馮永亮

唐山學(xué)院基礎(chǔ)教學(xué)部，唐山 063000

物種敏感度分布(SSD)是描述不同物種對特定污染物或混合物敏感性差異的統(tǒng)計分布模型，其5%分位數(shù)(HC5)除以一個安全因子(SF)通常作為保護生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的環(huán)境閾值(即預(yù)測無效應(yīng)濃度，PNEC)，目前已成為許多國家和地區(qū)環(huán)境質(zhì)量標準制定和污染物生態(tài)風(fēng)險評價的重要方法[1-5]。目前，用于構(gòu)建污染物SSD曲線的毒性數(shù)據(jù)主要來源于生態(tài)毒性試驗中常規(guī)毒理指標的急性(50%致死濃度(LC50)或50%效應(yīng)濃度(EC50))或慢性(無觀察效應(yīng)濃度(NOEC))數(shù)據(jù)，如個體的生存、死亡、生長發(fā)育和繁殖等。然而多數(shù)情況下，這些個體水平指標并不能為生態(tài)系統(tǒng)安全提供充足的信息，也無法對機體損傷形成早期預(yù)警的快速響應(yīng)[6]。有研究表明，水生生物的生殖、生物化學(xué)和分子生物學(xué)指標對一些污染物(如17α-乙炔雌二醇和壬基酚)的毒性更敏感，采用常規(guī)個體水平指標評價其風(fēng)險可能無法充分保護水生生物[7-10]。水生生物不同層次指標對污染物的敏感性有一定差異[11]。Wo等[12]比較了鎘對海洋腹足類動物織紋螺(Nassariusfestivus)3類指標的亞致死效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)生長與繁殖凈能(scope for growth, SfG)指標最敏感(8 d-NOEC<160 μg·L-1)，其次為RNA/DNA比例(8 d-NOEC為520 μg·L-1)，最后是傳統(tǒng)的體長和體重的增長(8 d-NOEC為1 000 μg·L-1)。類似的，Spurgeon等[13]研究了鋅對土壤生物蚯蚓(earthworms)的基因表達、細胞完整性和生命周期的毒性，發(fā)現(xiàn)基因表達是最敏感的指標(EC50=616 μg·g-1)。如何科學(xué)地運用不同層次指標建立污染物的水質(zhì)基準和進行生態(tài)風(fēng)險評價尚需進一步研究[14]。

近年來，隨著分子水平生態(tài)毒理數(shù)據(jù)的增加，一些學(xué)者開始研究基因毒性效應(yīng)與個體水平毒性效應(yīng)之間的關(guān)系，希望搭建起微觀與宏觀指標之間的橋梁[15]。Fedorenkova等[6]基于SSD法比較了水生生物的基因表達水平指標與個體水平指標對鎘的敏感性差異，發(fā)現(xiàn)鎘對基因表達的毒性平均比個體死亡毒性高11倍，但只是個體慢性毒性的1/4。相較于分子水平的指標，有些學(xué)者認為種群水平的指標更適合用于生態(tài)風(fēng)險評價[16]。目前，關(guān)于種群水平指標的研究，大多是采用不同生態(tài)模型將個體水平的毒性數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為種群水平的閾值，進而用于風(fēng)險評價[17-18]，如Lin等[17]基于青鳉(Oryziaslatipes)整個生命周期的毒性數(shù)據(jù)計算了4-壬基酚(4-NP)對其種群增長率的影響，并據(jù)此導(dǎo)出了種群水平的PNEC。此外，對于具有繁殖/生殖毒性類化合物，一些學(xué)者推薦使用生殖指標的毒性數(shù)據(jù)進行環(huán)境基準的建立和風(fēng)險評價[19-20]。Liu等[21]基于SSD曲線，分別推導(dǎo)了鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)對水生生物生存、生長、生物化學(xué)和分子生物學(xué)以及生殖指標的PNEC，發(fā)現(xiàn)由生殖指標導(dǎo)出的PNEC范圍為0.14～0.68 μg·L-1，顯著低于其他指標的結(jié)果，進而基于生殖指標的毒性數(shù)據(jù)評價了中國表層水DEHP的生態(tài)風(fēng)險。雖然，近年來學(xué)者們采用不同毒理指標進行污染物水質(zhì)基準構(gòu)建和生態(tài)風(fēng)險評價[22-23]，但由于不同指標毒性數(shù)據(jù)質(zhì)量和數(shù)量問題，這方面研究仍處于初步探索階段[23]。

