洪旭升，李世貴，楊江偉，羅紅玉，張寧,司懷軍,3

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅省干旱生境作物學(xué)省部共建國家重點實驗室培育基地，甘肅 蘭州 730070)

鈣依賴性蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase，CDPKs)是細(xì)胞鈣調(diào)節(jié)信號級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵樞紐，參與植物感知非生物、生物脅迫刺激的應(yīng)激信號和生長發(fā)育過程中的激素調(diào)節(jié)等[1].CDPKs以Ca2+標(biāo)記編碼的信息調(diào)控下游特定目標(biāo)蛋白的磷酸化，從而將Ca2+感應(yīng)與特定單個蛋白的響應(yīng)功能結(jié)合在一起.這些單體酶具有絲氨酸/蘇氨酸(S/T)蛋白激酶催化域(KD)，其特征子域(I-XI)通過自抑制域或連接區(qū)(AD)與鈣調(diào)蛋白樣域融合(CLD).CDPKs已經(jīng)在綠藻、被子植物，包括雙子葉植物和單子葉植物中被鑒定出來[2-3].除了植物界，CDPKs只存在于頂復(fù)門寄生蟲和纖毛蟲中[4-5].

被子植物中，CDPKs家族由16～47個成員組成.通常，其成員在系統(tǒng)發(fā)育上被分為4個亞家族(I-IV)，其第二和第三亞家族可分為2組(a和b)[6].CDPKs基因在原始被子植物中具有多樣性，但KD、AD和CLD在進(jìn)化中維持序列高度保守導(dǎo)致了許多CDPKs之間的功能相似性、序列冗余和重疊.CDPKs的激酶活性和表達(dá)模式依賴于其N端的可變域(NTV)、亞細(xì)胞定位、動力學(xué)參數(shù)、底物特異性、Ca2+濃度等，這表明不同基因可以感知不同的刺激并發(fā)揮特定的作用.來自I和II的CDPKs亞型在CLD中含有4個EF-hand基序，而來自組III或組IV的一些亞型僅含3個EF-hand基序[7].

研究表明CDPKs基因可響應(yīng)逆境脅迫，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及植物的免疫反應(yīng)，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用.在擬南芥抗鹽堿脅迫中AtCDPK3基因具有重要作用[8-9]，AtCDPK4基因與ABA通路中的轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)節(jié)植物的耐旱性[10]，AtCDPK6/9/10/11/12/32基因均參與ABA信號通路中的干旱應(yīng)答過程[11-16]，而AtCDPK5基因參與植物免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)[17].CDPKs基因的功能在水稻中也被大量報道，如OsCDPK1基因能夠提高水稻的抗旱性，調(diào)節(jié)赤霉素的合成和促進(jìn)種子的萌發(fā)[18].OsCPK12基因與提高耐鹽性、增強(qiáng)抗病能力、誘導(dǎo)活性氧生成和葉片衰老有關(guān)[19-20].OsCPK31基因參與淀粉的合成，并促進(jìn)籽粒的早充[21].茄屬植物番茄中，CDPKs基因在抗病方面有較多研究，如SlCDPK10和SlCDPK18基因具有抗白葉枯病菌、稻瘟病菌和丁香假單胞菌等作用[22].

由于灌溉方式、肥料使用不當(dāng)以及工業(yè)污染，土壤鹽堿度有所提高[23].高鹽度通常是由于土壤溶液中Na+和Cl-的濃度高，導(dǎo)致高滲和高離子條件，從而阻礙植物從土壤吸收水和養(yǎng)分[24].大多數(shù)農(nóng)作物都是糖類植物，而鹽分脅迫會影響其生長和生產(chǎn)力[25].

Fantino等[26]、龔記熠等[27]和Gromadka等[28]分別在馬鈴薯中鑒定出26、21和23個StCDPKs基因家族成員；龔記熠等[27]的鑒定中一個基因不屬于StCDPKs基因家族；一個StCDPKs基因在Fantino等[26]的鑒定中不存在；而Gromadka等[28]的鑒定結(jié)果與Fantino等[26]的鑒定相一致.本研究通過兩類隱馬爾科夫模型來鑒定馬鈴薯StCDPK基因家族成員，分析該家族成員的基因結(jié)構(gòu)、Motif、保守結(jié)構(gòu)域、進(jìn)化和組織表達(dá)特異性，并利用qRT-PCR分析鹽脅迫下StCDPKs基因的表達(dá)情況，以期為深入研究馬鈴薯StCDPKs基因在鹽脅迫中的功能提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以馬鈴薯栽培品種‘大西洋’原種為試驗材料，以盆栽的方式種植，其中營養(yǎng)土和蛭石比例為2∶1，利用自然光照并在正?？厮臈l件下生長，培養(yǎng)75 d后分別采取根、莖、葉、花和塊莖，速凍保存于-80 ℃冰箱；鹽脅迫處理使用200 mmol/L NaCl澆灌植株[29]，分別在處理0、1、2、4、8和16 h時采取植株葉片，速凍后保存于-80 ℃冰箱.

