文靜，郭勇，邱麗娟

（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱150030；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/國家農(nóng)作物基因資源與遺傳改良重大科學(xué)工程/農(nóng)業(yè)部作物種質(zhì)資源與生物技術(shù)重點開放實驗室，北京100081）

0 引言

【研究意義】自1994年第一個商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因植物（FlavrSavr tomato）被批準(zhǔn)上市以來，植物基因工程技術(shù)在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用[1]。目前已有24個國家/地區(qū)種植了轉(zhuǎn)基因作物，42個國家/地區(qū)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因作物用于糧食、飼料和加工。全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積從1996年的170萬hm2增加到2018年的1.917億hm2，增長了113倍，而轉(zhuǎn)基因大豆作為種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物，種植面積達(dá)到全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的 50%[2]。隨著轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化和商業(yè)化程度的不斷擴(kuò)大，全球?qū)D(zhuǎn)基因食品安全、環(huán)境風(fēng)險和倫理問題的爭議加劇[3]，越來越多的國家和地區(qū)要求對轉(zhuǎn)基因食品和成分進(jìn)行標(biāo)識[4]。部分國家要求轉(zhuǎn)基因生物（genetically modified organism，GMO）含量需要低于一定閾值水平的限制。例如，歐盟將非轉(zhuǎn)基因背景下的轉(zhuǎn)基因物質(zhì)的閾值設(shè)定為0.9%[5]。因此，標(biāo)準(zhǔn)化的轉(zhuǎn)基因成分檢測和鑒定方法是轉(zhuǎn)基因發(fā)展和商業(yè)化的關(guān)鍵步驟，也在轉(zhuǎn)基因生物的安全評估和風(fēng)險管理中發(fā)揮了重要作用[6]?，F(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因檢測方法大多基于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），并由于其具有通用性、敏感性、特異性和高通量的特點，可用于復(fù)雜轉(zhuǎn)基因成分分析，包括篩查外源調(diào)控元件和目的基因，并對特定的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行鑒定[7]。多重PCR技術(shù)是在同一個PCR反應(yīng)體系中加入多對特異性引物，實現(xiàn)對多個靶標(biāo)的擴(kuò)增，更能節(jié)省轉(zhuǎn)基因生物檢測中時間和成本[8-9]。【前人研究進(jìn)展】呂山花等[10]應(yīng)用PCR檢測方法，以大豆凝集素（lectin）基因為內(nèi)參，檢測了4個抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆品種及草甘膦敏感大豆品種豫豆12的外源CaMV35S啟動子、NOS終止子和CP4-EPSPS成分。目前，中國允許進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因大豆有 16種（具體包括 A2704-12、CV127、MON87701、MON87769、GTS40-3-2、MON87708、305423、A5547-127、FG72、MON89788、SYHT0H2、MON87701×MON89788、DAS-44406-6、305423×GTS40-3-2、MON87705 和 356043，其中 MON87701×MON89788和305423×GTS40-3-2為復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因大豆），農(nóng)業(yè)部針對這些轉(zhuǎn)基因大豆品系發(fā)布的檢測方法以核酸檢測為主，但是其方法均為單重 PCR檢測。針對轉(zhuǎn)基因大豆建立系統(tǒng)的、高通量的由“公共引物”介導(dǎo)的多重PCR轉(zhuǎn)基因大豆檢測體系，可大幅降低檢測成本、提高檢測效率，為轉(zhuǎn)基因安全評價提供新的檢測技術(shù)和方法[11]。多重PCR檢測體系并不是多個單重 PCR體系檢測體系的簡單疊加，它需要對PCR體系和程序進(jìn)行反復(fù)試驗、優(yōu)化和驗證，保證多重PCR具有足夠的特異性、靈敏性和適用性，最終實現(xiàn)多個目標(biāo)片段的同時擴(kuò)增，因此，與普通PCR相比，難度更大[12]。近年來，國內(nèi)外有諸多學(xué)者對其進(jìn)行研究，并建立了許多關(guān)于通用元件、基因特異性和轉(zhuǎn)化事件特異性的多重PCR檢測體系[8,13-16]。尹全等[17]以抗草甘膦大豆GTS40-3-2的通用元件作為檢測參數(shù)，建立了大豆內(nèi)源基因lectin、CaMV35S啟動子、NOS終止子和CP4-EPSPS的四重PCR檢測體系。AO等[18]根據(jù)外源基因的特異性建立了適用于轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻中CP4-EPSPS、Cry1A(b)、BAR、PAT檢測的多重PCR方法。KIM等[19]針對RRS、GTS40-3-2、A2704-12、DP356043-5、MON89788、A5547-127 和DP305423-1 6個商業(yè)化轉(zhuǎn)基因大豆特異性事件，建立了包含內(nèi)參基因的七重PCR檢測體系。付偉等[20]以轉(zhuǎn)基因大豆 DAS44406-6品系為研究對象，利用Multiplex PCR技術(shù)與其他技術(shù)相結(jié)合，建立了多重實時熒光PCR檢測體系，檢測靈敏度為0.01%。【本研究切入點】目前，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因大豆的多重PCR技術(shù)都是針對通用元件和基因特異性進(jìn)行檢測，或者針對多個商業(yè)化特異性轉(zhuǎn)化事件進(jìn)行篩選，而單一轉(zhuǎn)化事件特異性鑒定鮮見報道[21]。在轉(zhuǎn)基因生物檢測中，轉(zhuǎn)化事件特異性檢測的目標(biāo)片段是外源基因和宿主DNA之間的連接區(qū)域，故比單純基因特異性檢測和通用元件檢測具有更高的特異性[22-23]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究基于轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)及要求，以轉(zhuǎn)基因大豆 ZH10-6為研究對象，針對內(nèi)參基因、外源基因和側(cè)翼序列設(shè)計 5對特異性引物，構(gòu)建了轉(zhuǎn)EPSPS/GAT大豆ZH10-6多重PCR反應(yīng)體系，并用本研究建立的多重 PCR檢測體系檢測了ZH10-6的 11個衍生品系，為中國抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆新品種目標(biāo)基因鑒定提供信息和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6、受體中黃10及11個ZH10-6衍生品系均為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所大豆基因資源挖掘與利用實驗室保存樣品。

