宿萌,李蕊蕊,王歡,肖冬光,郭學(xué)武,陳葉福
(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津,300457)
葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中,非釀酒酵母往往被忽略或者被視為微生物變質(zhì)的源頭[1]。近年來(lái),為了解決純釀酒酵母菌株發(fā)酵帶來(lái)的風(fēng)味均質(zhì)化問(wèn)題,葡萄酒微生物學(xué)家重新審視了這些酵母在葡萄酒發(fā)酵中的作用[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn),不同非釀酒酵母可以產(chǎn)生不同的酯類、高級(jí)醇、脂肪酸以及醛酮等代謝產(chǎn)物,影響風(fēng)味物質(zhì)形成,進(jìn)一步影響葡萄酒的感官品質(zhì)[4-5]。與釀酒酵母相比,非釀酒酵母表現(xiàn)出較好的胞外酶活,其分泌的β-D-葡萄糖苷酶可以水解糖苷結(jié)合的非揮發(fā)性香氣化合物,從而促進(jìn)單萜、C13-降異戊二烯和苯衍生物等揮發(fā)性物質(zhì)的釋放[3,6],有利于更好地改善葡萄酒的香氣,提高葡萄酒的復(fù)雜性。
由于這些酵母的發(fā)酵性能較差,研究人員往往將其和釀酒酵母結(jié)合在一起進(jìn)行混合發(fā)酵[7]。戴爾有孢圓酵母作為最受關(guān)注的非釀酒酵母之一,其貢獻(xiàn)主要是提高脂肪酸乙酯的含量[8-9],且與釀酒酵母共發(fā)酵時(shí),能夠有效地降低乙酸及揮發(fā)酸的含量,提高葡萄酒的感官特性[10]。SUN等[11]發(fā)現(xiàn)戴爾有孢圓酵母參與的混合發(fā)酵能夠有效增強(qiáng)果香,減少生青味;原苗苗等[9]發(fā)現(xiàn)其參與的接種發(fā)酵均可增強(qiáng)發(fā)酵香氣,尤其是辛酸乙酯、癸酸乙酯和月桂酸乙酯等乙基酯的含量有明顯提升;ZHANG等[12]發(fā)現(xiàn)戴爾有孢圓酵母與不同的釀酒酵母混合發(fā)酵對(duì)葡萄酒的理化品質(zhì)和香氣質(zhì)量的影響各不相同,且順序接種可以更好地增加香氣的多樣性。此外,相較于其他非釀酒酵母,戴爾有孢圓酵母不僅對(duì)各種濃度糖、酒精和SO2的耐受性較強(qiáng)[13],還具有較快的生長(zhǎng)速率和糖消耗速率[14],因此適用于葡萄汁的高糖度發(fā)酵。
目前,關(guān)于戴爾有孢圓酵母對(duì)于香氣物質(zhì)的影響已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)越來(lái)越多研究人員和釀酒師的關(guān)注[15],但研究主要集中于赤霞珠葡萄,對(duì)于其他不同葡萄品種的酒樣香氣并沒(méi)有系統(tǒng)性研究。本實(shí)驗(yàn)以山東省蓬萊市的品麗珠和馬瑟蘭葡萄為原料,分別選擇釀酒酵母、戴爾有孢圓酵母單獨(dú)發(fā)酵以及兩者順序接種發(fā)酵3種不同的接種方式,采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)檢測(cè)發(fā)酵酒樣中香氣物質(zhì),驗(yàn)證戴爾有孢圓酵母對(duì)葡萄酒香氣的共性影響,同時(shí)探索品麗珠和馬瑟蘭葡萄酒香氣物質(zhì)的差異性,以期為戴爾有孢圓酵母更好地應(yīng)用于葡萄酒的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。
