宋振強(qiáng) 王靖宇 周賽君 于珮

天津醫(yī)科大學(xué)朱憲彝紀(jì)念醫(yī)院，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)激素與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 300070

2型糖尿病已成為全球流行性疾病。據(jù)2013年我國(guó)慢性病及其危險(xiǎn)因素監(jiān)測(cè)顯示，18歲及以上人群糖尿病患病率已高達(dá)10.4%[1]。而隨著糖尿病患病率的急劇增加，糖尿病腎臟病(DKD)已成為慢性腎臟病(CKD)和終末期腎病(ESRD)的主要原因[2-3]。其發(fā)病機(jī)制與遺傳因素、糖代謝紊亂、血流動(dòng)力學(xué)改變、持續(xù)低水平炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激等相關(guān)。近年來，巨噬細(xì)胞在DKD發(fā)病中的作用及機(jī)制逐漸引起人們的注意。在糖尿病發(fā)展過程中，代謝、內(nèi)分泌和血流動(dòng)力學(xué)紊亂可以促進(jìn)慢性炎性反應(yīng)狀態(tài)的發(fā)生、發(fā)展，在腎組織中則表現(xiàn)為大量巨噬細(xì)胞聚集，且與腎臟損傷和腎功能減退的進(jìn)展相關(guān)，但具體機(jī)制尚不明確。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是主要的巨噬細(xì)胞趨化因子之一，它主要在腎小球足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生，是血管生成的主要調(diào)節(jié)因子；也可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達(dá)，促進(jìn)單核細(xì)胞趨化和黏附分子的表達(dá)增加。β2糖蛋白Ⅰ(β2-GP)也稱載脂蛋白H(ApoH)，是一種相對(duì)分子質(zhì)量為50 000的單鏈血漿糖蛋白，在很多自身免疫性疾病患者的血清中都有發(fā)現(xiàn)，肝膽管和近端腎小管上皮細(xì)胞是合成β2-GP的主要場(chǎng)所。在腎小管功能損害早期，尿中β2-GP排泄增加。研究發(fā)現(xiàn)，用免疫組化的方法可以檢測(cè)到β2-GP與凋亡的巨噬細(xì)胞共定位于人冠狀動(dòng)脈。VEGF通過激活單核細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1(VEGFR1)，進(jìn)而促進(jìn)其下游p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化而誘導(dǎo)單核細(xì)胞遷移，β2-GP可以抑制上述過程。

因此，本研究欲通過體外實(shí)驗(yàn)觀察VEGF對(duì)巨噬細(xì)胞的趨化作用，以及β2-GP對(duì)VEGF誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移的影響，并初步探討其影響是否與p38信號(hào)通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 小鼠單核/巨噬細(xì)胞系RAW 264.7(天津醫(yī)科大學(xué)免疫教研室饋贈(zèng))，10%胎牛血清(北京索萊寶科技有限公司)，β2-GP(實(shí)驗(yàn)室制備)，重組小鼠VEGF(Peprotech 公司)，SB203580(碧云天生物技術(shù)研究所)，MCP-1、IL-8及巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1β(MIP-1β) ELISA試劑盒(美國(guó)R&B公司)，小鼠β-actin單克隆抗體、兔抗小鼠p38MAPK多克隆抗體及兔抗小鼠磷酸化p38MAPK多克隆抗體(Cell Signaling Technology)，兔抗小鼠VEGFR1多克隆抗體(Thermo Scientific公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(北京康為世紀(jì)生物有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 以小鼠單核/巨噬細(xì)胞系RAW 264.7為研究對(duì)象，細(xì)胞置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每日更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約90%融合時(shí)即傳代，選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、細(xì)胞形態(tài)飽滿、狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按表1進(jìn)行分組。

1.3 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將Transwell培養(yǎng)板下室加入600 μl培養(yǎng)液，上室加入100 μl培養(yǎng)液后