本研究以毒性數(shù)據(jù)較為豐富的銅為例，篩選了其對水生生物的基因、生化、細胞、器官、個體和種群水平的毒性數(shù)據(jù)，構(gòu)建了相應(yīng)的SSD曲線，采用雙樣本K-S檢驗和HC5差異法比較了不同指標間的差異，采用拐點分析法確定了構(gòu)建穩(wěn)定SSD所需的最小樣本量。同時對不同層次指標毒性數(shù)據(jù)在水質(zhì)基準制定和生態(tài)風(fēng)險評價中的應(yīng)用進行了初步探討，為銅的環(huán)境基準的建立和生態(tài)風(fēng)險評價提供了新的參考標準。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 數(shù)據(jù)收集

銅對不同營養(yǎng)級淡水和海水生物的毒性數(shù)據(jù)均來源于水生毒性數(shù)據(jù)庫(ECOTOX databases，http://cfpub.epa.gov/ecotox/)。數(shù)據(jù)篩選按照Klimisch等[24]給出的可靠性、相關(guān)性和適當性原則，只選用暴露恰當時間的毒性數(shù)據(jù)。其中，急性毒性數(shù)據(jù)的終點指標選用LC50和EC50，在各個營養(yǎng)級中的暴露時間：藻類和無脊椎動物為≤4 d，甲殼類為1～4 d，魚類和蠕蟲為4 d，軟體動物和兩棲類為2～4 d。慢性毒性數(shù)據(jù)的終點指標選用NOEC，在各個營養(yǎng)級中的暴露時間：藻類和無脊椎動物≥1 d，甲殼類、魚類、軟體動物、兩棲類動物和蠕蟲為≥4 d。由于慢性毒性數(shù)據(jù)較少，本研究同時考慮了最大可接受毒物濃度(MATC)、最低觀測效應(yīng)濃度/水平(LOEC/LOEL)或無觀測效應(yīng)水平(NOEL)作為慢性毒性數(shù)據(jù)的終點指標。當同一物種，相同暴露終點、相同暴露時間具有多個數(shù)據(jù)可用時，則采用其幾何均值[25]。

根據(jù)不同層次毒理指標，將以上收集到的銅的毒性數(shù)據(jù)分為以下7類。

(1)基因水平數(shù)據(jù)(genetic data)：包括對DNA表達或損傷、mRNA轉(zhuǎn)錄水平的抑制等數(shù)據(jù)。

(2)生化數(shù)據(jù)(biochemical data)：包括對水生生物的生物化學(xué)、酶以及激素方面的效應(yīng)，如酶活性的感應(yīng)或抑制、應(yīng)激蛋白表達的變化等。

(3)細胞水平數(shù)據(jù)(cell data)：包括對各種組織細胞(如鰓、肝臟和血液)的形狀、數(shù)量以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響，如血液中白細胞數(shù)量、藻類細胞器(線粒體)的變化和魚類紅細胞結(jié)構(gòu)變化等。

(4)器官水平數(shù)據(jù)(organ data)：包括生物生命周期中任意時期骨骼或發(fā)育的器官組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)的變化，如軟體動物殼的長度、兩棲類尾部的長度和變態(tài)過程、魚類和兩棲類肝臟指數(shù)(肝臟重量/個體重量)和性腺指數(shù)(性腺重量/個體重量)等。

(5)個體水平急性數(shù)據(jù)(individual acute data)：包括對水生生物生存的半數(shù)致死數(shù)據(jù)(LC50)以及對生長的半數(shù)抑制數(shù)據(jù)(EC50)。

