陳圳澤 曾偉超 鄭輝達 顏長江 許建華

【摘要】 目的：探討LINC01133在胃癌組織中的表達情況和對體外培養(yǎng)的胃癌細胞表型的影響。方法：采用qPCR檢測各組織細胞的LINC01133的表達水平。比較30例胃癌組織及其相應癌旁組織LINC01133的表達。比較正常胃黏膜上皮細胞（GES-1細胞）、人胃癌細胞（MGC-803、BGC-823）中LINC01133的表達水平。選擇LINC01133低表達的表達MGC-803細胞設置NC組（MGC-803細胞轉染過表達空質(zhì)粒組）與LINC01133組（MGC-803細胞轉染LINCO1133-pcDNA3.1質(zhì)粒組），比較兩組LINC01133的表達水平。采用CCK-8、流式細胞術、劃痕實驗檢測比較兩組細胞增殖、凋亡、遷移。結果：胃癌組織中LINC01133的表達水平明顯低于癌旁組織（P<0.05）。MGC-803細胞的LINC01133表達水平低于GES-1和BGC-823細胞（P<0.05）。LINC01133組LINC01133表達水平高于NC組（P<0.05）。LINC01133組細胞存活與遷移速率均低于NC組，而細胞凋亡率高于NC組（P<0.05）。結論：LINC01133在胃癌組織中表達下調(diào)，LINC01133表達可抑制胃癌細胞增殖、遷移，促進細胞凋亡，在胃癌發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因的作用，LINC01133低表達可能是胃癌患者的一個不良因素，有望成為胃癌診斷和治療中新的研究靶點。

【關鍵詞】 LINC01133 胃癌 增殖 凋亡

[Abstract] Objective： To investigate the expression of LINC01133 in gastric cancer tissues and its effect on the phenotypic of gastric cancer cells cultured in vitro. Method： The expression level of LINC01133 in each tissue cell was detected by qPCR. The expression of LINC01133 in 30 cases of gastric cancer and its adjacent tissues were compared. MGC-803 cells with low expression of LINC01133 were selected to set up NC group （MGC-803 cells transfected with empty plasmid group） and LINC01133 group （MGC-803 cells transfected with LINCO1133-pcDNA3.1 plasmid group）， and the expression levels of LINC01133 in the two groups were compared. CCK-8， flow cytometry and scratch test were used to compare the proliferation， apoptosis and migration of cells in the two groups. Result： The expression level of LINC01133 in gastric cancer tissues was significantly lower than that in adjacent tissues （P<0.05）. The LINC01133 expression level of MGC-803 cell was lower than those of GES-1 and BGC-823 cells （P<0.05）. The expression level of LINC01133 in LINC01133 group was higher than that in NC group （P<0.05）. The survival and migration rates of LINC01133 cells were lower than those of NC group， while the apoptosis rate was higher than that of NC group （P<0.05）. Conclusion： The expression of LINC01133 is down-regulated in gastric cancer tissues， and the expression of LINC01133 can inhibit the proliferation and migration of gastric cancer cells， promote cell apoptosis， and play a role of tumor suppressor gene in the development of gastric cancer. The low expression of LINC01133 may be an adverse factor in patients with gastric cancer， which is expected to become a new research target in the diagnosis and treatment of gastric cancer.

[Key words] LINC01133 Gastric cancer Growth Apoptosis

First-authors address： The Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University， Quanzhou 362000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.23.004

胃癌已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)導致死亡的主要原因，尤其在日本、韓國和中國等東亞國家發(fā)病率較高[1-4]。當今胃癌患者的生存率已經(jīng)有了很大的提高，但由于胃癌可以向淋巴結、肝臟、腹腔轉移和擴散，其預后較差，5年生存率低于30%[5]。目前，胃癌的早期治療主要是手術方式，大多數(shù)胃癌被檢出時已為進展期，因此，探索胃癌浸潤、轉移機制具有重要意義。

長鏈非編碼RNA（long non-protein coding RNA，lncRNA）是非蛋白編碼RNA的一種，長度大于200 nt[6]。如今，越來越多的證據(jù)表明lncRNA通過基因水平、轉錄水平和翻譯水平來調(diào)節(jié)生物學過程中多種活動，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[7]。目前已經(jīng)鑒定出許多功能性lncRNA，例如lncRNA MEG3能夠抑制宮頸癌細胞的增殖能力，在人宮頸癌組織中MEG3表達明顯下調(diào)，表明lncRNA MEG3發(fā)揮重要的抑癌基因功能[8]。在肝臟中發(fā)現(xiàn)lncRNA LALR1能夠促進肝細胞增殖，在肝組織再生過程中發(fā)揮重要作用[9]。lncRNA MVIH在肝腫瘤組織中高表達，能促進血管生成，并帶來更差的預后[10]。眾多研究發(fā)現(xiàn)lncRNA還可作為潛在的生物標志物，有助于腫瘤的輔助診斷和判斷預后，其在胃癌發(fā)展中的重要作用也被廣泛報道[6]。

