黃玉嵐，霍小東，姚宏明，于海娜，高長斌，代發(fā)文,3*

（1.北京大偉嘉生物技術(shù)股份有限公司，北京 100085；2.北京市飼用微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心，北京 100085；3.樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川樂山 614000）

隨著動(dòng)物飼料中促生長類抗生素添加劑的全面禁用，尋找安全綠色的替代品成為亟待解決的問題。可調(diào)控腸道菌群的益生菌成為一種有效的抗生素替代品。枯草芽孢桿菌具有耐酸、耐膽鹽等特性，能夠在胃腸道等各種環(huán)境中生存[1]，使其在養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。此外，枯草芽孢桿菌是被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部（公告第2045 號(hào)）列為可直接在飼料中添加使用的添加劑。已有研究表明，飼糧中添加枯草芽孢桿菌可促進(jìn)仔豬的生長發(fā)育[2-4]。目前，枯草芽孢桿菌對(duì)仔豬腸道菌群的研究還較少。本試驗(yàn)旨在研究日糧中添加枯草芽孢桿菌對(duì)仔豬生長性能、腸道形態(tài)和腸道菌群的影響，為枯草芽孢桿菌在仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株 枯草芽孢桿菌WEI-62 為本實(shí)驗(yàn)室分離所得，并通過形態(tài)學(xué)、生化試驗(yàn)和序列比對(duì)鑒定為枯草芽孢桿菌?？莶菅挎邨U菌高濃度菌粉的主要成分為枯草芽孢桿菌，活菌數(shù)≥2×1011CFU/g。大腸桿菌CVCC1570 和產(chǎn)氣莢膜梭菌CICC22949 分別購自中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心和中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2 菌株的體外益生特性

1.2.1 耐酸和耐膽鹽的測定 枯草芽孢桿菌的耐酸性和耐膽鹽的檢測參考文獻(xiàn)[5-7]方法進(jìn)行測定：①耐人工胃液和人工腸液試驗(yàn)?？莶菅挎邨U菌在LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h 后，離心（8 000×g，4℃，10 min）收集菌體，用PBS 洗滌2 次后重懸于人工胃液[5-6]（將3 g/L 的胃蛋白酶加入到0.85%NaCl 溶液中，分別調(diào)節(jié)pH 2.0、pH 2.5、pH 3.0）或人工腸液[7]（將1 g/L 的胰酶加入到含有0.3%、0.5%和1.0%膽鹽的等滲緩沖液中，分別調(diào)節(jié)pH 至8.0）中，37℃培養(yǎng)3 h 后測定活菌數(shù)。②耐人工胃腸液試驗(yàn)。先將PBS 洗滌后的菌體重懸于pH 2.0的人工胃液中，37℃培養(yǎng)3 h 后，取樣測定活菌數(shù)，其余懸液離心再重懸于0.3%膽鹽的人工腸液中，37℃培養(yǎng)3 h 后測定活菌數(shù)。

1.2.2 體外抑菌活性的測定 分別采用挖塊法[8]和雙層打孔法[9]檢測枯草芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌活性。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取健康、體重相近（7.26±1.35）kg的25日齡二元仔豬（長白×大白）216 頭，隨機(jī)分為2 組，每組6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)18 頭豬。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧中添加1×106CFU/g 飼料重的枯草芽孢桿菌菌粉。試驗(yàn)期40 d?；A(chǔ)日糧參照NRC（2012）配制，基礎(chǔ)日糧原料組成及營養(yǎng)成分見表1。

1.4 飼養(yǎng)管理 豬舍使用前，清洗干凈并消毒。試驗(yàn)期間仔豬每天加料2 次（10:00 和16:00），自由采食、自由飲水。保證豬舍內(nèi)通風(fēng)、溫度、濕度等環(huán)境條件保持一致，其他飼養(yǎng)管理和免疫程序按豬場正常程序進(jìn)行。

1.5 測定指標(biāo)及方法

1.5.1 生長性能 試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)，以重復(fù)為單位稱重，試驗(yàn)期間每天以重復(fù)為單位記錄仔豬的采食量，計(jì)算平均日增重、平均日采食量和耗料增重比。