(6)個體水平慢性數(shù)據(jù)(individual chronic data)：包括對水生生物的生存、生長、發(fā)育和繁殖影響的數(shù)據(jù)。

(7)種群水平數(shù)據(jù)(population data)：包括對水生生物(主要為藻類)種群增長率、生物量、豐度、性別比例、葉綠素a濃度、多樣性和均勻度等指標影響的數(shù)據(jù)。

1.2 不同毒理指標SSD的構(gòu)建與差異性比較

首先，將物種的毒性值按從小到大的順序進行排列，并且給其分配等級R，按照下式計算每個物種的累計概率。

式中：P為累計概率(%)，R為物種排序的等級，N為物種個數(shù)。然后以濃度和累計概率分別為X軸和Y軸建立坐標系，并根據(jù)不同生物的毒性值和累計概率標出這些數(shù)據(jù)點。最后選用Log-normal、Log-logistic、Weibull和Burr Ⅲ分布(包括Burr Ⅲ的極限分布ReWeibull)對這些數(shù)據(jù)點進行分布擬合，得到銅對水生生物7類不同指標的SSD曲線。擬合過程中所有參數(shù)均采用極大似然估計。Anderson-Darling(A-D)檢驗用于模型的擬合優(yōu)度檢驗[7]。擬合模型在X軸和Y軸的偏差平方和[26]以及AIC(Akaike information criterion)值[27]用于最優(yōu)SSD模型的選擇。

采用雙樣本K-S檢驗進行銅的不同毒理指標SSD間的差異性比較[28-29]；采用在水質(zhì)基準建立過程中以及比較本地種與非本地種敏感性差異研究中給出的重要點位差異法進行重要點位HC5間的差異性比較，當不同層次指標的HC5差異在2倍以內(nèi)時認為無差異，在一個數(shù)量級以內(nèi)有一定差異，超過一個數(shù)量級有較大差異[30-32]。此外，本研究采用統(tǒng)計外推法(即利用HC5除以一個安全因子SF)，來計算環(huán)境保護閾值PNEC，其中，SF取保守值5[33]。

1.3 最小樣本量的確定

本研究基于HC5值隨樣本量的變化情況來確定獲得穩(wěn)定SSD所需的最小樣本量。具體過程如下：對每一個給定的數(shù)據(jù)集(此處為銅對水生生物不同指標的毒性數(shù)據(jù)集，設(shè)其樣本量為N)，從中有放回地隨機抽取5 000個樣本量為n的模擬樣本，基于這些模擬樣本，通過參數(shù)Bootstrap[34-35]方法計算HC5及其95%置信區(qū)間(95% CI)，然后對每一個樣本量為n(范圍為2～N)的樣本，重復(fù)上述過程。通過上述過程，每個給定的數(shù)據(jù)集(樣本量為N)都會獲得一個大小為N-1的HC5序列，基于這個HC5序列，采用拐點分析(change point analysis)來確定HC5值趨于穩(wěn)定時所需的最小樣本量。拐點分析經(jīng)常用于將一個序列分成具有不同性質(zhì)(如均值和方差)的2個部分[36]。本研究在0.05的顯著性水平下，基于方差的變化確定HC5序列的拐點，即構(gòu)建穩(wěn)定SSD所需的最小樣本量。由于采用Bootstrap方法確定HC5值至少需要20個數(shù)據(jù)[35]，因此，對毒性數(shù)據(jù)量少于20的淡水基因數(shù)據(jù)集、海水細胞和器官數(shù)據(jù)集并未進行最小樣本量估計。本研究的數(shù)據(jù)模擬和統(tǒng)計分析均采用R軟件(Version 3.6.0)，需要添加的軟件包有fitdistrplus、ADGofTest以及changepoint。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 不同毒理指標數(shù)據(jù)

