王國強(qiáng) 李欣欣 蘇運(yùn)芳 曾華輝 馬紅芳 劉保光 尚立芝 張振強(qiáng)

摘要：[目的]以MS2噬菌體外殼蛋白為載體，構(gòu)建展示豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白上線性表位的嵌合納米顆粒，并研究其免疫原性，為豬繁殖與呼吸綜合征病毒或其他病毒表位展示提供新的方法和思路。[方法]利用重疊延伸PCR將GP5上優(yōu)勢線性表位基因序列插入到MS2噬菌體外殼蛋白基因上，構(gòu)建重組載體，通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)嵌合蛋白，目的蛋白經(jīng)過硫酸銨沉淀和凝膠過濾層析純化，用動態(tài)光散射和電鏡對嵌合蛋白進(jìn)行物理表征，通過蛋白印跡和動物免疫試驗(yàn)研究表位嵌合顆粒的免疫原性。[結(jié)果]成功將線性表位基因插人MS2噬菌體外殼蛋白基因，嵌合蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中以水溶性表達(dá)，目的蛋白經(jīng)過純化，純度達(dá)85%以上。嵌合蛋白在體外自組裝形成了均一的、直徑為25～31nm的嵌合表位納米顆粒，該嵌合顆粒免疫動物后，產(chǎn)生可以和滅活病毒反應(yīng)的高水平抗體，具有良好的免疫原性。[結(jié)論]MS2噬菌體外殼蛋白可以耐受9個外源多肽（豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5上線性表位）的插人，在體外自組裝形成嵌合病毒樣顆粒。該顆粒將外源多肽高密度展示在表面，免疫動物可產(chǎn)生針對該表位的抗體。該技術(shù)可為豬繁殖與呼吸綜合征病毒其他表位或更長串聯(lián)表位的展示奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：MS2噬菌體;線性表位;嵌合納米顆粒;豬繁殖與呼吸綜合征病毒

