劉 冉,曾慶華,*,王振宇,程 霜,穆洪靜,梁 榮
(1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山東聊城 252000; 2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150000; 3.山東省高唐藍(lán)山集團(tuán)總公司,山東聊城 252000)
大豆分離蛋白(Soybean protein isolate,SPI)以其優(yōu)良的加工性能、較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和較低的成本在食品行業(yè)得到廣泛的應(yīng)用[1-2]。SPI的主要成分是貯藏蛋白,分別為7S球蛋白(β-伴球蛋白)和11S球蛋白(大豆球蛋白),它們占總蛋白的65%~80%。SPI具有乳化性、溶解性、凝膠性、分散性和黏彈性等功能特性,使其在不同的食品中具有不同的應(yīng)用形式[3]。SPI功能特性主要取決于其蛋白組成、結(jié)構(gòu)、變性和聚集程度。蛋白凝膠特性可以將水分、脂肪、風(fēng)味以及色素物質(zhì)包裹在三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中,對(duì)于食品品質(zhì)和食品紋理的形成具有非常重要的作用。熱、酸、鹽、酶等方式均能誘導(dǎo)蛋白凝膠形成,但熱處理是食品加工中最常見、最基本的處理手段。SPI熱致凝膠形成是一個(gè)多步驟反應(yīng),首先需要加熱使多肽鏈展開暴露更多的作用位點(diǎn),然后展開的蛋白質(zhì)分子相互作用并發(fā)生聚集,最后聚集體凝聚形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[4]。SPI凝膠能力和黏彈性能很大程度上取決于自發(fā)的相互作用,如氫鍵和共價(jià)鍵(二硫鍵),靜電和疏水相互作用[5]。目前,商業(yè)化生產(chǎn)的SPI仍然采用堿提酸沉+噴霧干燥的方式進(jìn)行生產(chǎn),致使蛋白發(fā)生一定程度的變性,溶解性下降,導(dǎo)致了SPI的凝膠特性變差。因此,如何改善商用SPI的凝膠特性是SPI加工與應(yīng)用亟待解決的問題。
許多技術(shù)被用來修飾和改變大豆蛋白的結(jié)構(gòu)和聚集性,從而改善其功能特性。超聲波技術(shù)是一種常見的物理技術(shù),廣泛應(yīng)用于輔助成分提取領(lǐng)域[6-7]。其操作特點(diǎn)是簡(jiǎn)單、節(jié)能、省時(shí)和環(huán)保。高強(qiáng)度的超聲波技術(shù)是基于低頻振蕩產(chǎn)生的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)[8]。近年來,超聲波的研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到利用超聲波對(duì)各種生物大分子物質(zhì)進(jìn)行改性和降解。超聲通過破壞非共價(jià)相互作用,甚至可以斷裂肽鍵,引起結(jié)構(gòu)的變化,同時(shí)也會(huì)引起其功能特性的改變[9-10]。涂宗財(cái)?shù)妊芯勘砻?0 kHz 400 W超聲波處理使大豆分離蛋白平均粒徑減小,溶解性增加,表面疏水性增強(qiáng),二級(jí)結(jié)構(gòu)改變,可以促進(jìn)大豆分離蛋白形成結(jié)構(gòu)均勻、致密的TG改性凝膠[11]。Hu等研究發(fā)現(xiàn)20 kHz 400 W超聲處理促使鈣離子誘導(dǎo)的SPI形成結(jié)構(gòu)更加致密均一的三維凝膠結(jié)構(gòu),并提高其凝膠持水性和凝膠強(qiáng)度[12]。Zhang等研究表明,高強(qiáng)度超聲波可以打開SPI空間結(jié)構(gòu),暴露更多的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的作用位點(diǎn),從而使轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶誘導(dǎo)形成的凝膠強(qiáng)度更大[13]。
本研究目的在于將超聲波作為商用SPI改性的手段以提高其熱凝膠特性。研究采用不同功率的超聲波處理SPI分散液,首先測(cè)定超聲波對(duì)SPI分散液流變特性的影響,再通過動(dòng)態(tài)溫度、時(shí)間和頻率掃描,監(jiān)測(cè)SPI分散液熱凝膠形成的過程,分析超聲波對(duì)SPI凝膠形成和凝膠流變特性的影響。研究結(jié)果可為改善SPI凝膠特性和擴(kuò)大其應(yīng)用范圍提供理論依據(jù)。
SPI 高唐藍(lán)山基團(tuán)有限公司提供。