本研究共篩選出銅對淡水生物的毒性數(shù)據(jù)742個，對海洋生物的毒性數(shù)據(jù)628個，涵蓋了水生生態(tài)系統(tǒng)的7個主要功能群：藻類、兩棲類、甲殼類、魚類、無脊椎動物、軟體動物和蠕蟲類。其中，銅對淡水生物的基因、生化、細胞、器官、個體急性、個體慢性和種群水平的毒性數(shù)據(jù)量分別為16、92、25、28、375、113和93個，對海洋生物的毒性數(shù)據(jù)量分別為26、91、13、16、291、109和82個(表1)。生化指標、個體急性、個體慢性和種群水平指標的毒性數(shù)據(jù)相對充足，而基因、細胞和器官水平指標毒性數(shù)據(jù)相對較少，但也滿足了Wheeler等[37]提出的構(gòu)建SSD曲線所需最少10個數(shù)據(jù)的要求以及美國環(huán)境保護局(US EPA)[1]提出的“三門8科”的要求。此外，海水生物和淡水生物各個層次指標所包含功能群的種類和比例也有較大差異(圖1)。比如，淡水生物的生化、個體水平指標均包含了7個功能群，而基因和器官水平指標僅包含了4個功能群，種群水平數(shù)據(jù)中藻類所占比例高達63.00%等。

圖1 銅對水生生物不同層次指標所包含功能群的比例注：(a)為淡水生物毒性數(shù)據(jù)比例；(b)為海水生物毒性數(shù)據(jù)比例。Fig. 1 The percentage of toxicity data of different endpoints of copper to different aquatic species groupsNote: (a) percentage of different species groups for freshwater organisms; (b) percentage of different species groups for seawater organisms.

表1 銅的不同毒理指標毒性數(shù)據(jù)的統(tǒng)計性質(zhì)和物種敏感度分布相關(guān)參數(shù)Table 1 Statistic characteristics of toxicity data and the parameters of species sensitivity distribution for copper based on different endpoints

2.2 基于SSD的不同毒理指標對銅的敏感性比較

A-D檢驗結(jié)果表明，Log-normal、Log-logistic和Burr Ⅲ分布均能較好地擬合所有層次指標數(shù)據(jù)集(P>0.05)，Weibull分布對于數(shù)據(jù)量較少的數(shù)據(jù)集(海洋生物的基因、細胞和器官指標，淡水生物的基因和細胞指標)的擬合能夠通過檢驗，而對于數(shù)據(jù)量較大的其他數(shù)據(jù)集的擬合效果較差(P<0.05)。4種分布在X軸和Y軸的偏差平方和以及AIC結(jié)果均表明，Burr Ⅲ分布能夠較好地擬合各個數(shù)據(jù)集，尤其是數(shù)據(jù)量>30的數(shù)據(jù)集。因此，本研究以下分析結(jié)果均采用Burr Ⅲ分布(或ReWeibull分布)作為各個數(shù)據(jù)集的SSD模型。

銅對淡水生物不同毒理指標的SSD曲線如圖2(a)所示。由圖2(a)可知，個體慢性指標SSD(主要在低值區(qū)域)位于其他6類指標SSD的左側(cè)，個體急性指標SSD位于其他6類指標(種群指標的高值區(qū)域除外)的右側(cè)，表明淡水生物個體慢性指標對銅最敏感，個體急性指標最不敏感。雙樣本K-S檢驗結(jié)果表明(表2)，基因、器官、生化和個體慢性和種群指標SSD與個體急性指標的SSD均有顯著差異(ks=0.17～0.45,P<0.05)，個體慢性指標SSD與生化和種群指標SSD均具有顯著差異(ks=0.19～0.26,P<0.05)。此外，基因、細胞、器官和生化指標的SSD曲線相對較近，差異不顯著(ks=0.13～0.30,P=0.06～0.95)。SSD重要點位HC5的比較結(jié)果顯示，基因、細胞、器官、生化、個體急性和種群指標HC5與個體慢性指標HC5均具有一定差異(3.15倍～8.28倍)，細胞和個體急性HC5值分別為種群水平HC5值的2.13倍和2.46倍，具有一定差異。淡水生物7類指標對Cu的敏感順序為：個體慢性(HC5=1.24 μg·L-1)>種群(HC5=4.17 μg·L-1)≥器官(HC5=4.78 μg·L-1)>生化(HC5=5.40 μg·L-1)≥基因(HC5=7.38 μg·L-1)≥細胞(HC5=8.88 μg·L-1)>個體急性(HC5=10.27 μg·L-1)。

