王佳祺 張令歌 孫明姝 李勛亮 孫建平

[摘要] 目的 探討1，25-（OH）2D3是否能通過(guò)調(diào)節(jié)腎臟microRNA-21的表達(dá)延緩腎纖維化的進(jìn)展。方法將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、單側(cè)（左）輸尿管結(jié)扎組（UUO組）和1，25-（OH）2D3干預(yù)組（干預(yù)組），每組12只。UUO組和干預(yù)組采用單側(cè)（左）輸尿管結(jié)扎法建立梗阻性腎纖維化大鼠模型，Sham組僅游離左側(cè)輸尿管而不結(jié)扎。干預(yù)組給予0.06 μg/（kg·d）的1，25-（OH）2D3（溶于2 mL花生油）灌胃，持續(xù)28 d;Sham組和UUO組均給予等體積花生油灌胃。分別于灌胃14、28 d時(shí)，每組取6只大鼠，測(cè)定其血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、鈣（Ca）、磷（P）等水平;取左側(cè)腎臟相同部位組織制作病理組織切片，行蘇木精-伊紅染色和Masson染色，在光鏡下觀察腎小管間質(zhì)損傷及纖維化情況;采用RT-PCR法檢測(cè)各組腎組織microRNA-21的表達(dá)水平。結(jié)果 UUO組的腎纖維化面積大于干預(yù)組和Sham組。UUO組和干預(yù)組大鼠各時(shí)間點(diǎn)Scr、BUN以及microRNA-21表達(dá)水平均高于Sham組，但干預(yù)組較UUO組降低，差異均有顯著性（F=5.82～280.71，P<0.05）。結(jié)論 1，25-（OH）2D3可能通過(guò)下調(diào)microRNA-21表達(dá)，在一定程度上抑制腎纖維化并保護(hù)腎功能。

[關(guān)鍵詞] 骨化三醇;微RNAs;腎;纖維化;大鼠

[中圖分類號(hào)] R692;R977.24 ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A ?[文章編號(hào)] 2096-5532（2020）06-0640-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.149 [開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200714.1256.003.html;

[ABSTRACT] Objective To investigate the possibility of 1，25-（OH）2D3 delaying the progression of renal fibrosis by regulating the expression of microRNA-21 in the renal tissues. ?Methods A total of 36 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group （sham group）， left unilateral ureteral obstruction group （UUO group）， and 1，25-（OH）2D3 treatment group （treatment group）， with 12 rats in each group. The rats in the UUO group and treatment group underwent left unilateral ureteral obstruction to establish a rat model of obstructive renal fibrosis， while the rats in the sham group had their left ureter only dissociated from the kidney but not ligated. The rats in the treatment group were intragastrically administered 1，25-（OH）2D3 （dissolved in 2 mL peanut oil） at a dose of 0.06 μg/（kg·d） for 28 consecutive days; the rats in the sham group and UUO group were given the same volume of peanut oil by intragastric administration. On days 14 and 28 of the intragastric administration， six rats of each group were randomly selected for analysis. The levels of serum creatinine （SCr）， blood urea nitrogen （BUN）， serum calcium （Ca）， serum phosphorus （P） were measured; the renal tissues from the same part of the left kidney were collected to make histopathological sections for hematoxylin-eosin staining and Masson staining， and the pathological changes of renal tubulointerstitial injury and fibrosis were observed under an optical microscope; RT-PCR was employed to measure the expression of microRNA-21 in the renal tissues of the rats in each group. ?Results The renal tubulointerstitial fibrosis area was significantly larger in the UUO group than in the sham group and treatment group. The UUO group and treatment group had significantly higher SCr and BUN as well as expression of microRNA-21 than the sham group at all time points， but the treatment group had significantly lower indicators listed above compared with the UUO group （F=5.82-280.71，P<0.05）. ?Conclusion 1，25-（OH）2D3 can inhibit the progression of renal fibrosis and protect renal function to a certain extent， possibly by down-regulating the expression of micro-RNA-21 in the renal tissues.