DHR-1型旋轉(zhuǎn)流變儀 美國(guó)TA公司;JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新藝超聲設(shè)備有限公司。
1.2.1 超聲波處理SPI分散液 參照胡昊[14]的方法,略作改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取5 g SPI在100 mL燒杯中,加入蒸餾水配制成12 g/100 mL SPI分散液,在室溫下磁力攪拌2 h至充分溶解,并放置于4 ℃冰箱中備用。用直徑為0.636 cm的超聲波探頭深入大豆蛋白溶液表面1~2 cm來處理SPI分散液。使用0 W超聲功率的SPI分散液作為對(duì)照組,其余樣品分別用超聲功率(100、200、400、600、800 W)處理,超聲總時(shí)間為10 min。單次超聲處理時(shí)間為5 s,間隔3 s。
1.2.2 流變特性的試驗(yàn) 將SPI分散液樣品放置在流變儀的平板上,平板間距設(shè)置為1.0 mm。用刮刀去除外板上多余的樣品,表面涂硅油,防止水分蒸發(fā)。樣品在測(cè)試前平衡5 min,以卸載試樣添加過程中的殘余應(yīng)力,并保持恒溫。
1.2.2.1 頻率掃描試驗(yàn) 參照胡昊[14]的方法,略作改動(dòng)。選擇直徑40 mm平板夾具,應(yīng)變?cè)O(shè)置為0.5%(處于線性黏彈區(qū)域內(nèi)),頻率設(shè)置為1 Hz,初始溫度設(shè)置為20 ℃,對(duì)SPI樣品進(jìn)行頻率掃描0.1~10 Hz,溫度設(shè)置為20 ℃。測(cè)G′、G″和tanδ隨頻率的變化。
1.2.2.2 剪切速率掃描試驗(yàn) 參照胡昊[14]的方法,略作改動(dòng)。選擇直徑40 mm,錐度1.998 °的錐板夾具進(jìn)行SPI樣品剪切速率掃描。剪切速率測(cè)定范圍0.1~100 s-1,測(cè)定過程中黏度和剪切應(yīng)力的變化。
1.2.2.3 凝膠形成模擬試驗(yàn) 參照Peyrano等[15]的方法,略作改動(dòng)。選擇直徑40 mm平板夾具,應(yīng)變?cè)O(shè)置為0.5%(處于線性黏彈區(qū)域內(nèi)),頻率設(shè)置為1 Hz,初始溫度設(shè)置為20 ℃,對(duì)SPI分散液進(jìn)行溫度掃描和時(shí)間掃描,以監(jiān)測(cè)凝膠形成全過程。凝膠形成試驗(yàn)分三個(gè)階段進(jìn)行:a.加熱階段:溫度以3 ℃/min速率從20 ℃上升至90 ℃;b.熱平衡階段:溫度為90 ℃保持20 min;(3)冷卻階段:溫度以3 ℃/min速率從90 ℃下降至20 ℃。測(cè)定G′、G″和tanδ隨溫度和時(shí)間的變化。測(cè)試結(jié)束后,立即對(duì)形成的凝膠進(jìn)行頻率掃描試驗(yàn),方法如1.2.2.1。
所有試驗(yàn)均重復(fù)3次,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。利用minitab 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。
2.1.1 超聲波處理對(duì)SPI分散液黏彈性的影響 G′為儲(chǔ)能模量(彈性模量),表示物質(zhì)阻止變形的能力,表征材料彈性特征。G″為損耗模量(黏性模量),表示物質(zhì)阻止流動(dòng)的能力,表征材料特征。G″/G′稱為損耗因子,用tanδ表示,表征材料是類似固體特征行為還是液體特征行為,如果tanδ等于0,材料突出固體彈性行為;tanδ等于1,材料突出液體黏性行為;當(dāng)tanδ介于0~1之間,表明材料既有黏性成分,又有彈性成分,材料表現(xiàn)出黏彈性[16-17]。因此G′、G″和tanδ用以表示物質(zhì)的黏彈性,反映材料結(jié)構(gòu)特性。如圖1~圖3所示,對(duì)照組SPI分散液的起始模量G′和G″較大,且G′大于G″,使分散液表現(xiàn)為類固體的特征。這是因?yàn)樯逃玫腟PI由于其加工工藝如堿提酸沉和噴霧干燥的原因,導(dǎo)致蛋白發(fā)生了很大程度的變性,將其分散到水中時(shí)形成了不溶性聚集體或沉淀物。這些大而穩(wěn)定的宏觀聚集物會(huì)被劇烈的機(jī)械或均質(zhì)作用破壞形成小的聚集體[18]。超聲波由于空穴和剪切作用可以破壞并打散不溶性的聚集體,并將部分不溶性聚集體轉(zhuǎn)變成可溶性的聚集體。因此超聲波可以引起模量(G′和G″)減小和tanδ增大,改變了原有SPI分散液的黏彈結(jié)構(gòu),從而使其更接近于液體狀態(tài)。胡昊在研究高場(chǎng)強(qiáng)超聲波對(duì)商用SPI結(jié)構(gòu)和功能特性影響時(shí)也有相似的結(jié)果,超聲處理會(huì)降低SPI分子或聚合物之間的相互作用,使SPI分散液接近類液體狀態(tài)[19]。
