張 璐，姜志戎，尹 萌，胡 旭，朱殿雨，田 靜

（1.揚州市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 揚州225000；2.寶應(yīng)縣中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 揚州225800）

益腎壯骨丸是寶應(yīng)縣中醫(yī)醫(yī)院獲得專利授權(quán)的獨家制劑，由山萸肉、枸杞子、杜仲、白芍、赤芍等10余味中藥組方，具有補益肝腎、壯骨強身、活絡(luò)通經(jīng)的功效，主要用于肝腎虧虛、筋骨瘺弱引起的腰腿痛、關(guān)節(jié)痛、腰膝酸軟、四肢無力等病癥，臨床應(yīng)用廣泛且療效確切[1]。方中山萸肉為君藥，白芍和赤芍為臣藥，莫諾苷、馬錢苷為山萸肉的主要活性成分[2－6]，芍藥苷為白芍和赤芍的主要活性成分[7－11]。本方藥味較多，但現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅有性狀鑒別和常規(guī)檢查項，無法有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。本研究中以芍藥苷、莫諾苷和馬錢苷為指標(biāo)成分，建立了同時測定益腎壯骨丸中3種成分含量的高效液相色譜（HPLC）法[12－13]?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀（包含DAD檢測器，美國安捷倫科技有限公司）；Mettler Toledo XS205 DU型分析天平（瑞士梅特勒－托利多公司，精度為十萬分之一）；KH－400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為50 kHz）；OGH60型電熱恒溫干燥箱（美國賽默飛世爾科技公司）；Milli－Q型超純水儀（美國密理博公司）；BT－150型多功能粉碎機（浙江拜杰電器有限公司，功率為550 W，頻率為50～60 Hz）。

1.2 試藥

益腎壯骨丸（寶應(yīng)縣中醫(yī)醫(yī)院，批號分別為20181119，20181203，20181218，規(guī)格為每盒45 g）；芍藥苷對照品（批號為110736－201741，含量為95.7%），莫諾苷對照品（批號為111998－201602，含量為96.3%），馬錢苷對照品（批號為111640－201808，含量為99%；批號為111640－201606，含量為98.3%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈(色譜純，北京迪馬科技有限公司）；甲醇、乙醇、磷酸(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）－0.3%磷酸溶液（B），梯度洗脫程序見表1；流速：1 mL／min；檢測波長：230 nm（芍藥苷），240 nm（莫諾苷、馬錢苷）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

供試品溶液：取樣品粉末（過5號篩）5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為300 W，頻率為50 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

混合對照品溶液：分別取芍藥苷、莫諾苷和馬錢苷對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，分別制成質(zhì)量濃度1.172，0.587，1.019 mg／mL的對照品貯備液。精密吸取芍藥苷貯備液5 mL、莫諾苷貯備液1 mL、馬錢苷貯備液3 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成每1 mL含芍藥苷586.0μg、莫諾苷58.7μg、馬錢苷305.7μg的混合對照品溶液，避光保存。再用甲醇稀釋成每1 mL含芍藥苷293.0μg、莫諾苷29.4μg、馬錢苷152.9μg的混合對照品溶液。

陰性對照品溶液：按處方比例和制備工藝制備缺山萸肉、白芍和赤芍（芍藥苷）的陰性樣品，取陰性樣品粉末，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各10μL，注入液相色譜儀測定，記錄色譜圖。結(jié)果見圖1。芍藥苷、莫諾苷和馬錢苷色譜峰的理論板數(shù)均不低于5 000，與相鄰峰的分離度均大于1.5。