圖2 銅對水生生物不同層次指標的物種敏感性曲線注：(a)為淡水生物；(b)為海水生物。Fig. 2 The species sensitivity distribution curves of copper based on different toxicological endpoints of aquatic organismsNote: (a) freshwater organisms; (b) seawater organisms.

表2 基于雙樣本K-S檢驗和重要點位差異法(HC5)的不同毒理指標對銅的敏感性差異比較Table 2 Comparison of different level tested endpoints for copper using the two-sample K-S test and important points (HC5)

銅對海洋生物不同毒理指標的SSD曲線如圖2(b)所示。個體急性指標SSD位于其他6類指標的右側(cè)，表明基因、細胞、器官、生化、個體慢性和種群指標相較于個體水平急性指標對銅更為敏感。雙樣本K-S檢驗結(jié)果表明，個體急性指標與其他6類指標的SSD曲線均具有顯著差異(ks=0.25～0.56,P<0.01)。除個體急性指標外，其他6類指標SSD曲線的相對位置較近，差異不顯著(ks=0.10～0.36,P=0.06～0.97)。此外，種群指標的SSD曲線較為平緩，毒性數(shù)據(jù)范圍大，其中，低值區(qū)域相對較為敏感，高值區(qū)域相對不敏感。重要點HC5的比較結(jié)果顯示，基因指標的HC5是器官和種群指標HC5的0.86倍和0.85倍，是細胞、生化、個體急性和個體慢性指標HC5值的0.27倍、0.27倍、0.12倍和0.34倍，即基因指標與器官和種群指標的HC5值無差異，與其他4類指標有一定差異。細胞水平指標的HC5分別為器官、個體急性和種群指標HC5的3.19倍、0.45倍和3.16倍，有一定的差異。此外，器官水平指標HC5與生化、個體急性和個體慢性HC5有一定差異(0.14倍～0.39倍)，生化指標HC5與個體慢性指標HC5有一定差異，個體急性指標HC5與個體慢性和種群指標HC5具有一定差異。海洋生物7類指標對銅的敏感順序為：基因(HC5=1.53 μg·L-1)≥器官(HC5=1.78 μg·L-1)≥種群(HC5=1.80 μg·L-1)>個體慢性(HC5=4.55 μg·L-1)≥生化(HC5=5.63 μg·L-1)≥細胞(HC5=5.68 μg·L-1)>個體急性(HC5=12.50 μg·L-1)。

2.3 構(gòu)建穩(wěn)定SSD所需的最小樣本量

基于銅對水生生物個體急性和個體慢性毒性數(shù)據(jù)所得的HC5值及其95% CI隨樣本量增加的變化情況如圖3所示。由圖3可知，HC5值隨著樣本量的增加而快速減小，拐點分析顯示，對于淡水生物，當樣本量分別達到22和9時，其個體急性和個體慢性的HC5值隨樣本量增加不再有顯著變化，即淡水個體急性和個體慢性毒性數(shù)據(jù)集構(gòu)建穩(wěn)定SSD所需最小樣本量分別為22和9。類似的，對于海洋生物，其個體急性和個體慢性毒性數(shù)據(jù)集構(gòu)建穩(wěn)定SSD所需最小樣本量分別為17和10。此外，淡水生物細胞、器官、生化以及種群毒性數(shù)據(jù)構(gòu)建穩(wěn)定SSD所需最小樣本量分別為5、5、8和9，海水生物基因、生化以及種群毒性數(shù)據(jù)構(gòu)建穩(wěn)定SSD所需最小樣本量分別為5、9和8。

圖3 HC5值隨樣本量增加的變化趨勢注：(a)淡水生物個體急性；(b)淡水生物個體慢性；(c)海水生物個體急性；(d)海水生物個體慢性。Fig. 3 Variation of HC5 estimation against sample sizeNote: (a) individual acute endpoint for freshwater organisms; (b) individual chronic endpoint for freshwater organisms; (c) individual acute endpoint for seawater organisms; (d) individual chronic endpoint for seawater organisms.