1.2 馬鈴薯StCDPKs基因的篩選與鑒定

從Ensembl中(http://asia.ensembl.org/index.html)下載馬鈴薯全蛋白組序列，在Pfam(https://pfam.xfam.org/)中下載CDPKs基因2個主要結(jié)構(gòu)域的隱馬爾科夫模型文件(HMM文件):蛋白激酶(PF00069)和EF-hand結(jié)構(gòu)域(PF13499)，以及其他8個EF-hand的HMM文件.通過執(zhí)行HMMER程序來搜索并提取所有擁有蛋白激酶和EF-hand結(jié)構(gòu)域的蛋白序列[30].用在線分析軟件InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)對候選基因做進(jìn)一步驗證，用ExPASy(https://web.expasy.org/protscale/)分析StCDPKs蛋白的理化性質(zhì).

1.3 馬鈴薯StCDPKs基因結(jié)構(gòu)分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

用在線工具GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)可視化并分析馬鈴薯StCDPKs基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)[31].用在線服務(wù)器MEME server(http://alternate.meme-suite.org/)對已鑒定StCDPKs基因的Motif進(jìn)行檢測，并在InterPro中識別保守結(jié)構(gòu)的名稱.用MEGA 6.0軟件構(gòu)建馬鈴薯StCDPKs蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，并用TBtool繪制成可視化圖譜.選取27個馬鈴薯CDPKs基因、36個擬南芥CDPKs基因和28個番茄CDPKs基因蛋白序列，用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹.

1.4 馬鈴薯StCDPKs基因的轉(zhuǎn)錄分析

從PGSC(the potato genome sequencing consortium)數(shù)據(jù)庫(http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/pgsc_download.shtml)中下載相應(yīng)的馬鈴薯SCDPKs基因的RNA測序數(shù)據(jù).使用TBtools軟件繪制馬鈴薯StCDPKs基因組織特異性轉(zhuǎn)錄和不同脅迫下轉(zhuǎn)錄的可視化圖譜.

1.5 qRT-PCR分析馬鈴薯StCDPKs基因的表達(dá)

用Linux提取馬鈴薯StCDPKs基因的CDS序列，并利用DNAMAN設(shè)計定量擴(kuò)增的引物.用TIANGEN的植物總RNA提取試劑盒(DP432)分別提取不同樣品的總RNA，用cDNA合成試劑盒(KR118)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用qRT-PCR試劑盒進(jìn)行定量檢測.使用2-ΔΔCT方法分析StCDPKs基因的相對表達(dá)量，用Origin軟件作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯StCDPKs基因的篩選和理化性質(zhì)

本研究共鑒定出27個馬鈴薯StCDPKs基因，其中StCDPK3基因和StCDPK5基因已在NCBI中注冊.使用Fantino等[26]的命名方法，將Fantino等[26]中沒有的一個基因命名為StCDPK27.27個基因中5個基因擁有兩個轉(zhuǎn)錄本，可能是同一個基因通過不同的剪接形式翻譯成兩種蛋白質(zhì).馬鈴薯StCDPKs基因大多數(shù)有4個EF-hand，并兩兩成對，但StCDPK27基因只含有2個EF-hand(表1)，說明StCDPKs在EF-hand結(jié)構(gòu)域處有很高的保守性.大多數(shù)StCDPKs蛋白質(zhì)的氨基酸為500～640個，只有3個蛋白氨基酸少于500個.1和10號染色體各分布有5個StCDPKs基因成員，其余StCDPKs基因分布于其他染色體，而9號染色體上沒有StCDPKs基因.StCDPKs蛋白質(zhì)中有47%的蛋白是穩(wěn)定的.大多數(shù)StCDPKs蛋白呈中性，但是StCDPK25a和StCDPK26兩個蛋白呈堿性，StCDPK6b呈酸性.說明StCDPK6/25/26基因的不同剪接體在不同pH條件下具有特定的功能.

