趙磊，木沙江·托乎提，牛麗娟，茍漁，林富順，郭飛*

(1 石河子大學醫(yī)學院，新疆 石河子 832002；2 新疆大學生命科學與技術(shù)學院，新疆 烏魯木齊 830001)

數(shù)十年來，抗生素的出現(xiàn)以及不斷推陳出新，極大地降低了臨床感染率和死亡率[1]，抗生素的研發(fā)在科學研究中一直占據(jù)重要地位。天然抗生素主要分離自微生物的次級代謝產(chǎn)物中[2]。而放線菌恰恰是這些次級代謝產(chǎn)物最主要的生產(chǎn)者[3]。放線菌大體可以分為兩大類，占據(jù)大多數(shù)的鏈霉菌屬以及除此之外的稀有放線菌[4]。其中鏈霉菌是主要的抗生素生產(chǎn)者，據(jù)已有的報道表明，目前已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的抗生素種類已經(jīng)超過了20000種，但是其中真正服務(wù)于人類的抗生素不過百余種，而這其中的大多數(shù)都來源于放線菌中的鏈霉菌屬[5]。

從Waksman發(fā)現(xiàn)鏈霉菌中的鏈霉素[6]到后來萬古霉素的問世[7]，人們對新抗生素研發(fā)的腳步從未停止過。但相較于細菌耐藥性的發(fā)展，新型抗生素的發(fā)展顯得十分緩慢[8]。因此對新型抗生素的開發(fā)依然是非常急迫的。新疆位于亞歐大陸腹地，為我國最大的省份。自然環(huán)境多樣且特殊，近些年來，對于新疆地區(qū)放線菌資源的報道也層出不窮。研究者們已從羅布泊[9]，天池[10]等環(huán)境中獲取了大量的放線菌資源。但對于天山地區(qū)具有抑菌活性的放線菌鏈霉菌屬的研究還未見報道。天山山脈在我國境內(nèi)綿延1 700多公里，且雪嶺云杉為其單優(yōu)樹種，并為天山山脈所特有[11]。

歷經(jīng)風雨之后，方知社會是復(fù)雜的，水仙芝不想把它看得更復(fù)雜。她想過一種簡單的生活，一種純凈、沒有污染的生活。讀了很多書，她更不相信書，倒相信感覺。

為了發(fā)現(xiàn)更多對臨床病原菌有抑制作用的放線菌資源，以及豐富我們對新疆放線菌資源的認識，本課題組從天山山脈的不同區(qū)域的雪嶺云杉根際部位，采集了5份土壤樣品。從中篩選放線菌中的鏈霉菌屬進行鑒定以及抑菌活性初步分析，為獲取更多有價值的微生物資源以及開發(fā)新疆特色抗生素奠定基礎(chǔ)。

在抓實生態(tài)文明體制改革的同時，云南省環(huán)境污染第三方治理、環(huán)境監(jiān)管執(zhí)法工作、水污染防治和水功能區(qū)管理等改革取得突破。狠抓中央環(huán)境保護督察反饋問題的整改落實，建立省級環(huán)保督察機制，全省實現(xiàn)對16個州市環(huán)境保護督察全覆蓋。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集與處理

2019年5月采集自烏魯木齊南山雪嶺云杉森林。選取了5個采樣地點，采集貼敷于雪嶺云杉根須的土壤，用無菌袋封裝土壤樣品。在運回實驗室之前，保存在4 ℃的車載冰箱內(nèi)。

牛津杯法菌株的抑菌活性篩選：

表1 雪嶺云杉根際土壤采樣地點信息

1.1.2 培養(yǎng)基制備

聲檢查時，患者的體位不一致，可能會對檢查造成一定的影響。因此，在以后的研究中可以增大研究的樣本量，選擇有經(jīng)驗的超聲科醫(yī)生，讓患者保持最佳的檢查體位，提高研究結(jié)果的說服力。

50 mg·L-1重鉻酸鉀溶液(每種分離培養(yǎng)基在高壓滅菌后，溫度降至60 ℃左右時，加入3%的重鉻酸鉀溶液)。

1.1.3 抑制劑

發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉15 g，酵母浸粉5 g，牛肉膏蛋白胨2 g，蒸餾水1 000 mL，pH調(diào)整至7.2。

基于配變負載歷史數(shù)據(jù)，對采樣數(shù)據(jù)進行分類預(yù)測模型的選擇，通過比較分類模型的優(yōu)劣選出最優(yōu)模型。分類器模型的選擇過程以及分類器的準確率如下圖所示。

