晏玲 胡愛民 張利芳

摘要 目的：探討糖腎煎對(duì)2型糖尿病腎?。―N）大鼠的腎保護(hù)作用。方法：采用單腎切除+高脂飼料+小劑量鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射，結(jié)合行為干預(yù)（饑飽失常、勞逸無(wú)度、驚嚇）建立2型DN氣陰兩虛型證大鼠模型，共60只。按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為A組（假手術(shù)）、B組（模型）、C組（糖腎煎）、D組（貝那普利），每組15只。檢測(cè)各組大鼠干預(yù)處理后血糖[空腹血糖（FBG）、餐后2 h血糖（PBG）]、尿素氮（BUN）、血肌酐（Cr）、24 h尿白蛋白（24 h-UAlb）、胱抑素c（Cys-c）及血、尿β2微球蛋白（β2-MG），比較各組大鼠腎組織病理特征。結(jié)果：與A組比較，B組BUN、Cr升高并不顯著（P>0.05），F(xiàn)BG、PBG、24 h-UAlb、Cys-c及血、尿β2-MG均明顯上升（P<0.05）;與B組比較，C、D組24 h-UAlb、Cys-c及血、尿β2-MG均有明顯降低（P<0.05）;C、D 2組上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;腎臟組織病變程度由正常～嚴(yán)重依次為A組、C組、D組、B組。結(jié)論：中藥復(fù)方糖腎煎能有效降低2型糖尿病腎病大鼠的血糖、24 h-UAlb、Cys-c及血、尿β2-MG，發(fā)揮腎保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞 2型糖尿病腎病;大鼠模型;氣陰兩虛型;糖腎煎;血糖;血清胱抑素C;β2微球蛋白;腎保護(hù)

Abstract Objective：To explore the renal protective effects of Tangshen Decoction on type 2 diabetic nephropathy（DN）rats.Methods：A total of 60 type 2 diabetic nephropathy rats with deficiency of both qi and yin were established by single nephrectomy，high fat diet and small dose of streptozotocin（STZ）intraperitoneal injection combined with behavioral intervention（hunger and satiety disorder，excessive work and rest，fright）and were randomly divided into a group A（sham operation），a group B（model），a group C（Tangshen Decoction）and a group D（benazepril），with 15 rats in each group.Fasting blood glucose（FBG），2 h postprandial blood glucose（PBG），urea nitrogen（BUN），serum creatinine（CR），24-hour urinary albumin（24 h UAlb），Cystatin C（Cys-C），blood and urine β 2-microglobulin（β 2-mg）were detected after intervention.The pathological characteristics of renal tissue were compared between the 2 groups.Results：Compared with group A，BUN and Cr in group B did not increase significantly（P>0.05），F(xiàn)BG，PBG，24 h-UAlb，Cys-c，blood and urine β2-MG increased significantly（P<0.05）; compared with group B，24 h-UAlb，Cys-c，blood and urine β2-MG in group C and D decreased significantly（P<0.05）; the above indexes in group C and group D had no statistical significance（P>0.05）; renal tissue lesions from normal to severe were A group，C group，D group，B group.Conclusion：Tangshen Decoction，the Chinese patent medicine can effectively reduce blood sugar，24 h-UAlb，Cys-c，blood and urine group β2-MG in type 2 diabetic nephropathy rats，and has protective effects on early DN kidney.

Keywords Type 2 diabetic nephropathy; Rat model; Deficiency of both qi and yin; Tangshen Decoction; Blood glucose; Serum cystatin C; β2-microglobulin; Renal protection