1.2 樣品基因組DNA的提取

參照植物基因組提取試劑盒說明書提取樣品DNA，用紫外分光光度計測量DNA樣品質(zhì)量及濃度，并用1×TE緩沖液將DNA 稀釋至50 ng·μL-1。

1.3 引物的設(shè)計及篩選

使用軟件 Primer Premier 5.0 進(jìn)行引物設(shè)計，設(shè)計時遵從多重PCR檢測引物設(shè)計與篩選的原則，根據(jù)抗草甘膦大豆 ZH10-6和受體中黃 10的分子特征，設(shè)計大豆內(nèi)源參考基因（Actin）、外源基因（G2-EPSPS和GAT）以及側(cè)翼序列（G2EPSPS-2/ZH10P2和ZH10P1/GAT-2）的特異性引物（表1）。將各個檢測基因的上、下游引物使用滅菌的超純水稀釋為10 μmol·L-1。

表1 多重PCR標(biāo)記及其相關(guān)信息Table 1 The markers for multiplex PCR and their related information

1.4 引物特異性和適用性檢測

單重 PCR 反應(yīng)體系為 25 μL，包括 DNA 2 μL（50 ng·μL-1）、Ex Taq 酶 0.2 μL、10×ExTaq Buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、引物（10 μmol·L-1）0.6 μL 和ddH2O 17.7 μL。

多重 PCR 反應(yīng)體系為 25 μL，包括 DNA 2 μL（50 ng·μL-1）、Ex Taq 酶 0.2 μL、10×ExTaq Buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、引物（10 μmol·L-1，GmActin11 F/R 0.6 μL、G2-EPSPS F/R 0.6 μL、GAT F/R 0.6 μL、ZH10P1/GAT 0.6 μL、G2/ZH10P2 0.6 μL）和 ddH2O 15.3 μL。

單重和多重 PCR 反應(yīng)程序為 95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72 ℃ 1 min20 s 35個循環(huán)；72℃ 8 min；4℃保存。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測多重PCR產(chǎn)物，并利用凝膠成像系統(tǒng)觀察。

1.5 多重PCR反應(yīng)體系和程序的優(yōu)化

以轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6和受體中黃10的DNA為模板，將 5對引物的用量設(shè)置為 GmActin11 F/R 0.4 μL、G2-EPSPS F/R 0.6 μL、GAT F/R 0.4 μL、ZH10P1/GAT 0.6 μL 和 G2/ZH10P2 0.6 μL，DNA 模板量設(shè)置為100、150、200和250 ng 4個梯度，退火溫度設(shè)置為55℃、58℃和60℃，延伸溫度設(shè)置為 68℃和 72℃ 2 個梯度，dNTP 含量為 2、3、4 和 5 μL 4 個梯度，分別進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，篩選出五重PCR體系的最優(yōu)反應(yīng)條件。