1.5.2 腸道組織形態(tài) 試驗(yàn)結(jié)束后（即第41 天），每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選擇1 頭豬（體重與該重復(fù)平均體重接近）進(jìn)行屠宰，結(jié)扎胃腸段后，于十二指腸和空腸的近端取2 cm左右腸段，浸于10%甲醛固定，用梯度乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯洗滌，石蠟包埋，分別在十二指腸和空腸腸段的3～6 個(gè)位點(diǎn)，連續(xù)切取3～6 個(gè)腸環(huán)橫斷面，制備6 μm厚石蠟切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腸黏膜組織結(jié)構(gòu)，并用圖像采集系統(tǒng)采集相應(yīng)組織圖像。采用MIAS 軟件測定十二指腸和空腸的絨毛高度、隱窩深度和黏膜厚度，每個(gè)樣品至少測定10 根絨毛對(duì)應(yīng)的絨毛高度、隱窩深度和黏膜厚度。

1.5.3 腸道菌群檢測 飼喂結(jié)束后（即第41 天），每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選擇1 頭體重與該重復(fù)平均體重接近的豬進(jìn)行屠宰，分別取十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸的內(nèi)容物并收集刮取十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸的黏膜物質(zhì)，每組采集的內(nèi)容物和黏膜樣品分別裝入離心管并置于-20℃冰箱冷凍保存，用于提取全基因組，采用高通量測序分析（委托北京新科開源基因科技有限公司完成）各腸道部分的菌群組成。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010 整理后，用SPSS 19.0 軟件的一般線性模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Duncan′s 法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，其中0.05＜P＜0.1 表示有變化趨勢，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

表1 基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

2 結(jié)果

2.1 菌株體外益生特性

2.1.1 耐酸和耐膽鹽的能力 由圖1 可知，枯草芽孢桿菌WEI-62 在人工胃液pH 2.0、pH 2.5 和pH 3.0 時(shí)的存活率分別為77.63%、86.49%和90.70%，在pH 3.0時(shí)存活率顯著高于pH 2.0 和pH 2.5 處理組。由圖2 可知，在不同濃度膽鹽條件下，各處理菌株的存活率無顯著差異，均在90%以上。由圖3 可知，在人工胃腸液處理下，胃液處理3 h，菌株存活率為77.04%，再用腸液處理3 h 后，存活率為76.54%，腸液處理前后差異不顯著。無論是在低pH 條件下還是在不同濃度膽鹽條件下，枯草芽孢桿菌WEI-62 都有較高的存活率。

2.1.2 體外抑菌活性 由表2 可見，枯草芽孢桿菌菌株具有抑制大腸桿菌CVCC1570 和產(chǎn)氣莢膜梭菌CICC22949的活性。

2.2 枯草芽孢桿菌對(duì)仔豬生長性能的影響 由表3 可知，與對(duì)照組相比，在日糧中添加枯草芽孢桿菌可降低仔豬的耗料增重比（P＜0.05）。添加枯草芽孢桿菌對(duì)仔豬的平均日增重、平均日采食量及死淘率均無顯著影響。

表2 枯草芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌CVCC1570 和產(chǎn)氣莢膜梭菌CICC22949 的抑菌活性

表3 枯草芽孢桿菌對(duì)仔豬生長性能的影響

2.3 日糧中添加枯草芽孢桿菌對(duì)仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 由表4 可知，日糧中添加枯草芽孢桿菌對(duì)仔豬十二指腸的絨毛高度、隱窩深度和黏膜厚度以及空腸的絨毛高度、隱窩深度和黏膜厚度均無顯著影響。