表1 細(xì)胞分組情況

放于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)孵育2 h。接種細(xì)胞，棄去上室培養(yǎng)液，加入100 μl細(xì)胞密度為105/ml的細(xì)胞懸液，下室換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液。放于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。2 h后細(xì)胞貼壁，根據(jù)表2加入干預(yù)因素(上室體系100 μl，下室體系600 μl)，同一組別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育6 h。取出Transwell培養(yǎng)板，棄去上下室培養(yǎng)液，下室加入600 μl 10%中性福爾馬林溶液，上室加入100 μl 10%中性福爾馬林溶液，固定10～15 min。棄去上下室固定液，下室加入600 μl臺(tái)盼藍(lán)染液，上室加入100 μl臺(tái)盼藍(lán)染液，染色5～10 min。染色后用PBS緩沖液稍洗，用棉簽輕輕擦去上室上表面細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察，每孔計(jì)數(shù)6個(gè)高倍視野細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值(即遷移至小室下表面的細(xì)胞數(shù))。

表2 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

1.4 MCP-1、白細(xì)胞介素-8(IL)-8及MIP-1β的表達(dá) 將密度為1×105/ml的細(xì)胞懸液接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(2 ml/孔)，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。經(jīng)無血清饑餓培養(yǎng)過夜后，按表1加入干預(yù)因素。細(xì)胞置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h后從培養(yǎng)箱內(nèi)取出，小心吸取上清于無菌管中，離心20 min(2 000～3 000 r/min)，仔細(xì)收集上清，ELISA法檢測(cè)上清液中MCP-1、IL-8及MIP-1β的濃度，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.5 VEGF信號(hào)通路變化 將密度為1×105/ml的細(xì)胞懸液接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(2 ml/孔)，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。經(jīng)無血清饑餓培養(yǎng)過夜后，按表1加入干預(yù)因素。培養(yǎng)6 h之后，棄去培養(yǎng)液，收集細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白。Western印跡檢測(cè)VEGFR1、p38MAPK及磷酸化p38 MAPK表達(dá)。BCA法測(cè)定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗、二抗孵育，曝光顯影，凝膠成像儀記錄目的蛋白灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(圖1，封3)

2.1.1 VEGF對(duì)巨噬細(xì)胞具有趨化作用 與A組相比，B組巨噬細(xì)胞遷移的數(shù)量增加(t=22.089，P<0.05)。

2.1.2 p38抑制劑可抑制VEGF對(duì)巨噬細(xì)胞的趨化作用 與B組相比，D組巨噬細(xì)胞遷移明顯降低(t=63.625，P<0.05)。

2.1.3 β2-GP可以抑制VEGF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞遷移作用 與B組相比，C組巨噬細(xì)胞的遷移明顯減弱(t=22.687，P<0.05)。A組和E組巨噬細(xì)胞遷移的數(shù)目有差異(t=4.602，P<0.05)。

2.2 VEGF誘導(dǎo)MCP-1、IL-8及MIP-1β的分泌 與A組相比，B組巨噬細(xì)胞趨化因子MCP-1、IL-8及MIP-1β的分泌增加(t=3.339、11.140、 2.254,P均<0.05)，與B組相比，C組和D組抑制VEGF誘導(dǎo)的3種趨化因子的分泌減少(t=3.148、2.402、2.798、6.754、4.459、5.528，P均<0.05)，見圖2。

2.3 β2-GP對(duì)VEGFR1表達(dá)及p38MAPK信號(hào)通路的影響

2.3.1 β2-GP可抑制VEGF誘導(dǎo)的VEGFR1表達(dá) Western印跡結(jié)果顯示，與A組相比，B組巨噬細(xì)胞VEGFR1的表達(dá)增加(t=5.161，P<0.05)，與B組相比，C組巨噬細(xì)胞VEGFR1表達(dá)降低(t=4.965，P<0.05，圖3)。

2.3.2 β2-GP降低VEGF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞p38MAPK通路的激活程度 與A組相比，B組巨噬細(xì)胞p38MAPK通路的磷酸化程度增加(t=12.384，P<0.05)，與B組相比，C組磷酸化程度降低(t=6.581，P<0.05)，但高于A組(t=6.323，P<0.05)。

