范俊江，王金明

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 晉中 030801)

氟是一種非常活潑的鹵族元素，化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，分布于自然界和人類生活的方方面面[1]。人們通常會(huì)通過飲水和食物攝入氟，當(dāng)攝入氟的量超過機(jī)體的正常體內(nèi)蓄積時(shí)，會(huì)出現(xiàn)“氟中毒”現(xiàn)象[2〗。氟中毒病不僅對(duì)人類的健康造成非常大的威脅，并且每年可對(duì)農(nóng)業(yè)畜牧業(yè)造成數(shù)以萬計(jì)的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響了社會(huì)的健康進(jìn)步和農(nóng)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展。

近年來氟中毒的研究中報(bào)道了高氟暴露下機(jī)體組織器官的損傷，例如腦、睪丸、脾臟、肝臟、腎臟等[3]。其中腎臟普遍被認(rèn)為是機(jī)體進(jìn)行排氟最重要的器官，腎小球?qū)Ψ哂泻軓?qiáng)的濾過作用，生物體內(nèi)70%以上的的氟均由腎臟進(jìn)行過濾和排出，同時(shí)大量的氟蓄積也會(huì)導(dǎo)致腎臟的組織結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生惡化[4]。

氟中毒還導(dǎo)致組織器官凋亡現(xiàn)象的發(fā)生[5]。在細(xì)胞的凋亡進(jìn)程中，Caspase8蛋白和Caspase3蛋白是凋亡現(xiàn)象發(fā)生最為明顯的特異分子[6]。細(xì)胞膜表面有大量的凋亡相關(guān)受體蛋白，可被激活參與細(xì)胞凋亡信號(hào)的發(fā)生和傳遞，其中Fas凋亡蛋白尤為重要，它屬于腫瘤壞死家族，作為一種關(guān)鍵的跨膜蛋白，被激活后可以與其配體Fas-L進(jìn)行相關(guān)特異性結(jié)合，最終活化Caspase家族凋亡蛋白，導(dǎo)致凋亡現(xiàn)象的發(fā)生[7]。

鈣被認(rèn)為是對(duì)治療氟中毒最好途徑之一，在氟中毒疾病高發(fā)地區(qū)，鈣已經(jīng)被廣泛作為一種膳食添加物來對(duì)氟中毒等疾病進(jìn)行預(yù)防[8]。鈣在調(diào)節(jié)激素分泌、調(diào)節(jié)血壓、控制機(jī)體排毒能力等發(fā)揮著不可忽視的作用。但是鈣對(duì)氟中毒機(jī)體腎臟損傷的治療效果和作用機(jī)制仍屬未知。因此，試驗(yàn)建立氟中毒加鈣的大鼠模型，飼喂0.5%鈣濃度和1%鈣濃度的飼料，檢測(cè)腎臟相關(guān)的功能指標(biāo)、腎結(jié)構(gòu)形態(tài)變化，檢測(cè)腎臟中凋亡蛋白的表達(dá)，為在生產(chǎn)實(shí)踐過程中使用營養(yǎng)物質(zhì)鈣治療氟中毒提出可靠的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用體重大小均為120±10 g，28日齡的健康雄性SD大鼠120只，均購買自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試驗(yàn)?zāi)Ｐ驮O(shè)計(jì)

首先將大鼠進(jìn)行一周的適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)，之后隨機(jī)分為4組，每組30只，分別為對(duì)照組、氟組(100 mg·L-1F-)、氟 + 0.5% 鈣組(F-+ 0.5% Ca)、氟 + 1% 鈣組(F-+ 1% Ca)，分組如表1所示。飼養(yǎng)期間所有大鼠均采用自由采食和自由飲水的條件進(jìn)行飼養(yǎng)，保持合適的溫度和濕度，保證飼養(yǎng)環(huán)境的干凈和安靜。

表1 大鼠模型的建立

1.3 主要儀器和試劑

氟化鈉、碳酸鈣、氯化鈉、乙醇、甲醛、二甲苯、HE染色試劑盒、中性樹膠等試劑(購自北京索萊寶公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)；WFJ 2100型可見分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司)；數(shù)顯電熱恒溫水浴箱(北京市長風(fēng)儀器儀表公司)；Y 9600 型電子分析天平(上海精密科儀器公司)；-80℃超低溫冰箱(美國Thermo Forma公司)；血清肌酐(CRE)、尿酸(UA)檢測(cè)試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)；Fas、Fas-L、Caspase8、Caspase3蛋白抗體和濃縮型DAB試劑盒(購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 一般癥狀觀察 試驗(yàn)周期內(nèi)每天對(duì)大鼠的飲食、飲水、毛發(fā)、排泄物、精神狀態(tài)等進(jìn)行觀察，并且詳細(xì)記錄。