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.18.005

糖尿病腎?。―iabetic Nephropathy，DN）是糖尿病的常見并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎病的重要原因，全國(guó)調(diào)查慢性腎功能衰竭的主要病因，糖尿病因素居第2位。絕大部分早期腎損害患者無(wú)臨床癥狀或缺乏特異性，尿常規(guī)檢查和腎功能檢查也多無(wú)異常，給早期診治帶來較大困難。近些年有研究表明在DN早期，血清胱抑素c（Cys-c）與血、尿β2微球蛋白（β2-MG）上升更早于血清尿素氮（BUN）和血肌酐（Cr），可作為早期DN診斷及療效評(píng)價(jià)的敏感指標(biāo)[1]。目前尚無(wú)治療DN的特效療法，臨床常用的有運(yùn)動(dòng)、飲食療法、預(yù)防“3高”（血壓、血糖、血脂）等治療和預(yù)防方法，但療效不盡理想，因此關(guān)于早期DN的治療方案探究一直是臨床研究的熱點(diǎn)[2]。糖腎煎是治療2型糖尿病腎病的經(jīng)典方劑，臨床相關(guān)文獻(xiàn)也較多，但對(duì)于其腎保護(hù)作用機(jī)制有待深入探討，此外相關(guān)病理觀察方面的報(bào)道也較少。本研究建立早期2型糖尿病腎病氣陰兩虛病證結(jié)合實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探討運(yùn)用中藥復(fù)方糖腎煎對(duì)2型DN大鼠血糖、BUN、Cr、24 h尿白蛋白（24 h-UAlb）、Cys-c及血、尿β2-MG的影響，評(píng)價(jià)糖腎煎糖腎煎對(duì)2型糖尿病腎病的治療作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 本次實(shí)驗(yàn)共收集SPF級(jí)Wistar雄性大鼠共60只，體質(zhì)量大鼠100～130 g，平均體質(zhì)量（114.5±10.6）g，均購(gòu)自湖北省疾病控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK鄂2016-0150，倫理審批號(hào)：醫(yī)研倫審（2016）第04號(hào)]，基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)，飲用消毒無(wú)菌水。

1.1.2 藥物 糖腎煎由生黃芪、太子參、生地黃、山藥、山茱萸、茯苓、牡丹皮、五味子、赤芍、三七等中藥組成，用“水煮醇提法”制備成浸膏，用生理鹽水稀釋成含生藥2.5 g/mL的溶液。貝那普利（諾華制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字20000292），10 mg/片。脂飼料配制：按照基礎(chǔ)飼料87.5%、豬油10%、膽固醇粉2%、膽酸鈉粉0.5%0.5%的比例混合配制。

1.1.3 試劑與儀器 血糖檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20091201）;BUN、Cr檢測(cè)試劑盒（北京恩濟(jì)和生物有限公司，批號(hào)：A141201、A141203）;β尿2-MG試劑盒（深圳新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司，批號(hào)：031150115）;尿微量白蛋白（umAlb）試劑盒（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司，批號(hào)：20141205E）。穩(wěn)豪血糖儀（強(qiáng)生公司，美國(guó)，型號(hào)：one Touch Ultrall），全自動(dòng)生化分析儀（雅培公司，美國(guó)，型號(hào)：CD-1600），顯微鏡（奧林巴斯公司，日本，型號(hào)：BX-51）和圖像采集系統(tǒng)（奧林巴斯公司，日本，型號(hào)：DP70）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行血糖、血壓、血脂、體質(zhì)量等常規(guī)測(cè)量，均確保無(wú)指標(biāo)異常大鼠。隨機(jī)選取其中15只大鼠作為A組（假手術(shù)），余下45只作為模型制備對(duì)象，分成B組、C組和D組15只。參考文獻(xiàn)[3-4]建立2型糖尿病腎病“氣陰兩虛證”大鼠模型，具體方法：1）單腎切除：除A組外，大鼠常規(guī)1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉消毒后，行背部切口1.5 cm，剝離腎臟脂肪、腎上腺，左腎門血管結(jié)扎，切除左腎后縫合切口，術(shù)后常規(guī)處理。A組行切口后僅暴露左腎、縫合切口處理。2）高脂飼料：除A組外，單腎切除術(shù)后7 d給予高脂飼料正常喂養(yǎng)，A組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，持續(xù)2周。3）鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射：除A組外，均給予STZ 30 mg/kg腹腔注射，A組注射等劑量0.1 mmol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。72 h后行OGTT試驗(yàn)，血糖儀檢測(cè)FBG≥5.6 mmol/L或負(fù)荷后2 h血糖≥7.8 mmol/L表示模型初步建立。4）行為干預(yù)：除A組外，采用饑飽失常、勞逸無(wú)度、驚嚇刺激等途徑干預(yù)。