圖1 超聲波處理對(duì)SPI分散液G′的影響Fig.1 Effects of ultrasonic treatment on G′ of SPI dispersions
圖2 超聲波處理對(duì)SPI分散液G″的影響Fig.2 Effects of ultrasonic treatment on G″ of SPI dispersions
圖3 超聲波處理對(duì)SPI分散液tanδ的影響Fig.3 Effects of ultrasonic treatmenton tanδ of SPI dispersions
2.1.2 超聲波對(duì)SPI分散液黏度的影響 SPI分散液的黏度與剪切速率的關(guān)系如圖4所示。隨著剪切速率的增加,SPI凝膠的黏度均逐漸下降,表現(xiàn)出典型剪切變稀的非牛頓流體特征。田少君等研究指出,大豆蛋白溶液在低濃度下(<6%)表現(xiàn)為牛頓流體,在高濃度(>6%)下表現(xiàn)為非牛頓流體[20]。這是由于高濃度的蛋白顆粒隨流動(dòng)方向逐漸定向,摩擦阻力減小;SPI顆粒也隨流動(dòng)方向發(fā)生相應(yīng)的形變;流動(dòng)過程產(chǎn)生的剪切力會(huì)引起非共價(jià)鍵的斷裂,從而引起聚集體的解體[15]。與對(duì)照組相比,在相同剪切速率下,超聲波處理引起了SPI分散液表觀黏度的減小。這主要是超聲波減小了SPI顆粒的粒徑引起的。與超聲波對(duì)SPI分散液G′和G″的影響一致,表觀黏度并未隨超聲功率的增加而逐漸減小。與其他功率相比,400和600 W表觀黏度相對(duì)較大,可能由于400、600 W超聲處理可以引起SPI顆粒的重聚集,造成粒徑的增大,從而影響了黏度。
圖4 SPI分散液黏度隨剪切速率的變化曲線Fig.4 Curves of viscosity of SPI gel with shear rate
圖5 SPI分散液的熱凝膠曲線Fig.5 Thermal gelation curves of SPI注:對(duì)照組(A);100 W超聲處理組(B);200 W超聲處理組(C);400 W超聲處理組(D);600 W超聲處理組(E);800 W超聲處理組(F)。
2.2.1 超聲波對(duì)SPI熱致凝膠形成過程的影響 SPI熱致凝膠形成過程分為3步,第一步大豆蛋白變性去折疊;第二步變性的大豆蛋白聚集;第三步,大豆蛋白聚集體交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。因此SPI凝膠能力和黏彈性能很大程度都依賴于自發(fā)的相互作用,如氫鍵和共價(jià)鍵,靜電相互作用和疏水相互作用[21]。本研究采用小振幅振蕩掃描模擬SPI凝膠形成過程。圖5顯示SPI分散液的熱致凝膠形成曲線隨時(shí)間的變化,在加熱-平衡-冷卻的熱循環(huán)過程中,SPI樣品的G′和G″隨時(shí)間的變化趨勢(shì)基本一致,表現(xiàn)出先下降后升高的趨勢(shì)。加熱起始階段,SPI分散液受到外部應(yīng)力的作用,黏彈結(jié)構(gòu)遭到破壞,蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-水之間的氫鍵也隨溫度升高發(fā)生斷裂,因此G′和G″隨溫度的升高而下降[22]。當(dāng)溫度達(dá)到SPI變性溫度以后,SPI的高級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞,分子去折疊,內(nèi)部疏水基團(tuán)、巰基和二硫鍵逐漸暴露,分子結(jié)構(gòu)變伸展,蛋白分子發(fā)生聚集,G′和G″開始增大。若G′增加速度大于G″,則出現(xiàn)G′和G″的交點(diǎn),即凝膠點(diǎn)(PCO)出現(xiàn),標(biāo)志三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)開始建立[23]。隨后,蛋白分子繼續(xù)發(fā)生聚集并發(fā)生交聯(lián),模量不斷增加,網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不斷加強(qiáng),當(dāng)tanδ達(dá)到0.3(Pt0.3)時(shí),預(yù)示凝膠已經(jīng)形成了良好的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[24]。
表1 熱凝膠化的相關(guān)參數(shù)Table 1 Thermal gelation parameters