葡萄品種:品麗珠(Cabernet Franc,CF)、馬瑟蘭(Marselan,MS),山東省蓬萊市中糧長(zhǎng)城(煙臺(tái))有限公司新港基地。
菌株:釀酒酵母71B、戴爾有孢圓酵母ZYMAFLORE AlphaTD n.Sacch(Laffort,Bordeaux,F(xiàn)rance),上海杰兔工貿(mào)有限公司。
試劑:NaOH(分析純)、無(wú)水乙醇(分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;偏重亞硫酸鉀(食品級(jí)),法國(guó)LAFFORT公司;濃HCl(分析純),萊陽(yáng)市康德化工有限公司;CuSO4(分析純)、酚酞(分析純),天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;次甲基藍(lán)(分析純),天津市化學(xué)試劑三廠;4-甲基-2-戊醇(色譜純),美國(guó)Sigma-Aldrich 公司。
LRH-150型生化培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司;MS204S型電子天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;pHSJ-4A型臺(tái)式pH計(jì),上??茖W(xué)儀器有限公司;1260高效液相色譜儀,Agilent Technologies;57328-U D B/CAR/PDMS復(fù)合萃取頭,美國(guó)Supelco公司;PAL RSI85 SPME進(jìn)樣器,美國(guó)CTC公司;7890B氣相色譜儀、5977A質(zhì)譜儀,Agilent Technologies;DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),美國(guó)J&W公司。
1.3.1 葡萄酒釀造
釀酒葡萄→除梗破碎→室溫浸漬24 h,皮渣分離,低溫澄清→葡萄汁分裝→105 ℃滅菌15 min→冷卻→28 ℃接種酵母進(jìn)行發(fā)酵(非釀酒酵母接種48 h后接種釀酒酵母)
酵母添加量如表1所示,每個(gè)處理3個(gè)平行。
表1 接種處理方式 單位:g/L
1.3.2 葡萄酒理化指標(biāo)測(cè)定
總酸、酒精度和pH等基本指標(biāo)的測(cè)定均參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。
1.3.3 揮發(fā)性化合物測(cè)定
揮發(fā)性化合物的萃取與GC-MS分析條件參照原苗苗等[9]方法,具體操作如下:
揮發(fā)性物質(zhì)的富集:取8 mL葡萄酒、2.00 g NaCl和20 μL 2.00 g/L的4-甲基-2-戊醇(內(nèi)標(biāo)物)以及轉(zhuǎn)子于15 mL頂空瓶中,密封并搖勻,置于45 ℃的可加熱磁力攪拌器上,預(yù)熱10 min后,萃取50 min。
色譜條件:氣相色譜儀為配備有5977A MSD的Agilent 7890B;色譜柱DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升溫程序:40 ℃保持2 min,以6 ℃/min的速度升至230 ℃,保持15 min;載氣為He,平均線速度為25 cm/s;不分流進(jìn)樣模式。
質(zhì)譜條件:電子能量70 e ;質(zhì)譜掃描范圍30~400 u,在3.9次/s掃描速度下獲得。
1.3.4 揮發(fā)性化合物的定性定量分析