1.6 多重PCR靈敏度檢測

為了驗證多重PCR體系靈敏性，將相同濃度的轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6和受體中黃10的基因組DNA按質(zhì)量比混合，制備成100%、50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%和0的DNA樣品。使用1.5建立的多重PCR體系及程序進(jìn)行多重PCR方法靈敏度檢測。

1.7 多重PCR體系的應(yīng)用

用建立的多重PCR體系對轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6衍生品系進(jìn)行檢測，包括東北地區(qū)和黃淮地區(qū)材料，進(jìn)一步驗證多重PCR體系的實用性。

2 結(jié)果

2.1 樣品 DNA 檢測

使用NanoDrop 2000/2000c超微量分光光度計測定樣品DNA濃度和質(zhì)量，經(jīng)測定，樣品OD260/OD230比值均為 2.0—2.2，OD260/OD280比值均為 1.8—2.0，說明提取的樣品DNA質(zhì)量較好。用1%瓊脂糖凝膠電泳對DNA樣品進(jìn)行檢測，僅1號樣品第三條帶有降解，該樣品不在后續(xù)試驗中使用，其余樣品幾乎無降解，符合多重PCR試驗要求（圖1）。將樣品DNA濃度稀釋至 50 ng·μL-1，備用。

圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳DNA檢測結(jié)果Fig. 1 DNA detection results of 1% agarose gel electrophoresis

2.2 引物特異性和適用性檢測

以轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6和受體中黃10的DNA為模板進(jìn)行5對引物特異性和適用性檢測。單引物擴(kuò)增時，5對引物均可在目的位置處觀察到特異性條帶，未觀察到明顯的非特異性條帶。5對引物同時擴(kuò)增時，轉(zhuǎn)基因大豆 ZH10-6可以擴(kuò)增出多條特異性條帶，但個別條帶相對微弱（圖2），表明這5對引物可以用于多重PCR區(qū)別ZH10-6和受體中黃10，但是需要進(jìn)一步調(diào)整擴(kuò)增條件。

2.3 多重PCR檢測體系的建立

多重PCR體系中，將5對引物用量均設(shè)置為0.6 μL時，部分條帶不能被擴(kuò)增（圖2）?？梢钥闯鲈诙嘀豍CR中，引物存在強(qiáng)弱之分，需要減少相對較強(qiáng)引物GmActin11 F/R和GAT F/R的用量。以條帶亮度作為參考，最終將5對引物的用量設(shè)置為GmActin11 F/R 0.4 μL、G2-EPSPS F/R 0.6 μL、GAT F/R 0.4 μL、ZH10P1/GAT 0.6 μL 和 G2/ZH10P2 0.6 μL。將 DNA模板量、退火溫度、延伸溫度和dNTP含量均設(shè)置為不同梯度，進(jìn)行同時擴(kuò)增（圖3），篩選多重PCR最適溫度和體系。

通過不同體系檢測（圖4），多重PCR擴(kuò)增最適體系為：DNA 2—4 μL、Ex Taq 0.2 μL、10×ExTaq Buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、引物（GmActin11 F/R 0.4 μL、G2-EPSPS F/R 0.6 μL、GAT F/R 0.4 μL、ZH10P1/GAT 0.6 μL 和 G2/ZH10P2 0.6 μL），ddH2O補(bǔ)足 25 μL。多重 PCR 擴(kuò)增最適程序為 95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，68 ℃ 1 min20 s ，35個循環(huán)；72 ℃ 1 2 min；4℃保存。最終擴(kuò)增產(chǎn)物長度為內(nèi)參基因 126 bp、外源基因G2-EPSPS430 bp、外源基因GAT338 bp、側(cè)翼序列 ZH10P1/GAT-2 810 bp、側(cè)翼序列 G2EPSPS-2/ZH10P2 1 626 bp。其中，受體中黃10除了可以擴(kuò)增出Actin內(nèi)參序列以外，還可以擴(kuò)增出ZH10-6 2對側(cè)翼序列的上游引物ZH10P1和下游引物ZH10P2的632 bp片段，而在ZH10-6中，由于插入外源基因過大，此段序列無法被擴(kuò)增出。因此，受體中黃 10可以被擴(kuò)增出 2條帶，而轉(zhuǎn)基因材料ZH10-6可以被擴(kuò)增出 5條帶，此體系可以用于鑒定ZH10-6和受體中黃10。