2.2 馬鈴薯StCDPKs基因的結(jié)構(gòu)、Motif與進(jìn)化樹分析

基因結(jié)構(gòu)分析顯示顯示，11個馬鈴薯StCDPKs基因(CDPK4/6/8/11/14/15/16/17/18/19)位于同一分支上，它們大多含有7個外顯子，只有StCDPK15基因含有8個外顯子.StCDPK17/18/19基因的Motif中缺少前端一個未知功能結(jié)構(gòu)域(圖1-B)，且這3個基因在同一分枝上.StCDPK1基因是最長的，擁有9個外顯子，保守結(jié)構(gòu)域與StCDPK6基因的相同.與StCDPK1基因在同一進(jìn)化分枝上的基因都含有8個外顯子，但StCDPK13和StCDPK10基因含有9個外顯子.StCDPK12基因與StCDPK17/18/19基因的保守結(jié)構(gòu)域相似.StCDPK20/21/22/23/245個基因進(jìn)化有差異，StCDPK21基因含有7個外顯子，而StCDPK20基因含有9個外顯子，其余基因都含有8個外顯子.這5個基因編碼的蛋白在C末尾都多出一個Motif.說明StCDPKs基因的結(jié)構(gòu)和Motif分布差異性較小.StCDPK27基因含有8個外顯子，Motif和保守結(jié)構(gòu)域與其他類似，主要結(jié)構(gòu)缺少2個EF-hand，進(jìn)化上不屬于現(xiàn)有的4類亞家族，而與Ⅳ型亞家族接近，說明StCDPK27基因?qū)儆赟tCDPKs基因家族，但在進(jìn)化上與其他基因有所區(qū)別.

以36個擬南芥、29個番茄和27個馬鈴薯的CDPKs蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹表明，進(jìn)化樹擁有4個亞家族(Ⅰ-Ⅳ型)，而Ⅱ型分為兩個小亞家族.StCDPK4/5/6/7/8/11/14/15/16/17/18/19聚類于Ⅰ型亞家族.StCDPK1/2/3/12與StCDPK9/10/13聚類于Ⅱa型和Ⅱb型亞家族，StCDPK20/21/22/23/24聚類于Ⅲ型亞家族，StCDPK25/26聚類于Ⅳ型亞家族，而StCDPK27沒有聚類于4個亞家族中，但與Ⅳ型基因相近(圖2).

紅色的不規(guī)則六邊形代表外顯子，藍(lán)色的直線代表內(nèi)含子.每個motif信息都由InterPro進(jìn)行注釋.The irregular hexagons in red represent exons，and the straight lines in blue represent introns.Each motif information is annotated by InterPro.圖1 25個StCDPKs基因的結(jié)構(gòu)(A)和Motif分布模式(B)Figure 1 Structural (a) and motif distribution patterns (b) of 25 StCDPKs genes

紅色五角星為馬鈴薯，藍(lán)色三角形為擬南芥，黃色正方形為番茄.The red pentagram represents potato，the blue triangle represents Arabidopsis，and the yellow square represents tomato.圖2 36個擬南芥、29個番茄和27個馬鈴薯CDPKs蛋白通過MEGA6.0構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 2 Phylogenetic tree constructed by MEGA6.0 using 36 A.thaliana，29 tomato,and 27 potato CDPKs protein sequences

2.3 馬鈴薯StCDPKs基因轉(zhuǎn)錄本分析

用馬鈴薯數(shù)據(jù)庫PGSC中的RNA測序數(shù)據(jù)制作不同組織和不同脅迫下StCDPKs基因表達(dá)的可視化熱圖(圖3～4).結(jié)果顯示，StCDPK2基因在葉和葉柄中有較高的表達(dá)水平，果實和花中基本不表達(dá).StCDPK4基因在根、葉片、萼片、心皮中表達(dá)較高，在塊莖中表達(dá)較低，而在其他組織中有中等表達(dá)水平.StCDPK22基因在芽、葉柄、匍匐莖、心皮和未成熟果實中有較高的表達(dá)水平，而在花中有較低的表達(dá)水平.StCDPK25基因在塊莖和匍匐莖中表達(dá)較高，其余組織為中下表達(dá)水平.StCDPK13和23基因在成熟花中有較高表達(dá)水平，這表明馬鈴薯StCDPKs基因家族可能參與調(diào)控馬鈴薯的生長發(fā)育.StCDPK22基因在生物和非生物脅迫中的表達(dá)量高于其他基因，StCDPK2/4/6/21/25基因表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平，而7個基因(StCDPK1/7/9/17/18/23/24)的表達(dá)水平偏低，其余的12個StCDPKs基因在不同脅迫中基本不表達(dá)，這表明StCDPKs基因家族成員可能與馬鈴薯響應(yīng)各種應(yīng)激脅迫有關(guān).