中圖分類號：Q78

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-0384（2020）06061808

0引言

[研究意義]豬繁殖與呼吸綜合征（PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，PRRS）是由高度遺傳多樣性的RNA病毒豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus，PRRSV）引起的以妊娠母豬厭食、繁殖障礙、各年齡段豬的呼吸道疾病和新生及斷奶仔豬高病死率為特征的高度接觸性傳染病，是危害我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要呼吸傳染病之一口。2006年，我國首次爆發(fā)高致病性PRRS（Highly-pathogenicPRRS，HP-PRRS），與傳統(tǒng)的PRRS相比，HP-PRRS可引起更高發(fā)病率和死亡率。目前，PRRSV沒有有效的治療藥物，免疫接種是預(yù)防該病的有效措施。國內(nèi)上市的滅活苗或弱毒苗對控制PRRSV流行做出了貢獻(xiàn)，但由于滅活苗不能復(fù)制，需多次免疫，弱毒苗具有病毒返強(qiáng)的潛在安全性，以及現(xiàn)行技術(shù)均不能區(qū)分感染動物和免疫動物、存在抗體依賴性增強(qiáng)作用（AntibodyDependentEnhancement，ADE）等問題，PRRS在國內(nèi)仍沒有完全控制，豬場感染率依舊很高。因此，開展PRRS新型表位疫苗以及提高表位疫苗穩(wěn)定性和免疫原性的研究具有重要意義。[前人研究進(jìn)展]囊膜糖蛋白（GP5）、基質(zhì)蛋白（M）及核衣殼蛋白（N）為PRRSV病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白”。N蛋白高度保守，在感染動物血清中相應(yīng)抗體出現(xiàn)較早，被廣泛用于PRRSV抗體的血清學(xué)診斷，但N蛋白的抗體均為非中和抗體，不適合作為疫苗候選蛋白5-。GP5蛋白是PRRSV最重要的免疫原性蛋白，參與病毒人侵宿主細(xì)胞的過程，含有病毒中和作用和免疫保護(hù)相關(guān)的抗原表位，在感染PRRSV后康復(fù)的豬血清中，大部分中和抗體主要針對GP5蛋白一。在2002年，Ostrowski等9利用噬菌體隨機(jī)12肽展示技術(shù)從PRRSV的GP5蛋白上鑒定出SHF/LQLIYNL，是一個主要線性表位。陳如敬等選取PRSVGP5蛋白的抗原表位（aa31～37）和（aal92～198）進(jìn)行串聯(lián)后表達(dá)，Westernblotting顯示具有良好的免疫學(xué)活性。Peabody等將HIVgpl20的V3環(huán)多肽和HV共受體CCR5的ECL2環(huán)多肽以單鏈二聚體插人MS2外殼蛋白的ABLoop，免疫動物后，展示的多肽顯示強(qiáng)的免疫原性;Zhai等2-13在噬菌體MS2病毒樣顆粒（VLP）的表面上展示了串聯(lián)的HPVL2肽（aa17～31），嵌合顆粒免疫的小鼠產(chǎn)生了針對單個L2表位的高滴度抗體，抗血清提供了攻毒保護(hù)。Dong等叫將FMDVVP1上第141～160位氨基酸展示在MS2病毒樣顆粒外表面，同時將FMDV的3D基因的反義RNA包裝在MS2內(nèi)部，該雙重效能的嵌合病毒樣顆粒疫苗可保護(hù)40%的乳鼠和85%（17/20）的豚鼠免受口蹄疫病毒的侵害。[本研究切人點(diǎn)]目前關(guān)于將PRRSVGP5線性表位展示在MS2噬菌體外殼蛋白表面，在體外通過自組裝形成嵌合表位病毒樣顆粒以及嵌合顆粒免疫原性的研究尚未見報(bào)道，通過原核系統(tǒng)表達(dá)和制備嵌合表位病毒樣顆粒并驗(yàn)證展示表位的免疫原性，對PRRSV表位的研究和應(yīng)用具有重要意義。[擬解決的關(guān)鍵問題]本研究通過構(gòu)建包含MS2噬菌體外殼蛋白和PRRSVGP5蛋白線性表位的原核表達(dá)載體，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白，該重組蛋白能夠不受外源多肽插入的影響，在體外自組裝形成嵌合病毒樣顆粒，建立純化方法，為進(jìn)一步研究、制備和應(yīng)用其他嵌合表位病毒樣顆粒提供思路和奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌株、質(zhì)粒和主要試劑表達(dá)菌株Rosetta（DE3），質(zhì)粒pET28a（+）和pUC57載體（包含大腸桿菌噬菌體MS2結(jié)構(gòu)基因成熟酶蛋白和衣殼蛋白基因）為本實(shí)驗(yàn)室保存;限制性內(nèi)切酶BamHI和NheI、TsDNA連接酶購自NEB（北京），DNAMarker和ProteinMarker購自北京索萊寶科技有限公司;其他化學(xué)試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2試驗(yàn)動物和陽性血清豚鼠購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，PRRSVCH-IR弱毒株和PRRSV豬感染強(qiáng)陽性血清由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗豚鼠二抗購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.1.3引物根據(jù)pUC57載體（包含大腸桿菌噬菌體MS2結(jié)構(gòu)基因成熟酶蛋白和衣殼蛋白基因）基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增MS2蛋白外殼（CP）基因的引物，上下游引物分別加NheI和BamHI酶切位點(diǎn)以及相應(yīng)的保護(hù)性堿基。根據(jù)GenBank：AAD12129.1和GenBank：U87392.3上GP5線性表位Bl（aa37～45）氨基酸序列和核苷酸序列設(shè)計(jì)兩對引物，用于擴(kuò)增插入的9個多肽（B1）序列，引物見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1重組載體構(gòu)建利用OE-PCR技術(shù)，參考前期試驗(yàn)嗎，擴(kuò)增出目的嵌合片段CP-B1。片段CP-B1和質(zhì)粒pET28a（+）分別經(jīng)NheI和BamHI雙酶切、回收和連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布卡那霉素抗性平板，37C培養(yǎng)過夜，挑選單克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，菌落PCR、提取質(zhì)粒雙酶切和測序鑒定正確的質(zhì)粒命名為pET28a（+）/CP-B1。

1.2.2嵌合重組蛋白的表達(dá)與純化測序正確的質(zhì)粒pET28a（+）/CP-B1轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，37C培養(yǎng)過夜，挑取單克隆于含有卡那霉素抗性的液體培養(yǎng)基中37C培養(yǎng)2～3h，至OD600值為0.5～0.7，加人異丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度0.2mmolL，20C振蕩誘導(dǎo)表達(dá)18h。10000r*min，離心10min收集菌體，pH8.0、50mmolLTris緩沖液重懸菌體，冰浴條件下超聲破碎，12000rmin離心10min，收集上清。

在4C冰浴攪拌條件下，往上清中緩慢加入飽和硫酸銨至最終質(zhì)量濃度為30%，繼續(xù)攪拌30min。12000rmin離心20min，棄上清，pH8.0、50mmolLTTris緩沖液重懸沉淀，0.45ym針頭濾器過濾，過濾樣品通過Sephacryls-1000凝膠過濾層析柱純化：3倍柱床體積的50mmolLrTris緩沖液平衡柱子，加入相當(dāng)于柱床體積1%～5%的蛋白質(zhì)樣品，根據(jù)A280收集每個流出峰，每個峰加入5X蛋白上樣Buffer，沸水煮10min，進(jìn)行SDS-PAGE。

1.2.3嵌合蛋白的物理表征純化的目的蛋白通過

透射電子顯微鏡和電位及粒度分析儀進(jìn)行物理表征。嵌合顆粒用JEM-1400（日本）透射電子顯微鏡，在2%磷鎢酸復(fù)染，100kV加速電壓條件下，觀察顆粒粒徑和均一度，用布魯克海文儀器電位及粒度分析儀（美國90PlusPALS）測量顆粒的粒徑和分布。1.2.4嵌合顆粒的免疫原性分析免疫印跡檢測：將菌體破碎上清、硫酸銨沉淀重懸液和凝膠過濾層析純化第一個峰值蛋白濃縮液經(jīng)sDS一PAGE電泳后，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。0.5%脫脂牛奶37C封閉2h，PBST洗滌5次，每次5min，加入稀釋的豬抗PRRSV高免血清，置37C，孵育2h棄抗體。PBST洗滌5次。加人辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗豬血清（1：2000稀釋），37C，孵育1h，棄抗體，洗滌5次，通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法ECL顯色液顯色。

