owyong M，Chou J，van den Bijgaart R J，et al.MMP9 modulates the metastatic cascade and immune landscape for breast cancer anti-metastatic therapy[J].Life Sci Alliance，2019，2（6）.

[19] Xu J，Yu Y，He X，et al.Tumor-associated macrophages induce invasion and poor prognosis in human gastric cancer in a cyclooxygenase-2/MMP9-dependent manner[J].Am J Transl Res，2019，11（9）：6040-6054.

[20]劉通，盧雨霖.FEP，EAP與FAM方案治療晚期胃癌的隨機研究[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，1997，13（7）：474-475.

[21]歐玉榮，康敏，周蕾，等.胃癌中幽門螺桿菌L型感染與MIF、MMP9、VEGF表達的關(guān)系[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，34（2）：180-187.

（收稿日期：2020-02-01） （本文編輯：張爽）