待檢菌株培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：液體高氏一號培養(yǎng)基，液體ISP2培養(yǎng)基。

分離培養(yǎng)基：(1) SEA培養(yǎng)基(土壤浸出液培養(yǎng)基)：土壤浸出液的制備：稱取500 g土壤樣品，加入1000 mL去離子水，2 g NaOH浸泡過夜。10 000 r·min-1，60 min離心，收集上清液調(diào)整PH至7.5，即為土壤浸出液。然后加入2%的吉蘭糖膠。121 ℃，15 min高壓滅菌。(2)SEG培養(yǎng)基：土壤浸出液1 000 mL，1/10濃度的高氏一號培養(yǎng)基，2%瓊脂。(3)SEISP2培養(yǎng)基：土壤浸出液1000 mL，1/10濃度ISP2培養(yǎng)基，2%瓊脂。(4)高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，0.5 g MgSO4·7 H2O，0.5 g NaCl，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂 20 g，1 L去離子水，pH調(diào)節(jié)至7.5。(5)ISP2培養(yǎng)基：麥芽浸粉10 g，酵母浸粉4 g，D-葡萄糖4 g，瓊脂20 g，1 L去離子水，pH調(diào)節(jié)至7.2。

1.1.4 抑菌活性實驗檢測菌株

1.2.5 與抗生素合成有關(guān)的基因簇檢測

在重選樣中我們選擇重砂1、重砂3、重砂5及重選尾礦進行了全方位考察。鈮鉭礦物、黃鐵礦等金屬硫化物及其他比重較大的礦物主要富集于重砂1中，為此又對重砂1進行了浮選分離(表6)，分離出以硫化物為主的硫精礦(浮硫精)和以氧化物為主的硫尾礦(浮硫尾)。重砂5中除石英外，云母含量亦較高，云母為銣的重要載體礦物，故我們對重砂5中云母進行了浮選富集。重選尾礦樣經(jīng)X衍射分析結(jié)果表明，成分主要為云母、石英和長石類礦物。

1.1.5 主要試劑及儀器

很多企業(yè)的內(nèi)控制度并不健全，領(lǐng)導及員工的內(nèi)部控制意識淡薄。這主要表現(xiàn)為：①有的企業(yè)沒有設(shè)置內(nèi)部控制制度。②有的企業(yè)雖然制定了內(nèi)部控制制度，但該制度存在缺陷，缺乏可操作性。③有的企業(yè)設(shè)定了有效的內(nèi)控制度，但是員工并沒有按制度執(zhí)行。

綜上所述，在當前我國高校建設(shè)和發(fā)展中，為了拓展高校教育建設(shè)資源，對于圖書館職能的建設(shè)和優(yōu)化也越來越重視，通過對圖書館建設(shè)中的管理系統(tǒng)開發(fā)設(shè)計，能夠更好地管理圖書資源，實現(xiàn)對圖書資源管理的科學化部署能力提升。通過本文的研究和分析，將高職院校圖書館管理系統(tǒng)開發(fā)與設(shè)計主要從以下幾點進行了研究：一是數(shù)據(jù)庫的開發(fā)與設(shè)計；二是功能模塊設(shè)計和優(yōu)化；三是管理系統(tǒng)的優(yōu)化設(shè)計，借助這種系統(tǒng)優(yōu)化設(shè)計分析，能夠?qū)⒄w的高職院校圖書館管理系統(tǒng)設(shè)計好，便于高職院校圖書館建設(shè)的科學化發(fā)展。

溶菌酶，蛋白酶K，RNA酶，醋酸鈉等DNA提取用品購于索萊寶公司；DNA Marker，Premix Taq購于Takara；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-50KBS，上海申安醫(yī)療器械廠；恒溫震蕩搖床HZQ-2，金壇市醫(yī)療器械廠；潔凈工作臺SW-CF-2FD，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；離心機centrifuge 5430R，德國Eppendorf公司；旋渦混勻器XH-C，金壇市醫(yī)療儀器廠；PCR擴增儀PowerCycler SL 96 Gradient，德國Biometra公司；電泳儀DYY-6C型，北京市六一儀器廠；凝膠成像儀Gel Doc-It2 310 Imager，美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

將采集的樣品放入200目細目篩中過篩處理，自然風干28 d。取1 g風干的土壤樣品，加入9 mL去離子水。在旋渦混勻器上劇烈震蕩10 min，靜止5 min。取上清液1 mL置于無菌管中，將土壤懸液終濃度調(diào)整至10-4g·mL-1，備用。