定性分析:運(yùn)用計(jì)算機(jī)譜庫(kù)(NIST14)對(duì)得到的MS圖進(jìn)行初步檢索和分析,再結(jié)合有關(guān)質(zhì)譜資料、保留時(shí)間以及相對(duì)峰度等方面的研究進(jìn)行人工譜圖解析,確定揮發(fā)性物質(zhì)的各個(gè)化學(xué)成分。
定量分析:采用內(nèi)標(biāo)法定量,計(jì)算樣品中各香氣組分的含量。
1.3.5 數(shù)據(jù)處理
采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析,多組間比較采用One-Way ANO A法,P<0.05認(rèn)為存在顯著性差異;采用SIMCA 13.0軟件進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA),以此獲得樣品分類信息;采用Heml軟件對(duì)樣品作熱圖統(tǒng)計(jì)分析;采用Origin 8軟件進(jìn)行香氣疊加分析。
表2顯示了酒精發(fā)酵結(jié)束后品麗珠和馬瑟蘭葡萄酒的基本理化指標(biāo)。酒樣中殘?zhí)呛繛?.71~2.30 g/L,表明所有的接種組均已完成酒精發(fā)酵,且混合發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)相較于對(duì)照組發(fā)酵更為完全。與CF-71B和MS-71B單獨(dú)發(fā)酵相比,戴爾有孢圓酵母單獨(dú)發(fā)酵和混合發(fā)酵酒樣中滴定酸含量顯著降低,可能是因?yàn)樵诨旌习l(fā)酵過(guò)程中,釀酒酵母與非釀酒酵母之間存在某些相互作用,使酵母分解有機(jī)酸的能力強(qiáng)于產(chǎn)酸能力,但具體作用機(jī)制未知[16-17]。此外,BELDA等[18]研究發(fā)現(xiàn),戴爾有孢圓酵母參與發(fā)酵能夠產(chǎn)生較低濃度的酒精;BASSO等[19]也曾提出,戴爾有孢圓酵母是探索低度啤酒新領(lǐng)域過(guò)程中最有希望的酵母。而本實(shí)驗(yàn)相應(yīng)的4組實(shí)驗(yàn)中酒精度并未發(fā)現(xiàn)顯著降低,可能是由于氣候變化影響了葡萄中酚成熟度和單寧含量[20],也可能是與實(shí)驗(yàn)所用的戴爾有孢圓酵母菌株有關(guān)。
表2 品麗珠葡萄糖和馬瑟蘭葡萄酒的基本理化指標(biāo)Table 2 Basic physicochemical indexes of Cabernet Franc and Marselan wines
香氣是葡萄酒感官品質(zhì)的重要方面,大多數(shù)香氣化合物是在酒精發(fā)酵過(guò)程中合成的,是酵母的次級(jí)代謝產(chǎn)物,受葡萄品種、酵母菌株及葡萄酒生產(chǎn)工藝等多種因素的影響[21]。本實(shí)驗(yàn)品麗珠葡萄酒中含有58種香氣化合物,而馬瑟蘭葡萄酒中含有60種。氣味活性值(odor acti ity alue,OA )>1的化合物對(duì)葡萄酒的香氣有很高貢獻(xiàn)[22],因此,將表3中OA >1的香氣化合物劃線并進(jìn)一步整理(表4)。品麗珠葡萄酒中OA >1的香氣化合物有16種,包括4種醇類、7種酯類、1種脂肪酸、1種羰基化合物和3種萜烯類化合物;而馬瑟蘭葡萄酒中OA >1的香氣化合物有17種,與品麗珠葡萄酒相比,雖然少了丁酸乙酯,但產(chǎn)生的α-紫羅蘭酮和β-大馬酮能夠在一定程度上提高葡萄酒的花香和果香,從而提高葡萄酒香氣的復(fù)雜性。此外,為了更加直觀地看出各種物質(zhì)含量之間的差異,對(duì)OA >1的香氣化合物作熱圖統(tǒng)計(jì)分析(圖1)。