3 討論(Discussion)

目前，SSD的構(gòu)建和水質(zhì)基準的推導(dǎo)大多采用傳統(tǒng)的個體水平指標毒性數(shù)據(jù)，如US EPA[38]基于個體水平的急性和慢性毒性數(shù)據(jù)，給出了銅對淡水和海水的急性基準值(CMC)和慢性基準值(CCC)。本研究基于水生生物個體急性和慢性指標所得HC5值均與US EPA所給標準值處于同一數(shù)量級。其中，基于淡水生物個體急性指標得出的HC5(10.27 μg·L-1)略小于CMC(13 μg·L-1)，而個體慢性指標所得HC5(1.24 μg·L-1)僅為CCC(9 μg·L-1)的0.14倍。基于海洋生物個體急性指標得出的HC5(12.50 μg·L-1)為CMC(4.8 μg·L-1)的2.6倍，個體慢性指標所得HC5(4.55 μg·L-1)略大于CCC(3.1 μg·L-1)。此外，由于推導(dǎo)方法以及SF選取的差異，本研究基于個體水平所得PNEC均低于US EPA所給標準值(表1)。目前，國際上普遍采用的推導(dǎo)污染物水質(zhì)基準的方法包括評價因子法、毒性百分數(shù)排序法和SSD外推法。US EPA采用的毒性百分數(shù)排序法是把所獲得的物種的屬平均毒性值按從小到大的順序進行排列，其中，CMC等于最終急性值的1/2[39]。而本研究所采用的是我國在《淡水水生生物水質(zhì)基準制定技術(shù)指南》推薦的SSD外推法，是將單個物種的毒性數(shù)據(jù)進行排序，并且推導(dǎo)PNEC時SF選取的是保守值5[33]。

本研究雙樣本K-S檢驗結(jié)果顯示，除個體急性指標外，其他指標的SSD曲線差異均不顯著，各個指標HC5結(jié)果顯示，個體急性指標為最不敏感指標，其次為細胞水平指標，種群水平指標較為敏感。本文結(jié)論與人們普遍認為的環(huán)境污染物導(dǎo)致的生態(tài)系統(tǒng)逐級響應(yīng)順序(即不同層次指標對污染物的敏感順序應(yīng)該為基因>細胞>器官>個體>種群)有較大差異[13]。原因之一可能是各個層次指標所包含的生物功能群有較大差異(圖1)，不同功能群對銅的敏感性不同。Wong等[40]發(fā)現(xiàn)水蚤類生物對鎘和銅的敏感性要明顯大于橈足類?？紫檎榈萚41]發(fā)現(xiàn)淡水生物甲殼類和無脊椎動物對銅的敏感性要明顯大于魚類，而甲殼類的敏感性略大于無脊椎動物。類似的，杜建國等[42]發(fā)現(xiàn)銅對海洋藻類和甲殼類動物的毒性較大，對于軟體動物的毒性相對較小，且當銅的濃度低于1 000 μg·L-1時，其對無脊椎動物的毒性大于魚類的毒性。此外，隨著現(xiàn)代技術(shù)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用，大量亞個體水平效應(yīng)被量化(如mRNA轉(zhuǎn)錄、基因的表達量等)，但很難將其與高層次的生物學(xué)組織水平的生態(tài)效應(yīng)相關(guān)聯(lián)[23]，這也是導(dǎo)致本研究中不同層次指標對銅的敏感性順序不呈逐級響應(yīng)的一個重要原因。例如，本研究中基因、生化指標大多都選用的是與氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的酶或者基因，這些指標可能并不是對銅最早應(yīng)激響應(yīng)的靶指標，進而導(dǎo)致其敏感性并未顯著高于其他層次指標(個體急性指標除外)。