2.4 多重PCR體系靈敏度檢測

將模板DNA稀釋至設(shè)定濃度，通過多重PCR靈敏度試驗（圖5），隨著受體中黃10質(zhì)量分?jǐn)?shù)的上升，特異性片段632 bp的條帶逐漸變亮，而ZH10-6的5條帶則出現(xiàn)不同程度的減弱，特別是外源基因G2-EPSPS的 430 bp條帶和側(cè)翼序列 G2EPSPS-2/ZH10P2為1 626 bp條帶。因為在轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6和非轉(zhuǎn)基因大豆中黃 10混合后，相對于原有的多重PCR體系中增添了一重PCR反應(yīng)。靈敏度是非轉(zhuǎn)基因樣品中轉(zhuǎn)基因成分的最低檢測限，雖然圖5轉(zhuǎn)外源基因G2-EPSPS的430 bp條帶和側(cè)翼序列G2EPSPS-2/ZH10P2為1 626 bp條帶相比于其他條帶較弱，但是仍可以看出條帶所在位置。因此，只要樣品中含有0.5%以上的ZH10-6轉(zhuǎn)基因成分，利用此體系都能檢測出目標(biāo)條帶。說明建立的多重 PCR體系靈敏度可達(dá)0.5%，符合歐盟有關(guān)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識的要求。

2.5 多重PCR體系的應(yīng)用

以轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6衍生品系的DNA為模板，將 DNA 濃度稀釋成 50 ng·μL-1。用建立的多重 PCR體系待測大豆進(jìn)行多重擴(kuò)增，根據(jù)不同的條帶類型，判斷ZH10-6衍生品系中外源基因和側(cè)翼序列情況（圖6）。主要檢測到5種帶型（表2），類型1出現(xiàn)與受體中黃10相同帶型，認(rèn)為是未發(fā)生雜交的野生型；類型2出現(xiàn)與ZH10-6相同帶型；類型3和類型4分別以NZC400和NZK001為例，認(rèn)為是其他轉(zhuǎn)化事件；第5類帶型包含ZH10-6和受體ZH10的全部6條帶型，認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因雜合材料。在11份ZH10-6衍生品系中，NZC100和NZC400為黃淮材料，剩余為東北材料。用單重PCR對該擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行驗證，與多重PCR鑒定結(jié)果完全一致，證明建立的多重PCR體系可以鑒定轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6和受體中黃10，也可以鑒定不同地區(qū)的ZH10-6衍生品系，應(yīng)用性較為廣泛。

圖2 單基因特異性檢測結(jié)果Fig. 2 Single gene specific test results

表2 ZH10-6衍生品系類型Table 2 The derived lines of ZH10-6

圖3 梯度多重PCR檢測結(jié)果Fig. 3 Results of gradient multiple PCR

圖4 單重及多重PCR檢測ZH10-6及中黃10Fig. 4 Single and multiple PCR detection of ZH10-6 and ZH10

圖5 多重PCR靈敏度檢測Fig. 5 Results of multiple PCR sensitivity detection

圖6 ZH10-6衍生品系檢測Fig.6 Test results of ZH10-6 derivative lines

3 討論

PCR檢測技術(shù)是轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品中外源基因檢測的重要手段[24-25]，相比于普通PCR，多重PCR只需一個反應(yīng)和一次電泳就可同時檢出多個目標(biāo)片段，可極大地節(jié)約試劑和時間[26-27]，目前，已被廣泛應(yīng)用到醫(yī)學(xué)及生物等領(lǐng)域[28]。在研究過程中發(fā)現(xiàn)，不同引物序列的多重PCR在實際應(yīng)用中會受各項參數(shù)直接影響。

3.1 多重PCR體系中引物選擇的直接依據(jù)

本研究中選擇特異性強(qiáng)、引物二聚體少的5對引物進(jìn)行擴(kuò)增，其中包括起質(zhì)量控制作用的內(nèi)源基因，以避免轉(zhuǎn)基因檢測的假陰性結(jié)果出現(xiàn)。多重PCR擴(kuò)增時，各個引物的擴(kuò)增并非均一的，本研究通過5對引物等量加入時的條帶亮度對引物進(jìn)行強(qiáng)弱判斷，選擇各基因擴(kuò)增效率相對一致的引物濃度配比條件建立了多重PCR體系。引物設(shè)計是多重PCR反應(yīng)成敗的關(guān)鍵，需要遵循PCR引物設(shè)計通用準(zhǔn)則，即單條引物長度一般為18—25個堿基，且4種堿基的比例要適當(dāng)，G+C含量一般為40%—60%。同時，選擇的引物必須高度特異，彼此之間無同源性，且連續(xù)互補(bǔ)的堿基不超過 4個，避免出現(xiàn)交叉錯配等現(xiàn)象[29]。引物之間TM值盡可能相差較小，可以實現(xiàn)在同一退火溫度下的擴(kuò)增。

