吳 乾 ，王艷芳 ，蔚沐庭 ，趙惠英 ，楊廷楨 ，王 騫 ，張小軍 ，高 燕 ，郝燕燕

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹(shù)研究所，山西太谷030800）

蘋(píng)果（Malus domestica Mill）.是薔薇科（Rosaceae）蘋(píng)果屬（Malus）植物，屬于落葉喬木，在我國(guó)已經(jīng)有2 000 多年的栽培歷史[1]。蘋(píng)果酸甜清香，不僅含有蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、有機(jī)酸、維生素和微量元素等，還含有多酚、類(lèi)黃酮等功能性物質(zhì)。其中，酚酸、黃酮類(lèi)物質(zhì)及花青素等是蘋(píng)果中主要的酚類(lèi)物質(zhì)[2]。對(duì)藍(lán)靛果[3]、獼猴桃[4]、杏[5]、藍(lán)莓[6]的研究表明，酚類(lèi)物質(zhì)具有強(qiáng)的抗氧化功能，有益人類(lèi)健康[7]。

“醫(yī)食同源”是目前果業(yè)的發(fā)展方向，“吃營(yíng)養(yǎng)，吃健康”已經(jīng)成為人們的共識(shí)[8]。紅肉蘋(píng)果（Malus pumila Mill.）是新疆野蘋(píng)果的一個(gè)變種，原產(chǎn)我國(guó)新疆伊犁地區(qū)以及中亞的哈薩克斯坦等地[9]，具有酚類(lèi)物質(zhì)含量高的特點(diǎn)。因此，有效利用新疆野蘋(píng)果等種質(zhì)資源，開(kāi)展遠(yuǎn)緣雜交育種，進(jìn)一步培育高類(lèi)黃酮（紅肉與紅皮）蘋(píng)果，對(duì)于推動(dòng)我國(guó)蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質(zhì)高效發(fā)展及“健康中國(guó)”均具有重要意義[10]。

本研究以紅肉蘋(píng)果紅滿(mǎn)堂、紅色之愛(ài)（Red Love）成熟果實(shí)為試材，以紅富士為對(duì)照，測(cè)定3 個(gè)品種的總酚、總黃酮、總花青素含量以及抗氧化性，并對(duì)酚類(lèi)物質(zhì)含量與抗氧化性進(jìn)行相關(guān)性分析，旨在篩選出高類(lèi)黃酮、高抗氧化品種。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用蘋(píng)果品種（圖1）為紅肉品種紅滿(mǎn)堂、紅色之愛(ài)（Red Love），以白肉品種紅富士為對(duì)照，均采摘成熟期果實(shí)。

1.2 試驗(yàn)方法

每個(gè)蘋(píng)果品種選取5 株長(zhǎng)勢(shì)基本一致、生長(zhǎng)發(fā)育良好的樹(shù)，在樹(shù)冠外圍隨機(jī)采取果實(shí)20 個(gè)。單株小區(qū)，5 次重復(fù)。果實(shí)通過(guò)清洗、擦干，取薄厚一致的果皮（約1.0 mm）及去核果肉，用液氮速凍后冷凍研磨儀粉碎成細(xì)粉，稱(chēng)質(zhì)量分裝，存放于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1 酚類(lèi)物質(zhì)的提取 參照汪曉謙[11]的方法提取。以70%甲醇內(nèi)含2%甲酸的混合溶液為提取液。提取時(shí)，稱(chēng)取果皮或果肉0.1 g，在0 ℃下加1 mL 提取液研磨之后再加1 mL 提取液沖洗研缽，將2 次加入的提取液并入離心管。將離心管于25 ℃、1 000 r/min 條件下振蕩30 min，之后在 10 000 g 下離心10 min，取上清液待用。