2.2 血清指標(biāo)的比較

2.2.1 Scr 時(shí)間主效應(yīng)顯著（F=20.339，P<0.05），組別主效應(yīng)顯著（F=60.566，P<0.05），組別與時(shí)間無(wú)交互效應(yīng)（F=2.023，P>0.05）。干預(yù)組、UUO組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的Scr水平均高于Sham組，干預(yù)組低于UUO組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.242～8.695，P<0.05）。組內(nèi)比較，Sham組術(shù)后14 d與28 d比較差異無(wú)顯著性，干預(yù)組和UUO組術(shù)后28 d Scr水平高于術(shù)后14 d，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.667、3.156，P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.2.2 BUN 時(shí)間主效應(yīng)顯著（F=8.585，P<0.05），組別主效應(yīng)顯著（F=280.706，P<0.05），組別與時(shí)間交互效應(yīng)顯著（F=5.822，P<0.05）。干預(yù)組、UUO組大鼠各時(shí)間點(diǎn)BUN水平均高于Sham組，干預(yù)組低于UUO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.188～17.980，P<0.05）。組內(nèi)比較，Sham組和UUO組術(shù)后14 d與28 d比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，干預(yù)組術(shù)后28 d高于術(shù)后14 d，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.087，P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.2.3 Ca和P 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)Ca、P水平比較差異均無(wú)顯著性（P>0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 病理學(xué)改變

2.3.1 HE染色 Sham組大鼠腎組織未見(jiàn)明顯病理改變。術(shù)后14 d，UUO組可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞彌漫性腫脹、變性、萎縮，管腔擴(kuò)張，腎小管結(jié)構(gòu)紊亂、變形，多數(shù)腎小管基底膜喪失;腎間質(zhì)增寬，間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);腎小球病理改變不明顯。術(shù)后28 d，腎間質(zhì)明顯增寬，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維化程度加深。相對(duì)于UUO組，干預(yù)組同一時(shí)間點(diǎn)腎間質(zhì)病變程度較輕，腎小管基底膜多呈不規(guī)則改變，部分視野腎間質(zhì)、腎小管損傷不明顯，腎間質(zhì)纖維化相對(duì)面積明顯減少。各組均未見(jiàn)鈣化點(diǎn)、鈣化灶。

2.3.2 Masson染色 Sham組大鼠腎間質(zhì)未見(jiàn)明顯陽(yáng)性染色。隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，UUO組大鼠腎間質(zhì)中膠原纖維陽(yáng)性染色面積增大，術(shù)后14 d可見(jiàn)多數(shù)腎小管管腔擴(kuò)張，腎間質(zhì)增寬，纖維組織增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);術(shù)后28 d上述情況加劇。與UUO組相比，干預(yù)組在相同時(shí)間點(diǎn)的膠原沉積程度和腎小管管腔擴(kuò)張程度顯著減輕。見(jiàn)圖1。

2.4 各組大鼠腎組織microRNA-21表達(dá)的比較

時(shí)間主效應(yīng)顯著（F=25.170，P<0.05），組別主效應(yīng)顯著（F=34.051，P<0.05），組別與時(shí)間交互效應(yīng)顯著（F=7.088，P<0.05）。干預(yù)組、UUO組大鼠各時(shí)間點(diǎn)microRNA-21表達(dá)均高于Sham組，干預(yù)組較UUO組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.093～8.330，P<0.05）。組內(nèi)比較，Sham組和干預(yù)組術(shù)后14 d與28 d比較差異無(wú)顯著意義，UUO組術(shù)后14 d的microRNA-21表達(dá)水平低于術(shù)后28 d（1.00±0.00 vs 2.16±0.60），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.801，P<0.05）。見(jiàn)表3。

2.5 microRNA-21表達(dá)與腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系

參考崔炯等[17]的方法對(duì)Masson染色腎間質(zhì)纖維化程度進(jìn)行評(píng)分，并與microRNA-21的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，microRNA-21表達(dá)與腎間質(zhì)纖維化程度呈顯著正相關(guān)（r=0.881，P<0.05）。