1.2.2 根際土壤菌株的篩選分離

將1.2.1中制備好的土壤懸液，取200 μL均勻涂布于5種分離培養(yǎng)基上。放置培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)28 d。按照伯杰氏細菌手冊所描述的鏈霉菌屬特征，將疑似菌株(干燥、產(chǎn)生色素、孢子成堆等特點)小心挑取進行純化培養(yǎng)。

(1)發(fā)酵液的制備：挑取已經(jīng)純化好的菌株或刮取少量的菌苔于10 mL的種子培養(yǎng)基中，放入恒溫震蕩培養(yǎng)箱中30 ℃，160 r·min-1培養(yǎng)72 h。用移液器吸取種子培養(yǎng)基中的菌液加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，使菌液的濃度占據(jù)發(fā)酵培養(yǎng)基的5%。以同樣的條件放入搖床培養(yǎng)2周。將搖好的菌液12 000 r·min-1，10 min離心收上清，并用0.22 μm的濾膜將上清液過濾備用。

具體DNA提取方法步驟參考姜淑梅等人的方法進行改良[12]。PCR擴增引物為27 F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492 R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。擴增體系為25 μL：12.5 μL的2×Premix Taq，10 pmol 27 F，10 pmol 1492R，50 ng的DNA模板，加滅菌水至25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min。95 ℃變性30 s，55 ℃退火2 min以及72 ℃延伸2 min進行35個循環(huán)。最后72 ℃延伸10 min。所得PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并送去生工(上海)生物工程股份有限公司進行測序。運用NCBI的BLAST程序?qū)y序所得序列進行比對，選取有效發(fā)表的同源性較高的序列，用DNAMAN進行多序列比對，采用MEGA7.0軟件中的鄰接(neighbor-joiningmethod,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[13]。

1.2.4 篩選所得菌株的抑菌活性檢測

此外，“冒進”風險也不容小覷。各地興起的“糧食銀行”以企業(yè)自發(fā)行為居多，在發(fā)展定位、管理水平、操作流程等方面參差不齊，有的在小規(guī)模儲售糧時運作自如，往往產(chǎn)生盲目樂觀的心態(tài)，提出“大干快上”的目標，形成經(jīng)營風險。

1.2.3 菌株DNA的提取及16SrRNA生物分子學分析

(2)將待檢測病原菌株用滅菌水將其濃度稀釋至0.5麥氏比濁管，并吸取200 μL涂布于NA培養(yǎng)基上。而后將滅菌牛津杯(內(nèi)徑6 mm，外徑8 mm，高10 mm的圓柱不銹鋼小管)放置其上。每個牛津杯中加入(1)中制備好的過濾上清液200 μL。30 ℃，培養(yǎng)48 h后觀察抑菌情況并記錄抑菌圈大小。

大腸桿菌(Escherichia coil)標準株ATCC25922，金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)標準株ATCC25923，以上兩種菌株由中國科學院(新疆)微生物研究所保藏。臨床分離株耐甲氧西林金葡菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)、產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)大腸桿菌、銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa,PA)由石河子大學醫(yī)學院提供。

《經(jīng)濟學人》中國專欄的報道并非只有諷刺或消極類，也有一些報道對中國的經(jīng)濟狀況或現(xiàn)象持肯定態(tài)度。2016年6月11日的中國專欄中，其中有一篇報道了關(guān)于溫州經(jīng)濟的現(xiàn)狀。該報道中包含三則概念隱喻——“對抗金融危機是戰(zhàn)爭”、“銀行是人”和“經(jīng)濟發(fā)展是旅程”。在“對抗金融危機是戰(zhàn)爭”概念隱喻中，金融危機對應(yīng)于敵人，對抗金融危機對應(yīng)于戰(zhàn)爭（例14）。在“銀行是人”概念隱喻中，銀行逐漸從金融危機的陰影中走出來對應(yīng)于人逐漸恢復(fù)健康（例15）。在“經(jīng)濟發(fā)展是旅程”概念隱喻中，用于承擔風險對應(yīng)于勇敢面對旅途中的危險（例16）。

PSKⅠ擴增基因為K1F(5′-TSAAGTCSAACATCGGBCA-3′)和M6R(5′-CGCAGG-TTSCS-GTACCAGTA-3′)，PSKⅡ擴增基因為KSα(5′-TSGCSTGCTTCGAYGCSATC-3′)KSβ(5′-TGGAANCCGCCGAABCCGCT- 3′)。非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)擴增基因為A3F(5′-GCSTACSYSATSTACACSTCSGG-3′)，A7R (5′-SASGTCVCCSGTSCGGTAS-3′)[14-15]。三對引物均上海生工合成。