1.2.2 干預(yù)方法 A組繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)。C組給予中藥復(fù)方糖腎煎10 g/（kg·d）灌胃。D組采用貝那普利（諾華制藥）10 mg/（kg·d）灌胃處理，用生理鹽水稀釋成2 mg/mL的溶液灌胃。A、B2組給予飲用純凈水灌胃處理，灌胃純凈水體積同C、D 2組灌胃藥液體積，4組均連續(xù)灌胃處理20周。若研究中途有大鼠死亡則予以剔除。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 均于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 w采用金屬代謝籠收集24 h尿標(biāo)本，記錄尿量后取10 mL尿標(biāo)本。OGTT實(shí)驗(yàn)結(jié)束后禁食12 h，以戊巴比妥鈉腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，以備檢測(cè)。血糖（FBG、PBG）測(cè)定用葡萄糖氧化酶法;BUN用尿素酶-谷氨酸脫氫酶法;Cr用酶法;umAlb用免疫透射比濁法;血、尿β2-MG用化學(xué)發(fā)光法;Cys-c用免疫比濁法，所有指標(biāo)均嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。剝離摘取大鼠右側(cè)腎臟，冰生理鹽水清洗后吸干表面水分，10%福爾馬林固定72 h，制備4 μm石蠟切片，蘇木素伊紅（HE）染色，光鏡下觀察各組大鼠腎組織病理特征。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，先對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，當(dāng)滿足正態(tài)分布和方差性時(shí)，組間比較采用t檢驗(yàn)，若當(dāng)不滿足正態(tài)分布則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫蠡厩闆r A組大鼠體態(tài)正常，進(jìn)食、飲水、排泄、運(yùn)動(dòng)、睡眠等均正常，無(wú)死亡;B組大鼠體態(tài)衰弱，毛發(fā)稀少枯黃，四肢纖瘦乏力，少動(dòng)嗜睡，排泄習(xí)慣及排泄物形態(tài)異常，死亡2只;C組大鼠體態(tài)稍次于A組，明顯優(yōu)于B組，大鼠進(jìn)食、飲水、睡眠習(xí)慣、排泄等基本正常，毛發(fā)略有干枯，顏色略微黯淡，運(yùn)動(dòng)量稍有減少，死亡1只;D組大鼠體態(tài)次于A組、C組，優(yōu)于B組，大鼠進(jìn)食、飲水、運(yùn)動(dòng)量有一定減少，排尿次數(shù)增多，毛發(fā)干枯稀少，毛發(fā)枯黃，四肢纖瘦乏力，死亡2只。

2.2 4組大鼠FBG、PBG指標(biāo)比較 和A組比較，B、C、D組血FBG、PBG均顯著偏高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;和B組比較，C組血FBG、PBG明顯偏低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），和D組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.3 4組大鼠腎功能BUN、Cr、24 h-UAlb、Cys-c、血尿β2-MG指標(biāo)比較 和A組比較，B、C、D組BUN、Cr均有升高，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），B、C、D組24 h-UAlb、Cys-c、血尿β2-MG均顯著偏高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;和B組比較，C、D組24 h-UAlb、Cys-c、血尿β2-MG均明顯降低（P<0.05或P<0.01）。見表2、表3。

2.4 4組大鼠腎組織病理特征 A組大鼠光鏡下清晰可見腎小管、小管間質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)，腎小管上皮細(xì)胞大小及排列均正常，基底膜完整等。B組可見局部腎小管間質(zhì)纖維化，并伴有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和腎小球系膜細(xì)胞增生，腎小管上皮細(xì)胞可見脫落和顆粒變性等。C組可見腎小管、小管間質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)等基本正常，伴有部分腎小球系膜細(xì)胞輕度增生和、少量腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性。D組可見局部腎小管間質(zhì)輕度纖維化和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，伴有腎小管水腫、細(xì)胞顆粒變性和腎小球萎縮等。各組大鼠腎組織病理特征由正?！∽儑?yán)重順序依次為A、C、D、B組。見圖1。