1.2.2 總酚含量的測(cè)定 總酚含量的測(cè)定采用Folin-Ciocalteu 法[12]。在離心管中依次加入 20 μL 果實(shí)提取液、1.58 mL 蒸餾水、0.1 mL Folin-Ciocalteu試劑（1∶1 稀釋?zhuān)?，搖勻，充分反應(yīng) 1 min 后加入飽和Na2CO3溶液1.5 mL，避光反應(yīng)2 h。以提取溶劑為對(duì)照，用分光光度計(jì)在765 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，結(jié)果以沒(méi)食子酸當(dāng)量（GAE）表示，單位為mg/g。

1.2.3 總黃酮含量的測(cè)定 總黃酮含量的測(cè)定采用亞硝酸鈉- 硝酸鋁法[13]。在離心管中依次加入0.5 mL 果實(shí)提取液、0.15 mL 5%NaNO2溶液，靜置6 min 后加入0.15 mL10%A（lNO）33溶液，靜置6 min后加入2 mL 4%NaOH 溶液，最后加入2.2 mL 蒸餾水，振蕩混勻靜置3 min 后于508 nm 下測(cè)定吸光度，結(jié)果以蘆丁當(dāng)量（RE）表示，單位為mg/g。

1.2.4 總花青素含量的測(cè)定 總花青素含量的測(cè)定采用pH 示差法。取果實(shí)提取液2 mL 至10 mL試管中，分別用 pH＝1.0（0.2 mol/L KCl∶0.2 mol/L HCl＝25∶67，V/V）、pH＝4.5（醋酸 - 醋酸鈉緩沖液：取18 g 醋酸鈉，加冰醋酸9.8 mL，再加水稀釋至1 000 mL）的緩沖液定容，反應(yīng)30 min，用紫外分光光度計(jì)在510、700 nm 處測(cè)定吸光度，以矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷表示，利用公式進(jìn)行花青素含量測(cè)定，單位為mg/kg。

式中，A 為待測(cè)液花青素總吸光度；ΔApH1為pH值為1 條件下的吸光度差值；ΔApH4.5為pH 值為4.5條件下的吸光度差值；A510為待測(cè)液花青素在510 nm處的吸光度；A700為待測(cè)液花青素在700 nm 處的吸光度；c 為待測(cè)液花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)；V 為提取液總體積（mL）；DF 為稀釋倍數(shù)；M 為矢車(chē)菊 -3- 葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量（449.2 g/mol）；ε 為矢車(chē)菊 -3- 葡萄糖苷的消光系數(shù)（29 600 L（/mol·cm））；m 為樣品質(zhì)量（g）；L 為光程（1 cm）。

1.2.5 DPPH 法測(cè)定抗氧化性 DPPH 法測(cè)定抗氧化活性參照Z(yǔ)HANG 等[14]的方法。用無(wú)水乙醇溶解DPPH，使溶液的物質(zhì)的量濃度達(dá)到0.1 mmol/L，配制完成后置于包裹錫箔紙的燒瓶中，4 ℃暗保存。測(cè)定時(shí)取0.1 mL 待測(cè)樣品，加入4 mL 0.1 mmol/L DPPH 溶液，充分振蕩 30 s，暗反應(yīng) 30 min 之后，于517 nm 處測(cè)定吸光度。

繪制抗壞血酸的自由基清除率相對(duì)于其濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。DPPH 抗氧化活性單位為mg/100 g。

1.2.6 FRAP 法測(cè)定抗氧化性 FRAP 法測(cè)定抗氧化活性參照Z(yǔ)HANG 等[14]的方法。FRAP 儲(chǔ)備液由300 mmol/L 乙酸鈉緩沖液（3.1 g C2H3NaO2·3H2O＋16 mL C2H4O2，pH＝3.6）、10 mmol/L TPTZ 溶液（溶于40 mmol/L HCl） 以及 20 mmol/L FeCl3·6H2O 這 3 種溶液按照10∶1∶1 的體積比混合而成，現(xiàn)用現(xiàn)配。測(cè)定時(shí)，取20 μL 果實(shí)提取液加入1 mL 水與2 mL FRAP 儲(chǔ)備液，充分混合，于37 ℃反應(yīng)10 min 后，在593 nm 處測(cè)定吸光度。