表4 飼喂枯草芽孢桿菌WEI-62 對(duì)仔豬的十二指腸和空腸組織形態(tài)的影響 μm

2.4 日糧中添加枯草芽孢桿菌對(duì)仔豬腸道菌群的影響如圖4 所示，各腸段黏膜和內(nèi)容物樣品的優(yōu)勢菌群有厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、軟壁菌門（Tenericutes）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobactiria）和放線菌門（Actinobacteria）。試驗(yàn)組的結(jié)腸黏膜和內(nèi)容物中厚壁菌門（Firmicutes）的相對(duì)豐度高于對(duì)照組，但空腸黏膜、盲腸黏膜和十二指腸內(nèi)容物的厚壁菌門（Firmicutes）的相對(duì)豐度低于對(duì)照組。試驗(yàn)組十二指腸黏膜和回腸黏膜的變形菌門（Proteobacteria）的相對(duì)豐度低于對(duì)照組，但十二指腸內(nèi)容物、空腸內(nèi)容物和回腸內(nèi)容物的變形菌門（Proteobacteria）的相對(duì)豐度高于對(duì)照組。試驗(yàn)組空腸黏膜、結(jié)腸內(nèi)容物的擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對(duì)豐度低于對(duì)照組，但十二指腸黏膜、盲腸黏膜和盲腸內(nèi)容物的擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對(duì)豐度高于對(duì)照組。試驗(yàn)組和對(duì)照組的空腸黏膜和回腸黏膜的軟壁菌門（Tenericutes）的相對(duì)豐度高于其他腸段樣品，而且試驗(yàn)組的相對(duì)豐度高于對(duì)照組；十二指腸內(nèi)容物和空腸內(nèi)容物的藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobactiria）的相對(duì)豐度高于其他腸段。因此，從門水平的結(jié)果表明，飼喂菌株WEI-62沒有明顯改善仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)。

如圖5 所示，除了空腸黏膜和回腸黏膜外，其余腸段樣品中，試驗(yàn)組的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的相對(duì)豐度均高于對(duì)照組，尤其是回腸內(nèi)容物的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）幾乎是絕對(duì)的優(yōu)勢菌屬。由于本批樣品中未檢測到志賀-埃希氏菌屬（Escherichia-Shigella），所以將梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）作為致病菌的代表菌屬進(jìn)行分析，試驗(yàn)組回腸、盲腸和結(jié)腸的內(nèi)容物的梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）的相對(duì)豐度低于對(duì)照組，其余腸段樣品中，試驗(yàn)組和對(duì)照組的梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）的相對(duì)豐度相差不大。因此，從屬水平的結(jié)果表明，飼喂菌株WEI-62 可以改善仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)。

由圖4 和圖5 可知，雖然飼喂菌株WEI-62 后，仔豬腸道菌群中的厚壁菌門的相對(duì)豐度沒有得到明顯改善，但乳酸桿菌屬的相對(duì)豐度明顯高于對(duì)照組，梭菌屬的相對(duì)豐度低于對(duì)照組。因此，菌株WEI-62 針對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)是有效的。

3 討 論

3.1 枯草芽孢桿菌的生物學(xué)特性 枯草芽孢桿菌已被廣泛認(rèn)為可以促進(jìn)人和動(dòng)物的健康。在體內(nèi)研究中，攝入的微生物需通過低pH 的酸性胃環(huán)境，還需要暴露在小腸高濃度的膽鹽中[10]。因而，益生菌對(duì)胃腸道的耐受性是體外評(píng)價(jià)益生菌的關(guān)鍵指標(biāo)之一。本研究結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌對(duì)低pH 的酸性環(huán)境和高濃度的膽鹽具有較高的耐受性。這可能與枯草芽孢桿菌在抵御極端環(huán)境時(shí)會(huì)形成孢子有關(guān)。La Ragione 等[11]研究表明，枯草芽孢桿菌可以在胃腸道中完成從孢子萌發(fā)形成營養(yǎng)體到再生孢的整個(gè)生命周期；事實(shí)上，正是由于其對(duì)胃腸道的耐受性，才使得在口服的情況下仍能抑制胃腸道中的大腸桿菌等致病菌。此外，抑菌活性也是體外菌株有效性評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)。不同的枯草芽孢桿菌對(duì)于病原菌的抑菌活性不同。大多數(shù)枯草芽孢桿菌都具有高效的抑菌活性，這表明其在腸道中具有抑制病原菌的潛力。家禽體內(nèi)的研究表明枯草芽孢桿菌 NIU068 和枯草芽孢桿菌 PY79（hr）具有抑制大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的作用[12-13]。本研究檢測出枯草芽孢桿菌對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌CICC22949 和大腸桿菌CVCC1570 都具有抑菌活性，表明其可能在體內(nèi)具有抑制該病原菌的潛力。目前體外的篩選結(jié)果和動(dòng)物體內(nèi)的試驗(yàn)結(jié)果之間的相關(guān)性仍不清楚。