3 討 ?論

腎纖維化以成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的異常沉積為特征，伴隨腎小球硬化、腎小管萎縮、腎間質(zhì)炎癥、實(shí)質(zhì)細(xì)胞丟失，腎功能逐漸喪失，其過(guò)程復(fù)雜，如何逆轉(zhuǎn)或延緩腎纖維化進(jìn)展仍是目前研究的重點(diǎn)[18]。1，25-（OH）2D3與維生素D受體（VDR）特異性結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。VDR分為膜VDR（mVDR）和核VDR（nVDR）兩大類。mVDR主要參與控制礦物質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡;nVDR參與基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化，在抗炎、抗癌、抗氧化、抗纖維化以及免疫調(diào)節(jié)中起重要作用[19-21]。目前，活性維生素D用于CKD與透析病人中以糾正鈣磷代謝紊亂已達(dá)成專家共識(shí)[22]。

隨著研究的深入，microRNAs作為生物學(xué)靶點(diǎn)治療各種疾病已受到學(xué)界的廣泛關(guān)注。既往研究結(jié)果表明，腎纖維化與microRNAs的表達(dá)有著密切的關(guān)系[12]。TGF-β是腎纖維化的關(guān)鍵因子，既可由microRNA-21進(jìn)行調(diào)節(jié)，又可通過(guò)Smad3信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)microRNA-21表達(dá)，microRNA-21與TGF-β/Smad3信號(hào)途徑之間存在正反饋調(diào)節(jié)[23]。UUO（單側(cè)輸尿管梗阻）模型是以加速的方式模仿人類慢性阻塞性腎病[24]。在本研究中，UUO組大鼠Scr水平升高，腎小管擴(kuò)張明顯，多數(shù)腎小管基底膜完全喪失，間質(zhì)顯著增寬，可見(jiàn)到大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維組織增生，腎間質(zhì)損傷及纖維化程度增高，提示UUO模型建立成功。隨著UUO模型大鼠腎纖維化的進(jìn)展，microRNA-21的表達(dá)水平增加且與腎纖維化程度呈顯著正相關(guān)，表明microRNA-21參與腎纖維化的過(guò)程并隨腎纖維化的進(jìn)展其表達(dá)水平增高。與UUO組相比，干預(yù)組大鼠Scr水平降低，且HE染色、Masson染色結(jié)果也顯示，干預(yù)組大鼠腎小管間質(zhì)損傷及纖維化程度明顯改善，表明1，25-（OH）2D3在一定程度上具有延緩UUO模型大鼠腎小管間質(zhì)纖維化、保護(hù)腎功能的作用，這與既往研究結(jié)果一致[12，16，25]。隨著時(shí)間的進(jìn)展，Sham組大鼠腎臟組織形態(tài)未見(jiàn)明顯變化，而UUO組和干預(yù)組大鼠腎臟組織的纖維化面積逐漸增大，提示1，25-（OH）2D3雖然可以延緩UUO模型大鼠腎纖維化進(jìn)展，但不能逆轉(zhuǎn)腎纖維化。各組血Ca、P水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明1，25-（OH）2D3的抗纖維化作用不依賴于鈣磷調(diào)節(jié)途徑。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，1，25-（OH）2D3與其受體結(jié)合可降低Smad3的轉(zhuǎn)錄活性，抑制TGF-β的表達(dá)，從而抑制腎纖維化[16，25]。因此，1，25-（OH）2D3與microRNA-21存在共同的調(diào)控腎纖維化的途徑，即TGF-β/Smad3。本文研究結(jié)果顯示，Sham組大鼠腎組織microRNA-21的表達(dá)水平低于UUO組和干預(yù)組，而干預(yù)組大鼠腎組織microRNA-21的表達(dá)低于UUO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明1，25-（OH）2D3可能下調(diào)了大鼠腎組織中microRNA-21的表達(dá)水平。

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（本文編輯 馬偉平）