2.2.1 醇類
高級(jí)醇是香氣化合物中最大的一類化合物。葡萄酒中高級(jí)醇的質(zhì)量濃度在300~400 mg/L時(shí)是可以被接受的,且當(dāng)其處于最佳質(zhì)量濃度(<300 mg/L)時(shí),具有令人愉悅的特性[23]。本實(shí)驗(yàn)在品麗珠和馬瑟蘭葡萄酒酒樣中檢測(cè)到醇類各16種,其中異戊醇、庚醇、2-壬醇和苯乙醇的質(zhì)量濃度均高于其閾值。結(jié)合表3和圖1-b來(lái)看,苯乙醇和總高級(jí)醇的質(zhì)量濃度在CF-TD中達(dá)到最高,分別為62.86和136.1 mg/L,其中高級(jí)醇的總量達(dá)到了香氣總量的59.53%;與品麗珠葡萄酒相比,馬瑟蘭葡萄酒中醇類的含量存在一定差異,這可能是由于不同葡萄品種中存在的氨基酸種類不同[24]。與MS-71B和MS-TD相比,MS-MIX中苯乙醇的濃度顯著增加,可能與戴爾有孢圓酵母中β-葡萄糖苷酶的活性有關(guān)[7]。
表3 品麗珠葡萄酒和馬瑟蘭葡萄酒中香氣化合物的質(zhì)量濃度 單位:mg/mL
續(xù)表3
表4 品麗珠葡萄酒和馬瑟蘭葡萄酒中香氣成分的OA 值(OA >1)Table 4 OA alues of Cabernet Franc and Marselan wines
a-各類化合物總含量的熱圖比較分析結(jié)果;b-醇類、酯類化合物含量的熱圖比較分析結(jié)果;c-脂肪酸、羰基類和萜烯類化合物含量的熱圖比較分析結(jié)果圖1 品麗珠葡萄酒和馬瑟蘭葡萄酒揮發(fā)性化合物含量的熱圖比較分析結(jié)果Fig.1 The comparison and analysis of heat map for the olatile compounds in Cabernet Franc and Marcelan wines注:圖a根據(jù)所有檢測(cè)出的各類揮發(fā)性化合物的總含量作圖;圖b和圖c根據(jù)OA >1的揮發(fā)性化合物的含量作圖
2.2.2 酯類
酯類是葡萄酒中重要的香氣化合物,對(duì)葡萄酒果香的產(chǎn)生具有積極的貢獻(xiàn)[12]。本實(shí)驗(yàn)在馬瑟蘭葡萄酒酒樣中鑒定出24種酯,其中6種達(dá)到其閾值,包括乙酸異戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和月桂酸乙酯;品麗珠葡萄酒酒樣中鑒定出23種酯,其中7種達(dá)到其閾值。由表3和圖1-b可知,馬瑟蘭葡萄酒能夠產(chǎn)生更豐富的酯類化合物。在戴爾有孢圓酵母單獨(dú)發(fā)酵的2組實(shí)驗(yàn)中,產(chǎn)生的乙酸異戊酯質(zhì)量濃度最高,分別達(dá)到了3.28和3.85 mg/L,另外在這2組實(shí)驗(yàn)中,乙酸乙酯的質(zhì)量濃度要高于其他組,與前人研究結(jié)果一致[7],但乙酸乙酯的質(zhì)量濃度低于其閾值,因此不會(huì)對(duì)葡萄酒的香氣產(chǎn)生不利影響。關(guān)于乙基酯, IANA等[25]曾提出,辛酸乙酯的存在似乎是戴爾有孢圓酵母的一大特征。結(jié)合圖1-b來(lái)看,在CF-TD、MS-TD以及MS-MIX中也說(shuō)明了這點(diǎn),相比起釀酒酵母71B單獨(dú)發(fā)酵,這3組實(shí)驗(yàn)中辛酸乙酯的質(zhì)量濃度明顯較高。
2.2.3 酸類