3 討論

近年來，隨著人們生活方式與飲食結(jié)構(gòu)的變化，糖尿病的患病率不斷上升，而由糖尿病所致的腎病也十分普遍，現(xiàn)已成為CKD和ESRD的重要誘發(fā)原因。然而，即使嚴(yán)格的控制糖脂代謝紊亂仍無法控制DKD的發(fā)生、發(fā)展，因此，研究DKD的發(fā)病機(jī)制以及尋找有效的預(yù)防和治療策略已迫在眉睫。

既往研究結(jié)果提示，DKD相關(guān)因素包括遺傳因素、高血糖、血液動(dòng)力學(xué)改變、血脂紊亂、氧化應(yīng)激等[4]。而近年來，持續(xù)低水平炎性反應(yīng)逐漸被人們認(rèn)識(shí)，尤其是巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)可能是DKD發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。巨噬細(xì)胞是腎小球高濾過所致腎損傷中的一個(gè)關(guān)鍵因子[5]。巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度與白蛋白尿水平、血肌酐水平、腎小球硬化程度和腎間質(zhì)纖維化程度相關(guān)[6]。用來氟米特等免疫抑制治療可明顯減輕DKD巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)程度，從而延緩了DKD的進(jìn)展[7]。巨噬細(xì)胞在受到炎性因子等刺激時(shí)會(huì)誘導(dǎo)合成誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，催化合成大量的一氧化氮，導(dǎo)致腎小球毛細(xì)血管高灌注、高濾過的狀態(tài)，參與腎臟損傷。糖尿病狀態(tài)下，巨噬細(xì)胞可以通過產(chǎn)生IL-1和血小板源性生長(zhǎng)因(PDGF)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，進(jìn)而促進(jìn)腎臟纖維化的發(fā)生[8]。

VEGF又稱為血管通透因子，是重要的促血管生成活性的生長(zhǎng)因子，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有促有絲分裂和抗凋亡作用，增加了血管的通透性，在調(diào)節(jié)正常和病理性血管生成過程中發(fā)揮了重要作用[9]。此外，VEGF也是主要的巨噬細(xì)胞趨化因子之一，它主要在腎小球足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生，是血管生成的主要調(diào)節(jié)因子；也可以誘導(dǎo)MCP-1的表達(dá)，促進(jìn)單核細(xì)胞趨化和黏附分子的表達(dá)。Zorena等[10]研究表明，血清VEGF水平升高是1型糖尿病微血管并發(fā)癥的獨(dú)立影響因素，并且VEGF水平與糖化血紅蛋白呈正相關(guān)。Pascal等[11]通過建立DKD的動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)腎小球VEGF-A水平升高，并且多項(xiàng)研究表明，在糖尿病動(dòng)物模型中抑制VEGF-A可以預(yù)防白蛋白尿和腎小球肥大。VEGF以自分泌作用于腎小球足細(xì)胞，通過VEGF/VEGFR1途徑介導(dǎo)足突的消失和腎小球基底膜增厚；以旁分泌作用于內(nèi)皮細(xì)胞，通過VEGF/VEGFR2途徑促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)而誘導(dǎo)新生血管的形成，亦可增加內(nèi)皮通透性；同時(shí)作為趨化因子招募巨噬細(xì)胞，通過VEGF/VEGFR1途徑促進(jìn)巨噬細(xì)胞腎小球及腎間質(zhì)的浸潤(rùn)[12]。

VEGFR1是在單核細(xì)胞上表達(dá)的唯一的VEGFR，VEGF誘導(dǎo)的單核細(xì)胞遷移是由VEGFR1(Flt-1)介導(dǎo)的。使用VEGF-A抑制劑sFlt-1轉(zhuǎn)染先前存在腎臟損害的1型糖尿病小鼠模型，發(fā)現(xiàn)sFlt-1可減少內(nèi)皮細(xì)胞激活，降低腎小球巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)[11]。單核-巨噬細(xì)胞遷移活性是由p38MAPK途徑介導(dǎo)的，VEGF可以激活單核細(xì)胞表達(dá)VEGFR1，進(jìn)而促進(jìn)其下游p38MAPK的磷酸化，該過程在VEGFR1介導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[13]。