隨機(jī)將20只200～250g的豚鼠分為4組，試驗(yàn)組、陰性組對照組和陽性對照組（不同劑量），每組5只。陰性對照組用PBS和佐劑（ISA206）乳化制備，陽性對照組用滅活疫苗進(jìn)行免疫，試驗(yàn)組分別用10yg：只一和20yg：只1嵌合顆粒與佐劑（ISA206）乳化制備，制備好的疫苗于豚鼠后肢外側(cè)肌肉注射，免疫兩次，0d和14d各免疫1次。分別在免疫前（0d）、7d、14d、21d、28d、35d和42d對豚鼠前腿內(nèi)側(cè)采血。全血37C放置2h，4C靜置4h，4000r.min離心7min，分離血清待用。用病毒作為抗原包被的ELISA板檢測待測血清（1/100稀釋）抗體水平。

2結(jié)果與分析

2.1重組質(zhì)粒構(gòu)建

2.1.1嵌合片段擴(kuò)增以pUC57載體（包含大腸桿菌噬菌體MS2結(jié)構(gòu)基因成熟酶蛋白和衣殼蛋白基因）為模板，以CP-F和IN-R為引物，擴(kuò)增上游片段，大小為80bp左右;以IN-F和CP-R為引物，擴(kuò)增下游片段，大小為350bp。上下游片段擴(kuò)增產(chǎn)物回收后，作為模板，以CP-F和CP-R為引物擴(kuò)增全長CP-B1，全長大小為430bp。片段大小和預(yù)期相符（圖1）。

2.1.2重組載體連接和鑒定全長CP-B1和質(zhì)粒pET28a（+）分別經(jīng)過NheI和BamHI雙酶切，回收后的線性化載體和片段以1：5摩爾比進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞。菌落PCR鑒定后，提取質(zhì)粒雙酶切（圖2）和測序鑒定，正確的重組質(zhì)粒命名為pET28a（+）/CP-Bl。

2.2嵌合重組蛋白的表達(dá)和純化

表達(dá)菌株Rosetta（DE3）/pET28a（+）/CP-Bl經(jīng)過IPTG在20C低溫誘導(dǎo)后，超聲破菌，上清經(jīng)30%的硫酸銨沉淀，去除了一部分雜蛋白（圖3-a），沉淀重懸，過分子篩。通過分子篩在線檢測可以看出，目的蛋白最先流出（第一個峰），說明目的蛋白是一個大分子聚體（圖3b）。

2.3嵌合表位納米顆粒的物理表征

凝膠過濾層析純化的大分子嵌合蛋白樣品用粒度分析儀檢測蛋白粒徑和均一度，結(jié)果顯示：粒徑為28nm左右，且均一度良好（圖4-a）。同時，目的蛋白5倍稀釋后，磷鎢酸染色滴膜，觀察期顆粒形成情況和粒徑大小，電鏡觀察結(jié)果表明嵌合蛋白在體外自組裝形成了VLP，且粒徑為25～31nm，與動態(tài)光散射（DLS）一致（圖4-b）。

2.4嵌合表位納米顆粒的免疫原性分析

2.4.1嵌合蛋白免疫印跡菌體破碎上清、硫酸銨沉淀重懸液、凝膠過濾層析純化蛋白與PRRSV高免血清進(jìn)行Westernblotting，結(jié)果顯示含目的嵌合蛋白的菌體超聲上清和純化后目的嵌合蛋白均可以和PRRSV高免血清發(fā)生特異性反應(yīng)，在14kDa出現(xiàn)免疫印跡條帶（圖5-a），表明嵌合PRRSVGP5蛋白，上線性表位B1的納米顆粒具有良好的反應(yīng)原性。

2.4.2嵌合納米顆粒的免疫原性取0、7、14、212835和42d豚鼠血清，PBS（1/100）稀釋后，用包被有PRRS滅活病毒的酶標(biāo)板，通過間接ELISA檢測。檢測結(jié)果顯示：10ug和20yg嵌合有GP5蛋白上線性表位的納米顆粒，在一次免疫豚鼠后第14d分離的血清可以和滅活PRRS病毒發(fā)生反應(yīng)，二免后7d（一免后第21d）產(chǎn)生了可以和病毒反應(yīng)更高水平的特異性抗體;相較于10yg：只，20yg：只T嵌合納米顆粒刺激產(chǎn)生了更高水平的抗體，具有劑量依賴效應(yīng)。陽性對照在一免和二免后均產(chǎn)生了可以和滅活病毒反應(yīng)的高水平抗體，且高于嵌合納米顆粒（圖5-b）。陰性對照（PBS組）血清不和滅活病毒反應(yīng)。

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（責(zé)任編輯：張梅）

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