1.4.2 生化指標(biāo)測(cè)定 分別于不同試驗(yàn)周期30 d、60 d、90 d，每組大鼠中隨機(jī)挑選10只大鼠，采用眼球采血的方式采取血液，一部分血液進(jìn)行尿素氮(BUN)的測(cè)定，另一部分血液以3 000 r·min-1的條件低溫速度離心10 min獲得血清，進(jìn)行肌酐(CRE)和尿酸(BUN)的測(cè)定，所有指標(biāo)均按照南京建成生物工程研究所的試劑盒指導(dǎo)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.3 腎臟切片HE染色觀察 試驗(yàn)90 d時(shí)，每組隨機(jī)挑選5個(gè)腎臟組織，固定在10%福爾馬林48 h，之后進(jìn)行流水沖洗，切取合適大小的塊狀，根據(jù)HE染色試劑盒的說明進(jìn)行石蠟包埋，石蠟切片，HE染色和封片，使用顯微鏡對(duì)切片進(jìn)行觀察和分析。

1.4.4 腎臟組織凋亡蛋白的檢測(cè) 試驗(yàn)90 d時(shí)，每組隨機(jī)挑選5個(gè)腎臟組織，放在10甲醛溶液進(jìn)行固定48 h，流水沖洗后切取合適大小的組織進(jìn)行常規(guī)乙醇脫水，石蠟包埋，石蠟切片，切片大小為4 μm，然后采用ASBC法對(duì)腎臟組織Fas、Fas-L、Caspase8和Caspase3蛋白進(jìn)行化學(xué)染色，使用DAB顯色法對(duì)切片進(jìn)行顯色，然后運(yùn)用顯微鏡在同一條件下獲取各個(gè)組中腎臟樣本的試驗(yàn)圖像，運(yùn)用分析軟件Image-Pro plus v.5.0 進(jìn)行平均光密度分析，每個(gè)樣本選取10張切片，每個(gè)切片隨機(jī)挑選8個(gè)視野，分析每個(gè)視野中陽性區(qū)域面積的平光光密度值，然后進(jìn)行差異顯著性顯著檢驗(yàn)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( ±)”表示，采用LSD進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，使用SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析與處理，P< 0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠生長狀態(tài)

對(duì)照組大鼠生長正常，牙齒和毛發(fā)無異常，精神狀態(tài)正常，尿液清亮，糞便顏色和質(zhì)地正常；氟組大鼠生長正常，精神和運(yùn)動(dòng)正常，牙齒有白堊現(xiàn)象，尿液和糞便顏色均正常；氟加低鈣組大鼠在飼養(yǎng)末期生長緩慢，運(yùn)動(dòng)正常，但會(huì)出現(xiàn)嗜睡現(xiàn)象，毛發(fā)雜亂，尿液較少，糞便顏色出現(xiàn)淡灰白色；氟加高鈣組大鼠生長緩慢，不喜飲水，進(jìn)食減少，運(yùn)動(dòng)減少，毛色無光澤，且尿液量極少，出現(xiàn)渾濁，糞便質(zhì)地較硬，呈灰白色。

2.2 腎臟相關(guān)生化指標(biāo)

如表2所示，30 d時(shí)，各組指標(biāo)變化不顯著。60 d時(shí)，與對(duì)照組相比，BUN、CRE、UA水平升高(P< 0.05)；與氟組相比，氟 + 1% 鈣組中BUN水平降低，CRE和UA水平顯著降低(P< 0.05)。90 d時(shí)，與對(duì)照組相比，腎臟損傷嚴(yán)重，氟組BUN、CRE、UA水平顯著升高(P< 0.05，P< 0.01)；與氟組相比，氟加鈣組損傷均有一定的緩解，氟 + 0.5% 鈣組和氟 + 1% 鈣組中BUN、CRE、UA水平均發(fā)生顯著降低(P< 0.05，P< 0.01)

2.3 腎臟HE染色

從圖1中可以看出，對(duì)照組腎臟結(jié)構(gòu)正常，腎小球充盈且間隙均勻；氟組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，腎小球發(fā)生萎縮，間隙增大，細(xì)胞排列紊亂，腎細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損；氟 + 0.5 % 鈣組中雖然有一定程度的好轉(zhuǎn)，但是腎臟結(jié)構(gòu)損害現(xiàn)象依然很明顯；在氟 + 1 % 鈣組中，腎小球形態(tài)逐漸恢復(fù)正常，腎細(xì)胞排列逐漸規(guī)整，細(xì)胞間隙減小，腎臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)有很明顯的改善。