銅對水生生物基因、細胞、器官、生化和個體慢性指標的敏感性要顯著高于個體急性指標(圖2)。個體水平急性指標一般采用LC50或EC50作為評價終點，而其他幾類指標所用大多為慢性評價終點(如NOEC)，暴露時間短是導(dǎo)致個體急性指標比其他指標不敏感的一個重要原因。目前，銅對水生生物種群水平效應(yīng)的研究主要集中于藻類的群增長率、生物量、豐度以及葉綠素含量等指標，藻類(尤其是微藻類)作為大多數(shù)淡水和海水生態(tài)系統(tǒng)的基礎(chǔ)物種，對銅的敏感性較大。Levy等[43]報道銅對海洋微藻中鼓藻(Bellerocheapolymorpha)、微胞藻(Micromonaspusilla)、大洋橋石藻(Gephyrocapsaoceanica)、溝狀蛋白藻(Proteomonassulcata)和鈣板金藻(Coccolithushuxleyi)種群增長率的3 d-NOEC分別為0.2、0.3、1.3、5和8 μg·L-1。這些較為敏感的微藻類生物分布在種群指標SSD曲線的低值區(qū)域，導(dǎo)致其HC5值相對較小。Iwasaki等[18]基于種群模型，估算了銅對13種淡水生物種群效應(yīng)閾值(種群增長率為0)，構(gòu)建了種群水平的SSD曲線，發(fā)現(xiàn)與個體水平閾值的SSD并無顯著差異，與本研究雙樣本K-S檢驗的結(jié)果一致。本研究中淡水生物個體慢性指標為各個層次指標中最敏感的指標，其HC5顯著低于基因、細胞和器官等低層次指標。類似的，Yan等[15]基于SSD法分析了基因效應(yīng)數(shù)據(jù)和個體水平急性、慢性效應(yīng)數(shù)據(jù)對鎘的敏感性，發(fā)現(xiàn)3種效應(yīng)數(shù)據(jù)對鎘的敏感度排序為個體慢性>基因效應(yīng)>個體急性。此外，本研究HC5結(jié)果顯示，海水生物的基因和器官指標的敏感性顯著高于個體層次指標，而淡水生物的基因、器官等亞個體指標的敏感性要顯著低于個體慢性指標，表明基因效應(yīng)等亞個體指標具有作為生態(tài)風(fēng)險早期預(yù)警指標的應(yīng)用潛力，但基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)尚難以大范圍地支持其在我國水質(zhì)基準修訂和風(fēng)險評價中的應(yīng)用。

目前，用于生態(tài)風(fēng)險評價的毒性數(shù)據(jù)絕大部分來自于個體或亞個體水平的研究，而其所關(guān)心的生態(tài)終點往往是種群水平(或更高水平)的效應(yīng)，有限可用毒性數(shù)據(jù)與所關(guān)心的生態(tài)保護目標不匹配是生態(tài)風(fēng)險評價的一個主要問題[23]。有害結(jié)局路徑(AOPs)概念的提出從一定程度上解決了亞個體效應(yīng)與生態(tài)保護目標的關(guān)聯(lián)問題[44]。但目前基于AOPs概念進行水質(zhì)基準建立和生態(tài)風(fēng)險評價的研究主要集中于環(huán)境雌激素類物質(zhì)[45]，尚難以大范圍應(yīng)用到其他物質(zhì)。筆者認為若要將基因、生化等效應(yīng)數(shù)據(jù)與個體或種群水平效應(yīng)聯(lián)系起來用于生態(tài)風(fēng)險評價和管理，在同一個AOPs上每個生物組織層次都應(yīng)找到至少一個有意義的敏感指標。