在既往研究中，存在LINC01133在膽囊癌、結直腸癌、非小細胞肺癌、肺鱗狀細胞癌及骨肉瘤中表達的探討[11-15]。檢索GEO（gene expression omnibus）數(shù)據(jù)庫GSE54129，GSE69963、GSE15495、GSE22366數(shù)據(jù)集和TCGA（the cancer genome atlas）數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)LINC01133基因與胃癌的預后相關，高表達LINC01133的胃癌患者總生存時間更長。本課題通過組織和細胞兩個層次開展對胃癌LINC01133的表達水平和細胞表型的研究，揭示LINC01133基因在胃癌發(fā)展的作用，以此來促進針對該疾病的lncRNA指導的診斷和治療方法的發(fā)展，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本和細胞株 胃癌組織標本收集于2008-2012年，購自上海芯超生物科技有限公司。包括30例胃癌組織和癌旁組織冰凍樣本的RNA反轉錄成的cDNA。所有標本的使用均征得了上海芯超生物科技有限公司倫理委員會同意。正常胃黏膜上皮細胞（GES-1細胞）、人胃癌細胞（MGC-803、BGC-823）來自福建醫(yī)科大學干細胞醫(yī)學研究所冷凍保存。

1.1.2 主要試劑 完全DMEM培養(yǎng)基、CCK8法細胞增殖檢測試劑（KGA316）購自芯超生物，HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒（CW2569M）、UltraSYBR Mixture（CW0956M）購自CWBIO 康為世紀，qPCR試劑盒購自Takara，Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit（AP101-100-kit）、Cell Cycle Staining Kit（CCS102）、質(zhì)粒小提試劑盒（DP103-02）、pcDNA3.1（+）vetor，過表達空質(zhì)粒、LINCO1133-pcDNA3.1質(zhì)粒購自中洪博元生物。

1.2 方法

1.2.1 qPCR檢測 Trizon法提取胃癌、癌旁組織、GES-1、MGC-803、BGC-823細胞的總RNA，逆轉錄合成cDNA，熒光PCR儀檢測LINC01133的表達水平。相應引物：LncRNA01133 F：CTCCCCACCAGAAAGTCCT，LncRNA01133 R：TCCCTATGCCCTCAAACC，GAPDH F：GAAGGTCGGAGTCAACGGAT，GAPDH R：CCTGGAAGATGGTGATGGG。PCR數(shù)據(jù)分析方法使用2-△△Ct法。由此選擇LINC01133低表達的MGC-803細胞進行后續(xù)試驗。

1.2.2 實驗分組 NC組（MGC-803細胞轉染過表達空質(zhì)粒組）與LINC01133組（MGC-803細胞轉染LINCO1133-pcDNA3.1質(zhì)粒組）。

1.2.3 細胞培養(yǎng)及轉染 MGC-803細胞在含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱。細胞密度達60%時，準備轉染。DNA轉染（MGC-803細胞）：EP管2個，即NC組與LINC01133組，每管加125 μL Opti-MEM，NC組加入5 μL lipofectamine 3000，LINC01133組加入2.5 μg質(zhì)粒、5μL P3000，混勻滴到6孔板中，4 h后6孔板中加入血清含量20%的完全培養(yǎng)基1 mL，48 h后進行相應檢測。

1.2.4 CCK8法 生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期的MGC-803細胞，每孔按4×103個接種至96孔板中，根據(jù)上述分組進行細胞轉染和加藥物處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄含藥培養(yǎng)基，每孔加10 μL的毒性檢測液CCK8，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，用酶標儀測波長為450 nm的OD值。實驗重復3次，取實驗結果的平均值作為最終結果。

1.2.5 流式細胞術 取兩組生長狀態(tài)好的對數(shù)生長期細胞，每孔按4×103個接種至12孔板中，每組設置3復孔，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)上述分組進行細胞轉染和加藥物處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，PBS洗細胞兩次，加Annexin V/PI檢測試劑盒，流式檢測儀檢測細胞凋亡。

1.2.6 劃痕實驗 用marker筆在24孔板背后，用直尺比著孔的正中央，均勻地畫橫線，橫穿過孔。分別加入兩組細胞，約5×105個，掌握為過夜能鋪滿。第二天用槍頭比著直尺，垂至于背后的橫線劃痕。48 h后再次給每孔的劃痕拍照。根據(jù)劃痕情況確定使用48 h劃痕數(shù)據(jù)與0 h劃痕數(shù)據(jù)求出對應的劃痕寬度，進而計算出細胞的遷移速率。遷移速率=遷移距離/遷移時間。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有實驗均進行3次生物學重復。應用SPSS 20.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析，計量資料用（x±s），比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織與癌旁組織中LINC01133的表達 胃癌組織中LINC01133的表達水平（0.002 8±0.000 6）明顯低于癌旁組織（0.023 2±0.005 1），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1。