3.2 不同反應(yīng)體系和條件對多重 PCR體系建立的影響

在建立多重PCR反應(yīng)體系時，反應(yīng)體系和條件是關(guān)鍵因素[30-31]。反應(yīng)體系主要包括DNA模板量、dNTP含量等。本研究將DNA模板量從100 ng增加至250 ng時，擴(kuò)增效果沒有明顯變化，說明 DNA模板量對多重PCR體系擴(kuò)增影響較小。同時發(fā)現(xiàn)在多重PCR擴(kuò)增中，dNTP含量可以同單重 PCR擴(kuò)增設(shè)置一致，dNTP含量過高反而會抑制反應(yīng)。

反應(yīng)條件是另一個關(guān)鍵因素，主要包括退火溫度和延伸溫度。一般情況下，可以依據(jù)引物的TM值減少 5℃直接選擇退火溫度，但有時結(jié)果與預(yù)期并不一致。較為簡單的方法就是設(shè)置54℃為初始退火溫度，如果多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)生非特異性條帶，需適當(dāng)提高引物退火溫度，反之則降低引物退火溫度[32]。退火溫度應(yīng)在Tm值允許范圍內(nèi)選擇較高的溫度，以確保PCR反應(yīng)的特異性。但在這個過程中會出現(xiàn)目標(biāo)片段擴(kuò)增變?nèi)醯默F(xiàn)象，可以通過延長延伸時間來消除。同時適當(dāng)降低延伸溫度有利于目標(biāo)條帶的產(chǎn)生。本研究中設(shè)置了55℃、58℃和60℃ 3個退火溫度，68℃和72℃2個延伸溫度，最終在退火溫度為60℃，延伸溫度為68℃時，多重PCR體系擴(kuò)增效果最好。

3.3 目標(biāo)片段的選擇對多重PCR體系靈敏度的影響

在多重PCR目標(biāo)片段的選擇時，目標(biāo)片段必須具有高度特異性,避免目標(biāo)片段之間的競爭性擴(kuò)增，才能實現(xiàn)高效靈敏的擴(kuò)增反應(yīng)，建議PCR產(chǎn)物片段大小在200 bp以內(nèi)時，片段間隔大于30 bp；產(chǎn)物在500 bp以上時，片段間隔要大于 70 bp[33]。此外，各個目的片段長度應(yīng)差異明顯，以便于鑒別，但最大和最小片段最好相差不超過400 bp，否則會導(dǎo)致多重PCR體系靈敏度降低，且體系建立的難度較大。目前轉(zhuǎn)基因大豆多重PCR技術(shù)中，董立明等[34]選擇商品化早、種植面積大的5種轉(zhuǎn)基因大豆品系305423、MON89788、CV127、GTS40-3-2、356043及大豆內(nèi)源基因Lectin為研究對象，選用相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)中的引物，建立了能同時檢測5種轉(zhuǎn)基因大豆品系和大豆內(nèi)源基因的六重PCR檢測體系，檢測最大片段和最小片段相差400 bp，該體系能夠從0.1%及以上含量的陽性對照樣品中檢測出全部6種靶標(biāo)成分。本研究檢測的目標(biāo)片段是外源基因和宿主 DNA之間的連接區(qū)域，具有更高的特異性，擴(kuò)增最大目標(biāo)片段與最小片段之間高達(dá)1 500 bp，但靈敏度也能達(dá)到0.5%，完全符合歐盟有關(guān)轉(zhuǎn)基因標(biāo)識的要求。同時，該多重 PCR體系在ZH10-6和受體中黃10混合體系中，實現(xiàn)了六重PCR擴(kuò)增。

4 結(jié)論

通過設(shè)計內(nèi)參基因、外源基因和側(cè)翼序列引物并對反應(yīng)體系和條件進(jìn)行優(yōu)化，建立的轉(zhuǎn)EPSPS/GAT大豆多重PCR檢測體系具有高通量、特異性強(qiáng)、操作簡便和應(yīng)用廣泛的優(yōu)點，并且能夠快速、準(zhǔn)確地檢測轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6及其衍生品系。