表2 不同周期大鼠腎臟相關(guān)指標(biāo)變化

2.4 腎臟相關(guān)凋亡蛋白免疫組化

腎臟中凋亡蛋白Fas、Fas-L、Caspase8、Caspase3的表達(dá)如圖2所示。從表3的分析結(jié)果可以得出，與對(duì)照組相比，氟組腎細(xì)胞凋亡增強(qiáng)，F(xiàn)as、Fas-L、Caspase8、Caspase3蛋白表達(dá)均發(fā)生顯著增強(qiáng)(P< 0.05，P< 0.01)；與氟組相比，在氟 + 0.5% 鈣組和氟 + 1% 鈣組中，以上蛋白的表達(dá)均顯著性降低(P< 0.05，P< 0.01)，腎細(xì)胞凋亡程度降低。

表3 腎臟中Fas、Fas-L、Caspase8、Caspase3蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

氟中毒的危害已經(jīng)蔓延全球，且具有難以治愈、被侵害器官多、機(jī)體受損時(shí)間較長等特點(diǎn)。氟中毒的治療已經(jīng)成為人們?nèi)粘ｊP(guān)注的重點(diǎn)，使用鈣對(duì)氟中毒進(jìn)行治療引起了廣泛的關(guān)注。

腎臟具有維持內(nèi)環(huán)境激素分泌、調(diào)節(jié)血壓、物質(zhì)傳送等功能，一方面可以維持體內(nèi)電解質(zhì)和酸堿平衡，另一方面可以運(yùn)輸有害物質(zhì)排出體外。其中腎臟的生化功能指標(biāo)和形態(tài)結(jié)構(gòu)是反映腎臟是否可正常行使功能的重要方面。氟中毒高發(fā)地區(qū)人體的腎臟功能指標(biāo)檢測(cè)報(bào)告稱腎小球的濾過率發(fā)生明顯惡化，尿素氮、肌酐等指標(biāo)水平均發(fā)生顯著升高[9]，另有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，慢性暴露于高氟環(huán)境的大鼠腎臟功能發(fā)生損害，腎小球排列紊亂，形狀不規(guī)整，且有大量的炎癥細(xì)胞浸潤，且指標(biāo)尿酸、堿性磷酸酶等水平發(fā)生升高[10]。在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中同樣發(fā)現(xiàn)氟中毒使得腎臟的結(jié)構(gòu)遭到損害，生化功能指標(biāo)BUN、CRE、UA也發(fā)生顯著升高，腎功能受損，但是在補(bǔ)充鈣后腎臟的結(jié)構(gòu)形態(tài)逐漸恢復(fù)，細(xì)胞排列變得整齊，且生化指標(biāo)BUN、CRE、UA水平發(fā)生明顯好轉(zhuǎn)，可以看出鈣可緩解由氟中毒帶來的腎臟損傷和功能下降。

細(xì)胞凋亡被稱作為細(xì)胞的程序性死亡，是細(xì)胞體內(nèi)由基因控制的一種生命進(jìn)程[11]。氟中毒會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的多種組織器官均會(huì)發(fā)生凋亡現(xiàn)象， Caspase8、Caspase3蛋白表達(dá)發(fā)生明顯增強(qiáng)，占凋亡發(fā)生的主導(dǎo)地位[12]。Fas和Fas-L系統(tǒng)是近年來在細(xì)胞凋亡領(lǐng)域研究較為深入的一類分子，它也是具有促進(jìn)凋亡發(fā)生的神經(jīng)類生長因子受體[13]。有研究指出機(jī)體在發(fā)生氟中毒時(shí)，F(xiàn)as和Fas-L在發(fā)生凋亡的睪丸細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞凋亡過程中顯著增加，同時(shí)激活Caspase8和Caspase3[14～15]。與此類似，在本實(shí)驗(yàn)中，氟組大鼠的腎臟Fas、Fas-L、Caspase8、Caspase3蛋白表達(dá)均增強(qiáng)，表明腎臟細(xì)胞發(fā)生了凋亡，但是在加鈣組中，它們的表達(dá)量均下降，腎細(xì)胞凋亡受到抑制，表明鈣可一定程度緩解由氟中毒導(dǎo)致的腎臟凋亡，體現(xiàn)鈣對(duì)緩解氟中毒的優(yōu)勢(shì)作用。

總之，氟中毒會(huì)造成腎臟的損傷和凋亡，在補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)鈣后，會(huì)很好的緩解由氟中毒導(dǎo)致的腎臟損傷和凋亡，其中，添加1% 鈣含量效果甚佳。