在本實(shí)驗(yàn)中，通過Transwell遷移實(shí)驗(yàn)可以看到VEGF可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移(P<0.05)，發(fā)揮趨化因子的作用，并且VEGF可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌其他趨化因子，本實(shí)驗(yàn)中MCP-1、IL-8以及MIP-1β的分泌均增加(P均<0.05)。而用p38MAPK抑制劑SB203580可以明顯抑制巨噬細(xì)胞的遷移(P<0.05)以及3種趨化因子的分泌(P均<0.05)。Western印跡檢測(cè)顯示，VEGF可以明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)VEGFR1，以及p38MAPK通路的磷酸化(P均<0.05)，說明VEGF通過作用于巨噬細(xì)胞表面VEGFR1，進(jìn)而激活其下游p38MAPK通路的磷酸化而介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的遷移，與Tchaikovski等[13]的結(jié)果一致。

β2-GP也稱ApoH。肝膽管和近端腎小管上皮細(xì)胞是合成β2-GP的主要場(chǎng)所，在腸道、胎盤等部位也發(fā)現(xiàn)了β2-GP mRNA的表達(dá)。已證明β2GP對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化和視網(wǎng)膜新生血管形成具有積極作用[14]。此外，Chiu等[15]通過體內(nèi)和體外研究發(fā)現(xiàn)，β2-GP在人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAECs)中了抑制VEGF誘導(dǎo)的血管生成。這些結(jié)果表明β2-GP在新生血管和預(yù)防血管生成相關(guān)疾病中具有重要作用。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在2型糖尿病患者體內(nèi)，β2-GP表達(dá)水平顯著高于正常人，有并發(fā)癥的2型糖尿病患者β2-GP表達(dá)水平高于無并發(fā)癥患者。而降低β2-GP可改善DKD的結(jié)構(gòu)損害和腎功能，并對(duì)DKD起到腎臟保護(hù)和抗纖維化作用，這與抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1-p38MAPK途徑的激活密切相關(guān)[14]。

在Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和ELISA實(shí)驗(yàn)中觀察到，β2-GP對(duì)巨噬細(xì)胞遷移活性以及分泌功能無顯著影響，與A組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。用Western印跡檢測(cè)p38MAPK的磷酸化程度，發(fā)現(xiàn)β2-GP 對(duì)p38MAPK通路有輕度的激活作用(P<0.05)。在本實(shí)驗(yàn)中，Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示，β2-GP可以抑制VEGF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞遷移(P<0.05)。ELISA發(fā)現(xiàn)VEGF可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌趨化因子MCP-1、IL-8以及MIP-1β，而β2-GP可以抑制該作用(P均<0.05)。Western印跡檢測(cè)p38MAPK通路的激活以及VEGFR的變化，發(fā)現(xiàn)VEGF可以明顯增加巨噬細(xì)胞VEGFR1的表達(dá)以及p38通路的磷酸化，并且加入p38通路抑制劑后，并不影響巨噬細(xì)胞VEGFR1的表達(dá)(P均>0.05)，但Transwell實(shí)驗(yàn)在加入p38通路抑制劑之后細(xì)胞遷移明顯降低(P<0.05)，VEGF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞遷移是通過VEGF激活巨噬細(xì)胞表面的VEGFR1，進(jìn)而磷酸化其下游通路p38MAPK來實(shí)現(xiàn)的。加入β2-GP后發(fā)現(xiàn)，VEGFR1的表達(dá)量明顯降低，且p38通路磷酸化水平亦降低，但強(qiáng)于對(duì)照組，推測(cè)β2-GP抑制VEGF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞遷移的作用是通過抑制VEGFR1的表達(dá)，繼而部分抑制p38MAPK通路的激活來實(shí)現(xiàn)的。

VEGF可激活巨噬細(xì)胞表面的VEGFR1，促進(jìn)其下游通路p38MAPK磷酸化，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞趨化因子MCP-1、IL-8以及MIP-1β的分泌、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移；β2-GP通過抑制VEGFR1表達(dá)，并部分抑制上述過程。本研究正在進(jìn)行進(jìn)一步探討，該方向有望為DKD新的治療靶點(diǎn)提供參考。