3對引物反應(yīng)體系均與1.2.3中的相同，PSKⅠ反應(yīng)條件為95 ℃，5 min預(yù)變性。95 ℃，30 s，55 ℃，2 min，72 ℃，90 s。30個循環(huán)。72 ℃，10 min。PSKⅡ反應(yīng)條件為95 ℃，5 min預(yù)變性。95 ℃，30 s，60 ℃，2 min，72 ℃，60 s。30個循環(huán)。72 ℃，10 min。NRPS反應(yīng)條件為95 ℃，5 min預(yù)變性。95 ℃，30 s，59 ℃，30 s，72 ℃，60 s。30個循環(huán)。72 ℃，10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 雪嶺云杉根際土壤可培養(yǎng)鏈霉菌分離結(jié)果分析

從5份樣品，5種培養(yǎng)基中共分離得到160株菌株，而后根據(jù)形態(tài)學去除冗余，并通過PCR技術(shù)擴增16SrRNA基因?qū)赀M行鑒定。經(jīng)過序列比對分析得出：我們共分離出77株放線菌，其中鏈霉菌屬41株，占據(jù)53.38%。所分離的菌株TS007與有效序列Streptomyces griseoincarnatus(MK928393)，Streptomyces variabilis(KF551876)，Streptomyces sp.(JX244132)的相似性分別為97.97%、97.43%以及97.96%。菌株TS054與已知菌株Streptomyces venezuelae strain(MF077023)，Streptomyces exfoliatus(KF730770.1)的相似性分別為98.11%和98.10%、TS066與有效菌株Streptomyces ambofaciens(KR47-6414)，Streptomyces sp.(KX279622)的同源性在96.92%，96.99%。利用MEGA7.0軟件中的鄰接法(Neighbour-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹如圖1所示。三株菌株均與鏈霉菌屬的有效菌株聚在一起，且形成獨立的分支，可能為潛在新種。在菌株分離結(jié)果中，我們觀察到培養(yǎng)基的濃度影響著菌株分離的多樣性以及新鏈霉菌的分離，潛在新種TS007分離自SEA培養(yǎng)基，TS054和TS066分離自改良低濃度ISP2培養(yǎng)基。在一般商品化培養(yǎng)基，高氏一號培養(yǎng)基，改良高氏一號培養(yǎng)基以及ISP2培養(yǎng)基未分離出潛在新種。

圖1 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株TS007、TS054、TS066與其相近種的N-J系統(tǒng)進化樹

2.2 抑菌活性分析

牛津杯法抑菌試驗結(jié)果表明，至少對一種病原菌有抑菌作用的菌株一共22株，占比53.66%。具體抑菌情況如表2所示。結(jié)果顯示TS014抑菌活性最為突出，對于所選菌株均有抑制作用。其中對金黃色葡萄球菌抑制作用非常明顯，抑菌圈達到35 mm。

賽事組織者作為體育賽事的組織、承辦者，在整合體育賽事資源方面具有得天獨厚的優(yōu)勢，理論上能夠最大化地實現(xiàn)體育賽事轉(zhuǎn)播權(quán)的價值轉(zhuǎn)化。但是在權(quán)源上，它不像參賽者那樣貼近體育賽事，而更像是一個代理商：除了通過合同約定之外，很難證明其對體育賽事享有權(quán)利的正當性。參賽者則不同，作為體育賽事的直接參與者，其對體育賽事的權(quán)利訴求更為合理。但是體育賽事往往是多名參賽者共同完成的，尤其是足球聯(lián)賽這類大型競技類運動，往往涉及到十幾支參賽球隊。如果由參賽者自行處理其體育賽事轉(zhuǎn)播權(quán)，不僅容易出現(xiàn)爭執(zhí)，而且在效率上也是不經(jīng)濟的。

表2 分離自雪嶺云杉根際土壤鏈霉菌的抑菌活性

2.3 功能基因的篩選結(jié)果

本實驗選取了3對功能基因的引物對41株菌株進行檢測。結(jié)果顯示：大部分菌株都至少具有一條功能基因。一共32株，占比78.04%。其中PSKⅠ基因陽性13株，占比31.70%；PSKⅡ基因陽性菌株22株，占比53.66%；NRPS基因陽性菌株25株，占比60.98%。其中TS008、TS046、TS056在3種基因的檢測中均表現(xiàn)為陽性，且在抑菌活性實驗中均表現(xiàn)出了良好的抑菌效果。具體占比情況如表3所示。