藍(lán)色陰影表示基因的低表達(dá)，紅色陰影表示基因的高表達(dá)，中間轉(zhuǎn)錄水平用黃色表達(dá).Blue shading indicates low gene expression，red shading indicates high gene expression，and intermediate transcription levels are expressed in yellow.圖3 StCDPKs基因在馬鈴薯不同組織器官中的表達(dá)量Figure 3 StCDPKs gene expression in different tissues and organs of potato

紅色為高表達(dá)，藍(lán)色為低轉(zhuǎn)錄或不表達(dá)，黃色為中度表達(dá).每次處理時間為24 h.Red is high expression，blue is low transcription or no expression，yellow is moderate expression.Each processing time is 24 h.圖4 StCDPKs基因在不同處理下的表達(dá)模式Figure 4 StCDPKs gene expression pattern under different treatments

2.4 馬鈴薯StCDPKs基因的表達(dá)模式分析

通過qRT-PCR分析馬鈴薯StCDPKs基因在根、莖、葉、花和塊莖中的表達(dá)水平(圖5)，結(jié)果顯示，StCDPK1/2/19基因在花中的表達(dá)量高于葉中，其他3個組織中的表達(dá)量都低于葉片.與熱圖中表達(dá)量有所差異：StCDPK1基因根、莖、花和塊莖中的表達(dá)量均高于葉片；StCDPK2基因在塊莖中的表達(dá)量高于葉片，而根、莖和花中則低于葉片；StCDPK19基因在根中的表達(dá)量低于葉片，莖、花和塊莖中的表達(dá)量均高于葉片.在根中StCDPK8/10/11/21/25基因表達(dá)量低于葉片中，但是這5個基因在其他組織中的表達(dá)都高于葉片中.StCDPK17/20/223個基因與StCDPK8/10/11/21/25基因表達(dá)有類似的模式，這3個基因在莖中有較高的表達(dá)，而在根、葉、花和塊莖中表達(dá)較低.StCDPK23基因相對于葉片，在花和莖塊中表達(dá)較高，而在根和莖中較低.StCDPK12/16/18/244個基因在花和莖中的表達(dá)量高于葉片中的表達(dá)量，而在根和塊莖則相反.StCDPK13/142個基因在莖和塊莖中相對于葉片有較高的表達(dá)，但在根和花中較低.

顯著性分析使用鄧肯法，P<0.05.Significance analysis using Duncan method，P<0.05.圖5 27個StCDPKs基因在不同組織中的相對表達(dá)量(以葉片的表達(dá)為對照)Figure 5 The relative expression levels of 27 StCDPKs genes in different tissues were compared with those in leaves

StCDPK3/4/6/7/26/276個基因在葉片中的表達(dá)量均低于根、莖、花和塊莖，而StCDPK9和StCDPK15基因在葉片中表達(dá)量最高.StCDPK4/6/7基因在二倍體測序中的表達(dá)量與試驗相符，說明二倍體馬鈴薯和四倍體馬鈴薯在基因表達(dá)上具有差異性.

用200 mmol/L的NaCl模擬鹽脅迫處理馬鈴薯，在不同處理時間點采集樣品進(jìn)行StCDPKs基因定量分析.結(jié)果表明，StCDPK8/10/11/18/22基因在鹽脅迫不同時間表達(dá)量都高于對照，StCDPK20/21基因在鹽脅迫初期表達(dá)較高，但在16 h時表達(dá)量降低.StCDPK2/3/15/17/24/25/27基因在鹽脅迫后期具有較高的表達(dá)量，而StCDPK9/12/13/19/23/26基因則在前期表達(dá)較高到后期降低.StCDPK1/4/7基因在不同時間表達(dá)不相同，StCDPK5/6/14基因在前期和后期表達(dá)高于中期，但StCDPK16基因則相反(圖6).