繪制以水溶性維生素E（Trolox）為標(biāo)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。樣品的FRAP 抗氧化活性單位為mg/100 g。

1.2.7 ABTS 法測(cè)定抗氧化性 ABTS 法測(cè)定抗氧化活性參照AMIR 等[15]的方法，略有改動(dòng)。ABTS·+儲(chǔ)備液由5 mL7 mmol/LABTS 溶液和5 mL2.45 mmol/L K2S2O8溶液混合之后，于室溫暗反應(yīng)12 h 后制成。測(cè)定時(shí)用乙醇稀釋ABTS+·儲(chǔ)備液，于734 nm 處測(cè)得0.70±0.02 的吸光度。之后將50 μL 果實(shí)提取液與4 mL 乙醇稀釋后的ABTS+·儲(chǔ)備液混合，避光反應(yīng)6 min 后于734 nm 處測(cè)定吸光度。樣品的ABTS抗氧化性單位為mg/100 g。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Origin 2018 制圖，運(yùn)用SAS 8.1 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，運(yùn)用SPSS 21 軟件中Pearson 函數(shù)對(duì)總酚含量、總黃酮含量、總花青素含量與以DPPH法、FRAP 法、ABTS 法測(cè)定的抗氧化性之間的相關(guān)性進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅肉蘋(píng)果果實(shí)酚類(lèi)物質(zhì)含量分析

由圖2-A 可知，紅滿(mǎn)堂果皮總酚含量最高，為9 899.99 mg/kg，極顯著高于紅色之愛(ài)（8 474.12 mg/kg）和紅富士（7 563.81 mg/kg）；紅滿(mǎn)堂果肉總酚含量最高，為4 124.74 mg/kg，極顯著高于紅色之愛(ài)（3 614.01 mg/kg）和紅富士（2 627.64 mg/kg）。

從圖2-B 可以看出，紅滿(mǎn)堂果皮總黃酮含量最高，為39 459.77 mg/kg，極顯著高于紅色之愛(ài)（25 546.51 mg/kg）和紅富士（21 022.64 mg/kg）；紅滿(mǎn)堂果肉總黃酮含量最高，為15 455.34 mg/kg，極顯著高于紅色之愛(ài)（11 486.47 mg/kg）和紅富士（7 697.58 mg/kg）。

從圖2-C 可以看出，紅滿(mǎn)堂果皮總花青素含量最高，為499.68 mg/kg，極顯著高于紅色之愛(ài)（271.19 mg/kg）和紅富士（201.67 mg/kg）；紅滿(mǎn)堂果肉總花青素含量最高，為135.37 mg/kg，極顯著高于紅色之愛(ài)（58.88 mg/kg）和紅富士（35.98 mg/kg）。

3 個(gè)品種總酚、總黃酮、總花青素含量均表現(xiàn)為果皮顯著高于果肉。

2.2 紅肉蘋(píng)果果實(shí)抗氧化性分析

由圖3-A 可知，紅滿(mǎn)堂果皮DPPH 自由基清除能力最強(qiáng)（510.47 mg/100 g），極顯著高于紅色之愛(ài)（318.51 mg/100 g）和紅富士（170.59 mg/100 g）；紅滿(mǎn)堂果肉DPPH 自由基清除能力最強(qiáng)（439.04mg/100g），極顯著高于紅色之愛(ài)（248.37 mg/100 g）和紅富士（71.94 mg/100 g）。

由圖3-B 可知，紅滿(mǎn)堂果皮FRAP 抗氧化能力最強(qiáng)，為381.39 mg/100 g，極顯著高于紅色之愛(ài)（303.60 mg/100 g）和紅富士（108.80 mg/100 g）；紅滿(mǎn)堂果肉FRAP 抗氧化能力最強(qiáng)，為238.51 mg/100 g，極顯著高于紅色之愛(ài)（89.55 mg/100 g）和紅富士（52.65 mg/100 g）。