2.2 GES-1、MGC-803、BGC-823細胞中LINC01133表達比較 MGC-803細胞的LINC01133表達水平（0.000 7±0.000 1）低于GES-1細胞（1.000 0±0.000 0）和BGC-823細胞（0.967 6±0.121 9），差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖2。

2.3 NC組與LINC01133組中的LINC01133表達情況比較 LINC01133組LINC01133表達水平（81 007.072 1±7 801.458 5）高于NC組（1.000 0±0.000 0），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖3。

2.4 NC組與LINC01133組細胞增殖、凋亡、遷移情況比較 LINC01133組細胞存活率（81.11±0.82）%低于NC組（95.68±0.92）%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖4。NC組凋亡率（24.25±3.69）%低于LINC01133組（90.06±5.16）%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖5。LINC01133組遷移速率（1.61±0.16）μm/h低于NC組（2.51±0.11）μm/h，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖6。

3 討論

lncRNA是一類轉錄本長度大于200個核苷酸不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子。lncRNA的作用模式包括（1）與編碼基因上游的啟動子區(qū)結合;（2）與基因競爭結合轉錄因子;（3）腳手架結構作用;（4）與蛋白編碼基因的轉錄本形成互補雙鏈;（5）結合到特定蛋白上，改變該蛋白的活性;（6）作為miRNA的靶分子，或者前體分子[8]。成千上萬的lncRNA包含在癌癥基因組中，表明它們可能是癌癥生物學的潛在驅動因素并且可用作臨床生物標志物[16]。

許多文獻已經(jīng)報道lncRNA在胃癌組織與非腫瘤組織中表達差異，下調(diào)和上調(diào)lncRNA基因表達均影響著疾病過程。Sun等[17]發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼HOXA11-AS在胃癌中特異性上調(diào)，并通過體內(nèi)、體外實驗證明了HOXA11-AS促進胃癌細胞增殖，遷移和侵襲并抑制細胞凋亡。并發(fā)現(xiàn)GAS5在患者胃癌組織中表達下降，抑制其表達則能夠促進胃癌細胞的生長[18]。同年發(fā)現(xiàn)MEG3在胃癌和癌旁檢測后，特異性低表達，敲減MEG3后促進細胞增殖，過表達后細胞增殖抑制[19]。

lncRNA作為醫(yī)學科研領域的研究熱點，本研究結合當今熱點lncRNA和臨床胃癌疾病進行分析。在30例胃癌組織及其配對癌旁組織進行了差異表達檢測，發(fā)現(xiàn)較癌旁組織，LINC01133在胃癌組織中呈低表達，表明胃癌組織中LINC01133表達缺失，但是相關實驗研究表明在膽囊癌和非小細胞肺癌，癌組織中LINC01133表達相對癌旁組織上調(diào)，表明了LINC01133的表達具有組織和器官的特異性，在不同器官腫瘤中特異性表達[13，20]。結合數(shù)據(jù)庫的生存分析，高表達LINC01133的胃癌患者有更高生存率，說明LINC01133與胃癌預后相關。LINC01133表達具有抑制胃癌細胞增殖、遷移、侵襲和促進其凋亡的能力，在明確其表型及臨床樣本的表達意義后，就需要對其機制調(diào)控研究進行深入挖掘，以明確其作用機制。

首先，LINC01133具有抑制胃癌細胞增殖的能力，Wu等[11]研究發(fā)現(xiàn)LINC01133在膽囊癌組織轉錄水平顯著高于相應的非腫瘤組織，促進腫瘤增殖，并激活AKT-mTOR，mTOR是PI3K-AKT下游的一種重要的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，通過激活核糖體激酶來調(diào)節(jié)細胞增殖和存活，mTOR信號通路可影響基因轉錄及蛋白質(zhì)合成，在細胞增殖中起重要作用。其次，LINC01133表達具有抑制胃癌細胞遷移和侵襲的能力，Kong等[12]發(fā)現(xiàn)LINC01133在結直腸癌細胞中相對癌旁組織低表達，作為抑癌基因，抑制結直腸癌細胞侵襲和轉移，參與上皮間質(zhì)轉化，表達受到TGF-β信號通路抑制。TGF-β信號轉導調(diào)控機制多種多樣，TGF-β信號通路激活具有促癌作用，大多發(fā)生在癌癥晚期，可通過促進腫瘤轉移及細胞免疫逃逸，以及促進血管的產(chǎn)生發(fā)揮它的促癌作用，也可通過激活經(jīng)典Smad通路和非經(jīng)典Smad通路，來促進上皮間質(zhì)轉化，使得癌細胞向其他組織擴散。LINC01133抑制胃癌細胞遷移和侵襲作用可能與TGF-β信號通路的激活有關。

綜上所述，LINC01133在胃癌組織中表達下調(diào)，LINC01133表達可抑制胃癌細胞增殖、遷移，促進細胞凋亡，在胃癌發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因的作用，LINC01133低表達可能是胃癌患者的一個不良因素，有望成為胃癌診斷和治療中新的研究靶點。

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（收稿日期：2020-01-18） （本文編輯：田婧）