酸類化合物是葡萄酒中另一種重要的香氣化合物,可以賦予葡萄酒以果香、奶酪、脂肪和腐爛的風(fēng)味[9,26]。在低質(zhì)量濃度下,酸類化合物可以提高葡萄酒的復(fù)雜性;在高質(zhì)量濃度下,會(huì)對(duì)葡萄酒的香氣產(chǎn)生負(fù)面影響[27-28]。本實(shí)驗(yàn)在品麗珠葡萄酒和馬瑟蘭葡萄酒酒樣中均檢測(cè)出6種酸類化合物,其中僅癸酸的質(zhì)量濃度超過(guò)了其閾值。由表3和圖1-c可知,戴爾有孢圓酵母單獨(dú)發(fā)酵及混合發(fā)酵的酒樣中,酸類化合物的總質(zhì)量濃度顯著高于對(duì)照組,與原苗苗等[9]研究結(jié)果一致,可能是因?yàn)榇鳡栍墟邎A酵母更有利于有機(jī)酸的積累[29]。TONDINI等[30]在基因表達(dá)和釀酒學(xué)特性的研究中提出,相比釀酒酵母,戴爾有孢圓酵母中的乙醇脫氫酶基因ADHs的轉(zhuǎn)錄水平始終高于乙醛脫氫酶基因ALDs,使得更多乙醛生成乙醇,從而產(chǎn)生較少的乙酸;另外,相較于乙酰輔酶A水解酶基因(ACH1),戴爾有孢圓酵母傾向于表達(dá)更高水平的乙酰輔酶A合成酶基因(ACSs),有利于消耗乙酸生成乙酰輔酶A。因此,在戴爾有孢圓酵母單獨(dú)發(fā)酵以及其參與的混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中乙酸含量應(yīng)該有明顯降低,而在本實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)論與此相反,這可能和實(shí)驗(yàn)選擇的菌株有關(guān)。
2.2.4 萜烯類
萜烯為葡萄酒提供花香以及果香,且閾值較低,因此較低含量的萜烯也會(huì)在一定程度上影響葡萄酒的香氣。本實(shí)驗(yàn)中,分別在品麗珠葡萄酒和馬瑟蘭葡萄酒酒樣中檢測(cè)出6種和7種萜烯類化合物,且里那醇、香茅醇、香葉醇及馬瑟蘭葡萄酒酒樣中的α-紫羅蘭酮與β-大馬酮的OA 值都很高,說(shuō)明其對(duì)2種葡萄酒的風(fēng)味物質(zhì)具有較大貢獻(xiàn)。此外,萜烯類化合物在不同的葡萄品種酒樣中種類差距很大(圖1-c),如在品麗珠葡萄酒中未檢測(cè)到α-紫羅蘭酮和β-大馬酮;在馬瑟蘭葡萄酒酒樣中,也并未檢測(cè)到雪松醇。另外,馬瑟蘭葡萄酒中的萜烯類化合物質(zhì)量濃度普遍高于品麗珠葡萄酒,說(shuō)明相較于后者,前者的花香和果味更為濃郁。且相比于MS-71B,MS-MIX中里那醇、香茅醇、 β-大馬酮以及總萜烯類的濃度均有不同程度的提高,這可能是由于戴爾有孢圓酵母分泌的β-D-葡萄糖苷酶水解了非揮發(fā)性糖苷物質(zhì),從而促進(jìn)了萜烯類物質(zhì)的釋放,與WHITENER等[31]的結(jié)論一致。
由于葡萄酒香氣成分復(fù)雜、差異較大[27],為直觀展示6個(gè)酒樣的香氣特點(diǎn),對(duì)表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。由圖2-a可知,PC1正半軸上主要分布著能夠賦予葡萄酒花香味的萜烯類化合物及具有醇香味的高級(jí)醇,負(fù)半軸上的香氣化合物主要為具有果香的酯類化合物;PC2正半軸上分布著絕大多數(shù)的香氣化合物,而負(fù)半軸上分布的信息較少。由圖2-b可知,PC1正半軸上主要分布著酯類化合物、萜烯類化合物以及大部分的高級(jí)醇,而負(fù)半軸上分布的香氣信息較少;PC2正半軸上主要是酯類和萜烯類化合物,其負(fù)半軸得分較高的有香葉醇、己酸乙酯、α-紫羅蘭酮、2-壬酮和庚酸乙酯等。