3 討論

DN的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，早期進(jìn)行有效診治可延緩病情的進(jìn)展。血清Cys-c是半胱氨酸蛋白酶抑制劑，主要由機(jī)體所有有核細(xì)胞產(chǎn)生。循環(huán)中的Cys-c可經(jīng)腎小球自由濾過，在近端腎小管上皮細(xì)胞被完全分解，腎臟是唯一清除Cys-c的器官，因此血清Cys-c是一種反映腎小球?yàn)V過率變化的理想同源性標(biāo)志物[5]。研究表明血清Cys-c與腎小球?yàn)V過率（GFR）呈良好的線性關(guān)系，且早于、優(yōu)于Cr，檢測(cè)血清Cys-c可明確DN的進(jìn)展情況[6]。β2-MG由淋巴細(xì)胞等合成并分泌到血液及體液中，血液中的β2-MG可以從腎小球自由濾過，99.9%在近端腎小管吸收，并在腎小管上皮細(xì)胞中被分解[7-8]。當(dāng)腎小球?yàn)V過功能下降時(shí)，血β2-MG開始升高，因而能夠及時(shí)反映腎小球?yàn)V過功能的損傷[7];當(dāng)腎小管功能發(fā)生異常時(shí)，重吸收功能下降，尿β2-MG含量升高[9]，因而尿β2-MG是診斷腎小管功能損傷尤其是近曲小管功能損傷的敏感性指標(biāo)。李波等[10]的臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示血清Cys-c、β2-MG比Cr、BUN能更敏感、更準(zhǔn)確的反映GFR，對(duì)早期診斷腎功能損害具有重要臨床價(jià)值。

DN屬中醫(yī)“消渴”“水腫”“尿濁”等范疇，以氣陰兩虛為本，瘀血阻絡(luò)為標(biāo)，病位在腎?；颊呦嗜站?，化燥傷陰耗氣，終致氣陰兩虛;氣虛則氣血津液運(yùn)行不暢，瘀血、痰濁阻絡(luò)[11]。根據(jù)DN氣陰兩虛、瘀血阻絡(luò)的基本病機(jī)，本研究采用中藥復(fù)方糖腎煎益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)辨證治療，配方由黃芪、太子參、生地黃、山藥、山茱萸、茯苓、牡丹皮、三七、五味子等配伍而成，方中黃芪、太子參、山藥健脾益氣，使氣行血行。黃芪味甘性溫，可溫補(bǔ)肺、脾、腎，疏利三焦，可利水消腫[12]。生地黃清熱涼血，養(yǎng)陰生津，山茱萸補(bǔ)益肝腎，收斂固澀?，F(xiàn)代藥理學(xué)[13]證實(shí)山地-山茱萸治療DN具有協(xié)同增益作用，可有效抑制DN患者糖基化產(chǎn)物產(chǎn)生，抑制細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）增生和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）表達(dá)，改善或延緩DN腎小球硬化。茯苓健脾滲濕、利水消腫;牡丹皮清熱涼血、活血化瘀;三七止血散瘀、補(bǔ)虛消腫;五味子益氣生津、補(bǔ)腎寧心。諸藥配伍共奏補(bǔ)益脾腎，益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)之功[14-15]。

本研究顯示，B組大鼠的血糖、血清Cys-c、血、尿β2-M、24 h-UAlb均明顯升高，但腎功能尚正常，血清BUN、Cr升高并不顯著（P>0.05），符合早期氣陰兩虛型2型糖尿病腎病特點(diǎn)。C組和D組用藥治療20周后，大鼠血清Cys-c、血、尿β2-M、24 h-UAlb均較B組有明顯降低（P<0.05或P<0.01），且2組療效類似，證實(shí)了糖腎煎能改善2型糖尿病腎病的腎功能，對(duì)腎臟具有保護(hù)作用。但本研究也存在不足，未對(duì)糖腎煎保護(hù)2型DN大鼠腎功能的作用機(jī)制進(jìn)行探究，有報(bào)道[16]指出糖克腎煎劑可能通過降低TGF-β1、mi R-192、Col1a2、Collagen I的表達(dá)，提高SIP1表達(dá)等途徑保護(hù)DN大鼠腎臟功能，在后續(xù)研究有待深入完善。

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（2019-06-13收稿 責(zé)任編輯：王楊）