3.2 枯草芽孢桿菌對(duì)仔豬生長性能的影響 本研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加1×106CFU/g 枯草芽孢桿菌菌粉WEI-62后顯著降低了仔豬的耗料增重比，提高了仔豬的日增重和日采食量，但無顯著差異。黃雪泉[14]研究發(fā)現(xiàn)，與金霉素對(duì)照組相比，1×106、2×106、2×107CFU/g 枯草芽孢桿菌組均未顯著提高仔豬的平均日增重和降低耗料增重比?？莶菅挎邨U菌進(jìn)入仔豬體內(nèi)時(shí)可以耐受動(dòng)物機(jī)體的酸性環(huán)境、膽鹽和消化液等，從而到達(dá)腸道?？莶菅挎邨U菌在豬的胃腸道近端迅速萌發(fā)[15]，消耗腸道中的氧氣，與致病菌競爭氧氣及其他營養(yǎng)成分，促進(jìn)腸道菌群平衡；而且還能產(chǎn)生和分泌蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶來促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[16]。這可能是本研究中添加枯草芽孢桿菌可以顯著降低耗料增重比的原因之一。

3.3 枯草芽孢桿菌對(duì)仔豬腸道形態(tài)的影響 腸道健康對(duì)斷奶仔豬的整體代謝、生理、疾病防御和生長發(fā)育至關(guān)重要。腸道健康包括對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收能力、排泄代謝廢物、腸道屏障、穩(wěn)定的微生物群落、腸道免疫系統(tǒng)以及沒有腸道疾病[17]。腸道絨毛高度、隱窩深度和黏膜厚度反映小腸的消化吸收能力。腸道絨毛高度增加使腸內(nèi)總表面積增大，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收[18]；隱窩深度反映腸上皮細(xì)胞的更新速度，隱窩變淺說明上皮細(xì)胞生成率高，更新快[19]；而黏膜的厚薄與營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過程有關(guān)，進(jìn)而影響小腸的吸收功能。絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度比越高，說明小腸消化吸收好。本研究中，枯草芽孢桿菌組仔豬的絨毛高度和黏膜厚度都高于對(duì)照組，隱窩深度低于對(duì)照組，說明枯草芽孢桿菌可促進(jìn)仔豬的消化與吸收，但組間無顯著差異。鄧軍等[20]研究發(fā)現(xiàn)，添加枯草芽孢桿菌可以顯著增加仔豬的十二指腸絨毛長度，對(duì)空腸無顯著影響；顯著降低空腸的隱窩深度，對(duì)十二指腸無影響。李?；ǖ萚21]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧添加枯草芽孢桿菌可顯著提高仔豬的空腸絨毛高度，對(duì)十二指腸無顯著影響，對(duì)十二指腸和隱窩深度均無顯著降低作用。造成結(jié)果差異的原因可能與動(dòng)物個(gè)體差異和菌株差異性有關(guān)。

3.4 枯草芽孢桿菌對(duì)仔豬腸道菌群的影響 腸道菌群平衡與動(dòng)物生長、發(fā)育和健康有著密切的聯(lián)系。腸道菌群具有多種生理功能，包括免疫調(diào)節(jié)、營養(yǎng)與代謝和保護(hù)功能[22]。研究報(bào)道飼喂益生菌可影響腸道菌群的多樣性、組成和相對(duì)豐度。Tang 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加枯草芽孢桿菌可以提高斷奶仔豬結(jié)腸中芽孢桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量。Poulsen 等[24]研究表明，芽孢桿菌可提高仔豬腸道菌群組成的多樣性和結(jié)腸菌群的豐度。本研究中，飼料中添加枯草芽孢桿菌能夠提高乳酸桿菌屬的相對(duì)豐度和降低梭菌屬的相對(duì)豐度，表明添加枯草芽孢桿菌可調(diào)節(jié)仔豬的腸道菌群?？莶菅挎邨U菌進(jìn)入豬腸道后萌發(fā)可通過競爭黏附位點(diǎn)和營養(yǎng)素來競爭排斥致病菌，可通過免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)腸道屏障來促進(jìn)腸道健康[15,25]。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌對(duì)于人工胃腸液具有高度耐受性以及具有抑制大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌特性，日糧中添加枯草芽孢桿菌可通過調(diào)節(jié)腸道菌群來促進(jìn)仔豬腸道健康和降低耗料增重比。