未經(jīng)超聲處理的SPI對(duì)照組的凝膠曲線如圖5A顯示,熱處理階段G′和G″一直不斷減小,直到冷卻階段才開始增大,在冷卻溫度降至87.83±3.65 ℃時(shí)PCO出現(xiàn),此時(shí)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)才剛剛開始建立。在冷卻結(jié)束時(shí),G′僅為17.80±1.38 Pa,凝膠強(qiáng)度較弱,tanδ為0.49±0.03未達(dá)到0.3,未能形成良好的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(表1)。商用SPI由于溶解性差,分散液中有部分不溶性聚集體存在,凝膠形成過程中疏水相互作用并未發(fā)揮優(yōu)勢(shì),主要由氫鍵參與了網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建,導(dǎo)致其熱誘導(dǎo)形成的凝膠強(qiáng)度低,網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)差。因此商用SPI的凝膠性能比較差。100 W超聲處理組在整個(gè)熱循環(huán)過程中,G″基本上一直處于大于G′的狀態(tài),凝膠未形成(圖5B)。100 W超聲處理明顯降低了SPI凝膠能力,這可能是由于100 W超聲處理后的SPI顆粒粒徑減小程度較大,導(dǎo)致蛋白顆粒之間空隙增加以及與水分子作用力增強(qiáng),從而減弱了凝膠形成時(shí)所需的蛋白與蛋白之間的相互作用力,因此在熱循環(huán)過程未能實(shí)現(xiàn)蛋白顆粒的聚集和交聯(lián)。200、400和600 W超聲處理組具有相似凝膠形成曲線,且與對(duì)照組相比發(fā)生了很大的變化(圖5C、D、E)。一方面,超聲波促使凝膠點(diǎn)提前出現(xiàn),加速了凝膠形成。200和600 W超聲組其PCO在熱平衡階段的初期就已經(jīng)出現(xiàn);特別是400 W超聲組SPI在進(jìn)行熱循環(huán)之前就已經(jīng)形成了微弱的凝膠結(jié)構(gòu),且在整個(gè)熱循環(huán)過程中G′始終大于G″。一般認(rèn)為,SPI凝膠形成依靠各種相互作用力的共同作用的結(jié)果,但疏水相互作用和氫鍵起到了決定性的作用[25-26]。PCO過后,模量隨高溫處理時(shí)間延長(zhǎng)快速增大,蛋白質(zhì)在高溫下暴露足夠長(zhǎng)的時(shí)間建立熱促進(jìn)相互作用,從而產(chǎn)生了大量的疏水相互作用,這對(duì)于凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的建立起到關(guān)鍵作用[27]。另一方面,超聲波促使SPI凝膠建立更加穩(wěn)定的矩陣結(jié)構(gòu)。200~600 W超聲處理組均能在冷卻階段或熱平衡階段達(dá)到Pt0.3,而未超聲處理的SPI卻始終未能達(dá)到Pt0.3。說明,超聲波處理后SPI聚集體可以發(fā)生更加有序地交聯(lián),形成良好的矩陣結(jié)構(gòu)。從圖5C、D、E中可知,在冷卻階段模量增加的速度比熱平衡階段還要快,是由于氫鍵作用的加強(qiáng),幫助SPI凝膠建立更加穩(wěn)定網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),因此在冷卻階段結(jié)束時(shí),與對(duì)照組相比具有更大的G′和G″,同時(shí)具有更小tanδ,即200~600 W超聲波促進(jìn)SPI形成強(qiáng)度高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的凝膠。800 W超聲處理組的凝膠曲線如圖5F顯示,在加熱階段和熱平衡階段G′小于G″,一直處于溶液狀態(tài),直到冷卻溫度降至77.13±4.04 ℃時(shí)才達(dá)到PCO,冷卻結(jié)束時(shí)G′為5.24±0.63 Pa,tanδ為0.52±0.03,凝膠性能與對(duì)照組相比有所下降。800 W超聲處理降低了SPI的膠凝能力。這有可能是因?yàn)楦吖β实某暡▽?dǎo)致肽鍵的斷裂,造成SPI的降解,影響了蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián),從而導(dǎo)致其凝膠能力的下降。