由圖3-C 可知，紅滿(mǎn)堂果皮ABTS+·自由基清除能力最強(qiáng)，為581.61 mg/100 g，極顯著高于紅色之愛(ài)（515.33 mg/100 g）和紅富士（214.12 mg/100 g）；紅滿(mǎn)堂果肉ABTS+·自由基清除能力最強(qiáng)，為365.29mg/100g，極顯著高于紅色之愛(ài)（244.51 mg/100 g）和紅富士（143.82 mg/100 g）。

3 個(gè)品種DPPH 自由基清除能力、FRAP 抗氧化能力、ABTS·+自由基清除能力都表現(xiàn)為果皮顯著高于果肉。

2.3 果實(shí)酚類(lèi)物質(zhì)含量與抗氧化性的相關(guān)性分析

對(duì)果實(shí)酚類(lèi)物質(zhì)（總酚、總黃酮、總花青素）含量與抗氧化性（DPPH 自由基清除能力、FRAP 抗氧化能力及ABTS+·自由基清除能力）進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖4 所示，果皮中總酚、總黃酮和總花青素含量都與DPPH 自由基清除能力呈極顯著正相關(guān)；果皮中總酚與FRAP 抗氧化能力呈顯著正相關(guān)，總黃酮、總花青素與FRAP 抗氧化能力不存在顯著相關(guān)性；果皮中總酚含量與ABTS+·自由基清除能力呈極顯著正相關(guān)，總黃酮、總花青素與ABTS+·自由基清除能力呈顯著正相關(guān)。

果肉中總酚、總黃酮、總花青素含量與3 個(gè)抗氧化指標(biāo)均呈極顯著正相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

HU 等[16]對(duì)蘋(píng)果果實(shí)酚類(lèi)物質(zhì)研究表明，蘋(píng)果屬植物在不同組織中，其含量具有顯著差異。HOLDERBAUM等[7]對(duì)蘋(píng)果酚類(lèi)物質(zhì)分布的研究發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)果果皮中總酚含量大于果肉中含量。本研究結(jié)果表明，紅肉蘋(píng)果紅滿(mǎn)堂果實(shí)中酚類(lèi)物質(zhì)含量極顯著高于紅色之愛(ài)和紅富士，且3 個(gè)品種果皮中酚類(lèi)物質(zhì)含量均顯著高于果肉中含量，這一結(jié)果與前人研究結(jié)論一致。

本試驗(yàn)對(duì)蘋(píng)果果實(shí)DPPH 自由基清除能力、FRAP 抗氧化（鐵離子還原）能力以及ABTS+·自由基清除能力進(jìn)行分析，結(jié)果表明，紅肉蘋(píng)果紅滿(mǎn)堂、紅色之愛(ài)果實(shí)的DPPH 自由基、ABTS+·自由基清除能力、FRAP 抗氧化能力極顯著高于紅富士，且紅滿(mǎn)堂極顯著高于紅色之愛(ài)。前人研究的結(jié)果表明，蘋(píng)果抗氧化性與蘋(píng)果酚類(lèi)物質(zhì)組成及含量密切相關(guān)，酚類(lèi)物質(zhì)越豐富，蘋(píng)果的抗氧化性越強(qiáng)[17]。本研究通過(guò)對(duì)果實(shí)酚類(lèi)物質(zhì)（總酚、總黃酮、總花青素）含量與抗氧化性（DPPH 自由基清除能力、FRAP 抗氧化能力及ABTS+·自由基清除能力）進(jìn)行相關(guān)性分析的結(jié)果也支持了此結(jié)果。紅滿(mǎn)堂果實(shí)高的酚類(lèi)物質(zhì)含量及其高的抗氧化性，說(shuō)明紅滿(mǎn)堂可作為加工型高酚類(lèi)品種進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用。紅滿(mǎn)堂是以舞美、山定子為親本雜交選育出的新型紅肉品種，其果實(shí)自幼果期直至成熟期均為紫紅色，果汁呈血紅色[18]，果肉不易褐變，可做天然藥妝品。本研究進(jìn)一步為紅滿(mǎn)堂的開(kāi)發(fā)利用提供了理論支撐。