專屬性試驗：分別取不同批次（批號分別為20181119，2181203，20181218）樣品及山茱萸、芍藥苷陰性樣品粉末，依法制備供試品溶液和陰性對照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，并記錄色譜圖。詳見圖1。結(jié)果3批樣品均檢出莫諾苷、馬錢苷和芍藥苷的色譜峰，陰性樣品均未檢出相應(yīng)色譜峰，益腎壯骨丸中其他成分對芍藥苷、莫諾苷和馬錢苷未造成干擾，表明方法專屬性良好。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：取混合對照品貯備液適量，用甲醇稀釋成6個不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，芍藥苷質(zhì)量濃度分別為29.30，58.60，117.20，293.00，468.80，586.00μg／mL，莫諾苷質(zhì)量濃度分別為2.94，5.87，11.75，29.37，46.99，58.74μg／mL，馬錢苷質(zhì)量濃度分別為15.29，30.57，61.14，152.85，244.56，305.70μg／mL。取上述溶液各10μL，分別注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖。以各對照品的質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得芍藥苷、莫諾苷、馬錢苷的回歸方程，Y芍＝14 678 X芍＋9 569（r＝0.999 8），Y莫＝16 194 X莫＋4 280（r＝0.999 7），Y馬＝16 186 X馬＋9 019（r＝1.000 0）。結(jié)果表明，芍藥苷、莫諾苷和馬錢苷的質(zhì)量濃度分別在29.30～586.00，2.94～58.74，15.29～305.70μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限與定量限確定：分別取芍藥苷、莫諾苷、馬錢苷對照品貯備液適量，加甲醇稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度的溶液，取10μL進(jìn)樣分析。以信噪比（S／N）＝3為指標(biāo)，結(jié)果芍藥苷進(jìn)樣質(zhì)量濃度為0.44μg／mL，即檢測限為4.4×10－3μg；莫諾苷進(jìn)樣質(zhì)量濃度為0.29μg／mL，即檢測限為2.9×10－3μg；馬錢苷進(jìn)樣質(zhì)量濃度為0.31μg／mL，即檢測限為3.1×10－3μg。以S／N＝10為指標(biāo)，結(jié)果芍藥苷進(jìn)樣質(zhì)量濃度為1.46μg／mL，即定量限為14.6×10－3μg；莫諾苷進(jìn)樣質(zhì)量濃度為0.98μg／mL，即定量限為9.8×10－3μg；馬錢苷進(jìn)樣質(zhì)量濃度為1.02μg／mL，即定量限為10.2×10－3μg。

精密度試驗：取混合對照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果芍藥苷、莫諾苷和馬錢苷峰面積的RSD分別為0.53%，0.99%，0.55%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取樣品（批號為20181119）粉末，依法平行制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，計算含量。結(jié)果芍藥苷、莫諾苷和馬錢苷含量的RSD分別為0.57%，0.84%，0.69%(n＝6)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（批號為20181119）粉末，依法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，4，8，12 h后按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果芍藥苷、莫諾苷和馬錢苷的峰面積均無明顯變化，RSD均小于1%(n＝4)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取樣品（批號為20181119）粉末（過5號篩）2.5 g，精密稱定，精密加入含芍藥苷293.0μg、莫諾苷29.4μg、馬錢苷152.9μg的混合對照品溶液15 mL，平行制備6份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，測定各待測成分含量，并計算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗（n＝6）

耐用性考察：分別采用Agilent1260型和Waters e2695型液相色譜儀，以及Agilent Eclipse XDB－C18、Inertsil ODS－SP C18、Alltima C18色譜柱測定對照品溶液和供試品溶液，結(jié)果待測成分分離均較好，對含量測定結(jié)果也無影響，表明該方法耐用性良好。

2.4 樣品含量測定

取不同批次（批號分別為20181119，20181203，20181218）樣品粉末，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定各待測成分含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（mg／g）

3 討論

3.1 色譜條件選擇

分別考察了乙腈－磷酸、乙腈－水、甲醇－醋酸的流動相體系，并綜合比較峰形、分離度、出峰時間等參數(shù)，選擇以乙腈－0.3%磷酸溶液梯度洗脫為流動相。在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，選擇有最大吸收且干擾峰較少的230 nm波長測定芍藥苷，240 nm波長測定莫諾苷、馬錢苷。

3.2 樣品前處理方法考察

提取溶劑與提取方法：取樣品（批號為20181218）粉末（過5號篩）5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，共8份。分別為甲醇加熱回流組、甲醇超聲組、70%甲醇加熱回流組、70%甲醇超聲組、乙醇加熱回流組、乙醇超聲組、70%乙醇加熱回流組和70%乙醇超聲組，分別精密加入對應(yīng)提取溶劑50 mL，并按對應(yīng)提取方法提取30 min，考察待測成分的含量。結(jié)果表明，甲醇提取的各待測成分的含量均大于乙醇；加熱回流提取法與超聲提取法相比，未見更多的色譜峰信息，且待測成分含量差異不大，超聲提取法更方便快捷，故選擇以甲醇超聲提取。

提取時間：考察了不同提取時間下待測成分的含量差異。取樣品粉末（過5號篩）約5 g，3份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，分別超聲提取30，45，60 min。結(jié)果表明，3份樣品中待測成分的含量無明顯差異，故選擇超聲處理30 min。