由圖2可知,2個(gè)葡萄品種的香氣化合物在PC1、PC2所形成的二維平面上的位置存在明顯差異,說(shuō)明葡萄品種是影響葡萄酒香氣成分的主要因素。MS-TD酒樣在PC1正半軸上得分較高,因此其花香、水果香氣豐富濃郁,且伴有醇香。同樣的,CF-TD酒樣在PC2負(fù)半軸上得分較高,即該酒樣具有花香的特點(diǎn)。由此可知,戴爾有孢圓酵母對(duì)于不同葡萄品種酒樣的香氣影響很大。另外,相比于CF-MIX與CF-71B之間的距離,MS-MIX與MS-71B之間相距較遠(yuǎn),說(shuō)明馬瑟蘭葡萄酒中混合發(fā)酵對(duì)于香氣的改善更為明顯,從而進(jìn)一步證明了戴爾有孢圓酵母對(duì)葡萄酒香氣品質(zhì)的影響與葡萄品種有關(guān)。因此在葡萄酒釀造過(guò)程中,需要根據(jù)葡萄品種選擇合適的酵母。
a-品麗珠葡萄酒主成分分析圖; b-馬瑟蘭葡萄酒主成分分析圖圖2 不同葡萄品種酒樣的主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis of wine samples from different grape arieties
為了揭示戴爾有孢圓酵母對(duì)葡萄酒香氣特征的影響及不同香氣化合物對(duì)葡萄酒嗅覺的影響,將具有相似氣味描述的揮發(fā)物OA (OA >1)疊加,從而建立芳香系列[12](圖3)。根據(jù)前人的研究[19,32-34],這些化合物的香氣與“香蕉”、“青蘋果”、“檸檬”、“玫瑰”、“果味”、“蜂蜜”、“脂肪”、“油膩”和“溶劑”相關(guān),最終獲得6種芳香系列的揮發(fā)性化合物,包括果香、花香、甜果、草本、化學(xué)和脂肪。其中,花香和果香系列最為突出,其次是脂肪、甜果、草本和化學(xué)系列。與品麗珠葡萄酒相比,馬瑟蘭葡萄酒中果香和花香系列香氣明顯增加,尤其是MS-MIX中,花香、果香系列香氣達(dá)到最高,一方面由于產(chǎn)生較多的苯乙醇、癸酸乙酯和辛酸乙酯;另一方面,雖然己酸乙酯、庚酸乙酯、α-紫羅蘭酮和β-大馬酮的質(zhì)量濃度較低,但因其對(duì)應(yīng)的閾值偏低,所以果香和花香氣味明顯。
圖3 OA 疊加香氣分析圖Fig.3 Aroma analysis chart of superimposed OA注:花香系列化合物:苯乙醇、香茅醇、里那醇、β-大馬酮;果味系列化合物:2-壬醇、香葉醇、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯、α-紫羅蘭酮、β-大馬酮;甜味系列化合物:苯乙醇、α-紫羅蘭酮;草本系列化合物:2-壬醇、香葉醇;化學(xué)系列化合物:異戊醇;脂肪系列化合物:庚醇、癸酸、癸酸乙酯、月桂酸乙酯
研究發(fā)現(xiàn),戴爾有孢圓酵母單獨(dú)及混合發(fā)酵均可降低葡萄酒中滴定酸的含量。戴爾有孢圓酵母參與的發(fā)酵有利于葡萄酒中苯乙醇、脂肪酸乙酯(辛酸乙酯、丁酸乙酯、癸酸乙酯和月桂酸乙酯等)的合成,從而大大增加了葡萄酒的花香和果香。戴爾有孢圓酵母對(duì)葡萄酒香氣質(zhì)量的影響因葡萄品種不同而不同,馬瑟蘭葡萄酒比品麗珠葡萄酒的香氣更加濃郁,其中在MS-TD中,芳香物質(zhì)葡萄酒質(zhì)量濃度達(dá)到最高,為242.67 mg/L;另外,在馬瑟蘭葡萄酒中檢測(cè)出了α-紫羅蘭酮和β-大馬酮,其他萜烯類化合物的含量也有顯著提高,使葡萄酒中花香、果香氣味更加顯著,MS-MIX中葡萄酒的花香和果香系列香氣達(dá)到最高。因此,本研究通過(guò)驗(yàn)證戴爾有孢圓酵母對(duì)葡萄酒共性的影響以及探索2種葡萄酒香氣物質(zhì)的差異性,為戴爾有孢圓酵母更好地應(yīng)用于葡萄酒的生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。