目前，許多機構(gòu)和學(xué)者都對構(gòu)建SSD模型所需的最小毒性數(shù)據(jù)量做了規(guī)定和研究[1-2,5,34,37,46]，但這些規(guī)定主要是基于毒性數(shù)據(jù)的代表性和有效性的角度給出的，如我國在《淡水水生生物水質(zhì)基準制定技術(shù)指南》(HJ 831—2017)[5]中指出構(gòu)建SSD模型的毒性數(shù)據(jù)應(yīng)該至少涵蓋3個營養(yǎng)級的5種生物，US EPA[1]指出構(gòu)建SSD曲線的數(shù)據(jù)需滿足“3門8科”且為本土水生動物的毒性數(shù)據(jù)的要求。毒性數(shù)據(jù)的代表性和有效性是構(gòu)建一個可靠SSD模型的基礎(chǔ)，然而，從統(tǒng)計學(xué)角度看，滿足上述毒性數(shù)據(jù)要求所構(gòu)建的SSD并不能保證其輸出結(jié)果(HC5)的穩(wěn)定性。Zhao和Chen[27]基于毒死蜱對水生生物的3個數(shù)據(jù)集(數(shù)據(jù)量分別為144、167和207)，采用拐點分析法，得出基于參數(shù)方法構(gòu)建SSD曲線所需最小樣本量分別為10、11和11。類似的，Zhang等[47]基于壬基酚對淡水生物的急性和慢性毒性數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)量分別為27和22)，采用拐點分析法，得出參數(shù)方法獲得穩(wěn)定HC5輸出所需最小樣本量分別為12和13。本研究基于HC5值的方差變化情況，采用拐點分析法得到了基于銅的淡水和海水個體慢性毒性數(shù)據(jù)構(gòu)建穩(wěn)定SSD曲線所需最小樣本量分別為9和10，與上述文獻結(jié)果基本一致，而淡水和海水個體急性毒性數(shù)據(jù)所需最小樣本量分別為22和17，大于上述文獻結(jié)果。此外，值得注意的一個趨勢是，數(shù)據(jù)量越大的毒性數(shù)據(jù)集(如個體急性數(shù)據(jù)集)，其獲得穩(wěn)定HC5所需最小樣本量也越大。一般的，數(shù)據(jù)量大的毒性數(shù)據(jù)集由于其方差和經(jīng)驗分布的范圍較大，獲得穩(wěn)定HC5所需最小樣本量也會更大[27]。因此，本研究推導(dǎo)出銅的最小樣本量并不能簡單地推廣到其他污染物的毒性數(shù)據(jù)集上。筆者建議，在搜索獲得某個污染物毒性數(shù)據(jù)后，應(yīng)先推導(dǎo)出獲得穩(wěn)定HC5所需的最小樣本量，然后再進行毒性數(shù)據(jù)篩選，最后篩選出的毒性數(shù)據(jù)量需要大于上述所得的最小樣本量，才能保證其所構(gòu)建的SSD在統(tǒng)計上具有穩(wěn)定性。

綜上所述：水生生物不同層次指標對銅的敏感性并沒有呈現(xiàn)出逐級響應(yīng)的關(guān)系。基于雙樣本K-S檢驗的結(jié)果表明，水生生物個體急性指標對銅的敏感性要顯著低于其他指標，淡水生物的個體慢性指標的敏感性顯著高于生化和種群指標。基于HC5差異法的結(jié)果顯示，淡水生物不同指標對銅的敏感順序為：個體慢性>種群≥器官>生化≥基因≥細胞>個體急性，海水生物不同指標對銅的敏感順序為：基因≥器官≥種群>個體慢性≥生化≥細胞>個體急性?；诠拯c分析法的結(jié)果顯示，淡水生物細胞、器官、生化、個體急性、個體慢性以及種群毒性數(shù)據(jù)構(gòu)建穩(wěn)定SSD所需最小樣本量分別為5、5、8、22、9和9，海水生物基因、生化、個體急性、個體慢性以及種群毒性數(shù)據(jù)分別為5、9、17、10和8。

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