3 討論

CDPKs蛋白激酶在植物生長發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答過程中具有極其重要的作用.目前，CDPKs基因在大約60多種植物中被鑒定出來，其中在擬南芥中鑒定出34個，煙草中鑒定出15個[32]，番茄中鑒定出29個[22].本研究通過隱馬爾科夫模型(PF00069和PF13499)，使用HMMER程序比對目前最新的馬鈴薯全蛋白序列鑒定了馬鈴薯StCDPKs基因成員.Fantino等[23]從不同數(shù)據(jù)庫中檢索得到馬鈴薯CDPKs基因，其鑒定的StCDPK23和24基因含有3個EF-hand結(jié)構(gòu)域，但這兩個基因擁有4個EF-hand結(jié)構(gòu)域.StCDPK22基因從進(jìn)化上看擁有4個EF-hand結(jié)構(gòu)域，但在InterPro預(yù)測擁有2個EF-hand.StCDPK27基因則有2個EF-hand結(jié)構(gòu)域.27個基因中有5個(StCDPK4/6/13/25/27)含有2個轉(zhuǎn)錄本，其中StCDPK6/25基因兩個轉(zhuǎn)錄本之間的氨基酸數(shù)各相差260和245個氨基酸，可能具有功能的特異性.

顯著性分析使用鄧肯法，P<0.05.Significance analysis using Duncan method，P<0.05.圖6 27個StCDPKs基因在鹽處理下不同時間的相對表達(dá)量(以0 h的表達(dá)為對照)Figure 6 The relative expression levels of 27 StCDPKs genes at different time under salt treatment were compared with that at 0 h

StCDPKs基因的EF-hand結(jié)構(gòu)域具有較高的保守性，StCDPK1-5基因的保守結(jié)構(gòu)域和Motif沒有不同，但是在位置上有所差異.內(nèi)含子和外顯子個數(shù)差異不大，大部分基因含有7或8個外顯子，而StCDPK3/11基因的外顯子多達(dá)12個.梨的CDPKs基因大多數(shù)也有7或8個外顯子，最多有11個[33].構(gòu)建進(jìn)化樹分析了擬南芥、番茄和馬鈴薯CDPKs基因編碼的蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系，從進(jìn)化分枝上看StCDPKs基因分布于各個亞家族，其中Ⅰ型最多，而且相近的基因具有相似的功能.StCDPK4/5基因都具有抗病菌能力[34-35]，而AtCDPK8/10基因能夠提高植株的抗旱性[13，36].

馬鈴薯StCDPKs基因空間表達(dá)轉(zhuǎn)錄可視化圖譜可分為3類.第一類表達(dá)具有明顯的組織特異性，如StCDPK10/13/20基因在葉、莖、根等組織中很少有表達(dá)，而僅在成熟的花中具有較高的表達(dá).小麥TaCDPK3基因在未成熟種子中未檢測到表達(dá)，而TaCDPK13基因在葉、幼穗和未成熟的種子中有表達(dá)，而在根、莖中沒有表達(dá)[37].第二類在各組織中表達(dá)都較低或者不表達(dá)，表達(dá)沒有特異性.如StCDPK8/11/12/14/15/16基因等在不同組織中都表現(xiàn)出較低表達(dá)水平或不表達(dá).擬南芥CDPK3/8/12基因在根、莖、葉和花中具有一致的表達(dá)性[38].第三類在各組織中都有轉(zhuǎn)錄而且具有明顯的差異性.如StCDPK25基因在塊莖中表達(dá)最高，在其他組織中表達(dá)沒有一致性.以上結(jié)果表明，馬鈴薯StCDPKs基因在不同組織中各自的功能可能不同.

小麥TaCDPK7/12基因在鹽脅迫、干旱脅迫和ABA信號通路扮演著重要角色[39].擬南芥AtCDPK1基因與AtCDPK1a基因在鹽脅迫下表達(dá)量顯著上調(diào)[40].鹽脅迫條件下，相對于0 hStCDPK8/10/11/18/22基因在其他時期表達(dá)量均高，StCDPK8/10/11/18/22基因可能在鹽脅迫的整個時期對提高植株的耐鹽性具有積極作用.部分基因的表達(dá)模式恰恰相反，例如：StCDPK27基因在1 h表達(dá)降低，但隨表達(dá)時間增加均增加，而StCDPK9/26基因的表達(dá)模式與之剛好相反，同樣的StCDPK5/19與StCDPK16和StCDPK13與StCDPK17/14基因表達(dá)模式也相反.StCDPK2/3/15基因在鹽脅迫前期表達(dá)較低，而到后期則有較高的表達(dá).這說明在鹽脅迫下，StCDPK8/10/11/18/22基因在脅迫整個時期發(fā)揮著重要作用，而StCDPK2/3/15基因在脅迫后期發(fā)揮著作用.

4 結(jié)論

本研究鑒定出27個馬鈴薯StCDPK基因成員，可分為4個亞家族，其基因結(jié)構(gòu)相似，催化區(qū)域的EF-hand具有較高的保守性.StCDPKs基因在不同組織和鹽脅迫下具有不同的表達(dá)模式.