表3 雪嶺云杉根際土壤分離獲得的代表性鏈霉菌菌株功能基因篩選

3 討論

鏈霉菌屬一直是抗生素研發(fā)的主力，目前運用于臨床的抗生素有超過70%都來源于鏈霉菌菌株的次級代謝產(chǎn)物[5]。近些年來已經(jīng)有很多研究機構(gòu)對新疆放線菌資源進行研究，但就新疆具有抑菌活性鏈霉菌屬的報道還較為少見。本實驗中，我們從5份土壤樣品中共分離到41株鏈霉菌，且菌株TS007、TS054、TS066經(jīng)過系統(tǒng)發(fā)育分析，可能為潛在新種。值得注意的是，TS007分離自SEA寡營養(yǎng)培養(yǎng)基，TS054和TS066分離自低濃度改良ISP2培養(yǎng)基。且經(jīng)過驗證，這三株菌株可在添加了土壤浸出液的高氏一號培養(yǎng)基、ISP2培養(yǎng)基中生長良好。但是在普通蒸餾水配置的培養(yǎng)基中生長緩慢或不產(chǎn)生氣生菌絲。這些現(xiàn)象表明，土壤浸出液中的某些營養(yǎng)成分是培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分更接近于這3株菌株的自然生長環(huán)境，更適宜它們的生長。同時，我們也推測寡營養(yǎng)和低營養(yǎng)培養(yǎng)基更適合此地新型放線菌的分離。

目前在世界范圍內(nèi)，濫用抗生素的現(xiàn)象依然普遍。使得耐藥菌株的種類越來越多，甚至出現(xiàn)了對大多數(shù)抗生素都產(chǎn)生耐藥作用的“超級細菌”[16]。目前臨床上耐藥性情況最為嚴峻的為腸桿菌屬，金黃色葡萄球菌，肺炎克雷伯菌，屎腸球菌，銅綠假單胞菌，鮑氏不動桿菌。這6類病原菌被合并簡稱為ESKAPE[17]。其中耐甲氧西林金葡菌(MRSA)與HBV、AIDS已并列成為臨床三大感染性疾患[18]。根據(jù)這一嚴峻情況，本實驗選用了其中的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶腸桿菌為靶標進行了抑菌活性初步研究，另外選取了敏感型大腸桿菌，金黃色葡萄球菌以及銅綠假單胞菌。其中對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有抑制作用的有7株，對產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶腸桿菌具有抑制作用的有4株。對二者均具有抑制作用的有2株。值得一提的是，三株潛在新種鏈霉菌有兩株都能抑制耐甲氧西林金葡菌的生長，且三株菌株都具備抗生素合成相關(guān)基因PSKⅠ、PSKⅡ、NRPS[19]。但TS054在本次抑菌實驗中未顯現(xiàn)出抑菌性，可能與發(fā)酵條件有關(guān)。

與此同時，抗生素合成相關(guān)基因檢測結(jié)果中至少具有其中一種基因的菌株共32株，總占比78.04%。其中PSKⅠ基因陽性13株，占比31.70%；PSKⅡ基因陽性菌株22株，占比53.66%；NRPS基因陽性菌株25株，占比60.98%。此比例要明顯高于抑菌實驗結(jié)果，在一定程度上可以指導我們預(yù)測具有抗生素研發(fā)潛力的菌株，也提醒研究人員可以嘗試對某些菌株的發(fā)酵條件進行進一步的優(yōu)化。但同時，比較兩組實驗的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，菌株TS014經(jīng)過3種基因檢測，結(jié)果均為陰性。我們分析推測，可能菌株TS014具有除實驗中所選3種基因之外的其他抗生素合成相關(guān)基因，例如PKSⅢ[20]。也可能是某種未知的功能基因，值得我們進一步設(shè)計實驗進行研究。

4 結(jié)論

通過以上研究結(jié)果分析，新疆天山地區(qū)雪嶺云杉根際土壤中，具有豐富的鏈霉菌資源。并且所分離出的菌株大多數(shù)都具有與抗生素合成有關(guān)的基因，同時在實驗中超過半數(shù)對臨床上常見的幾種病原菌表現(xiàn)出了良好的抑菌活性。這為后續(xù)研發(fā)新型抗生素以及具有新疆特色的抗生素奠定基礎(chǔ)。