2.2.2 超聲波對(duì)SPI熱致凝膠黏彈性的影響 在頻率掃描過程中,樣品粒子之間化學(xué)鍵可以自發(fā)生成,也可以在外力作用下發(fā)生斷裂?;瘜W(xué)鍵的生成或斷裂導(dǎo)致物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而影響流變性能[28]。SPI熱致凝膠G′、G″與頻率之間的關(guān)系如圖6、圖7所示。在0.1~10 Hz內(nèi),G′和G″隨頻率的增加而增加,對(duì)頻率具有一定的依賴性。超聲處理組與對(duì)照組的黏彈性顯示出明顯的差別。其中,200、400和600 W超聲處理組G′和G″都明顯高于對(duì)照組,顯示出較好的黏彈性,且400 W具有最大的G′和G″。tanδ可以反映凝膠的網(wǎng)絡(luò)性質(zhì),tanδ越小表示凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越好,當(dāng)tanδ等于0.3時(shí),預(yù)示凝膠建立了良好的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。由圖8可知,400 W超聲處理組的SPI熱致凝膠的tanδ最小,且小于0.3,表明此條件下形成的凝膠結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定。SPI熱致凝膠的頻率掃描試驗(yàn)結(jié)果表明,適當(dāng)功率的超聲預(yù)處理可以提高SPI熱致凝膠的黏彈性能,并能促進(jìn)凝膠形成更加穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。相反,低功率組的SPI分散液未能形成凝膠(G′
圖6 超聲處理對(duì)SPI熱致凝膠G′的影響Fig.6 G′ of formed gels from ultrasonic-treatedSPI dispersions with frequency
圖7 超聲處理對(duì)SPI熱致凝膠G″的影響Fig.7 G″ of formed gels from ultrasonic-treatedSPI dispersions with frequency
圖8 超聲處理對(duì)SPI熱致凝膠tanδ的影響Fig.8 Tanδ of formed gels from ultrasonic-treatedSPI dispersions with frequency
利用頻率掃描可以把蛋白凝膠分成三種類型:聚合型凝膠(纏繞型網(wǎng)絡(luò))、化學(xué)型凝膠(共價(jià)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò))、物理型凝膠(非共價(jià)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò))[15]。聚合型凝膠是一類非常弱的凝膠,也被成為軟凝膠(soft gel),模量對(duì)頻率具有較高的依賴性,出現(xiàn)G′-G″交點(diǎn)[31]?;瘜W(xué)型蛋白凝膠屬于強(qiáng)凝膠,具有永久性共價(jià)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),模量不依賴頻率或依賴性非常小[32]。物理型蛋白凝膠介于弱凝膠與強(qiáng)凝膠之間,儲(chǔ)能模量對(duì)頻率具有一定的依賴性,但不出現(xiàn)G′-G″交點(diǎn)[15]。SPI熱致凝膠在頻率掃描過程中,G′和G″隨頻率增加而增加,且G′一直高于G″,對(duì)頻率具有較大的依賴性,SPI熱致凝膠主要通過非共價(jià)鍵(疏水相互作用和氫鍵)進(jìn)行交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),屬于物理型凝膠。雖然中功率超聲處理可以提高SPI熱致凝膠的黏彈性,降低tanδ,但tanδ始終大于0.1,仍屬于弱凝膠的范疇[33]。
超聲波可以改變SPI分散液的流變特性,降低G′、G″和表觀黏度,其黏彈結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使SPI分散液更接近于類液體的特性。400和600 W超聲處理可以引起部分蛋白顆粒的重聚集,從而使SPI分散液表現(xiàn)出微弱凝膠的狀態(tài)。超聲波對(duì)SPI熱致凝膠特性的影響結(jié)果表明,中功率超聲處理可以改變SPI黏彈結(jié)構(gòu),為凝膠形成提供更多的作用位點(diǎn),從而加速凝膠形成,提高其凝膠強(qiáng)度和凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。本研究說明一定強(qiáng)度的超聲處理可以改善蛋白質(zhì)的凝膠特性,但需要限制超聲強(qiáng)度,低功率和高功率的作用下,蛋白質(zhì)的凝膠特性可能會(huì)降低。超聲處理作為一種物理改性的手段,可以增強(qiáng)SPI的凝膠性能和改善膠凝能力。但如果僅僅依靠超聲波這一種手段,改善蛋白凝膠特性的效果是有限的,SPI凝膠仍未突破弱凝膠的范圍。為了進(jìn)一步提高超聲波處理的效果,未來的研究應(yīng)集中在利用超聲波技術(shù)與其他技術(shù)相結(jié)合的方式進(jìn)行改性SPI,以期待獲得更強(qiáng)改善其功能特性的效果。