王立峰，王新亮，張春鴻，劉堯，馬鄭

作者單位：1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧 沈陽(yáng)110032；2大連市藥品檢驗(yàn)所化學(xué)室，遼寧 大連116000

鹽酸奧洛他定為新型組胺受體阻斷劑。鹽酸奧洛他定片用于治療成人蕁麻疹、多種皮膚病引起的瘙癢及兒童的過(guò)敏性鼻炎等癥［1-2］。本品由日本協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會(huì)社（Kyowa Hakko Kirin Co.，Ltd.）研制，2000年12上市，國(guó)家為日本。

本品的仿制藥已在我國(guó)上市。2018年大連市藥品檢驗(yàn)所承擔(dān)了鹽酸奧洛他定片、膠囊、滴眼劑的國(guó)家藥品計(jì)劃抽驗(yàn)課題。本研究評(píng)價(jià)了國(guó)產(chǎn)鹽酸奧洛他定口服制劑的質(zhì)量，經(jīng)調(diào)研，尚未見該制劑相關(guān)研究?jī)?nèi)容的報(bào)道。在研究中，我們發(fā)現(xiàn)現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)檢查法存在不科學(xué)及落后的缺陷，如未能控制特定雜質(zhì)、檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置不合理等。為全面評(píng)估該仿制品種的安全性和有效性，2018年2—8月我們采用風(fēng)險(xiǎn)控制的理念［3］，首先建立了針對(duì)性的有關(guān)物質(zhì)檢查法，確定并控制4 個(gè)特定雜質(zhì)，明確雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)和來(lái)源，并進(jìn)一步開展了國(guó)產(chǎn)制劑與原研制劑的雜質(zhì)譜的對(duì)比研究。除此以外，還開展了其他探索性研究工作，從而科學(xué)評(píng)估該國(guó)產(chǎn)鹽酸奧洛他定口服制劑的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695 高效液相色譜，配備四元梯度泵和自動(dòng)進(jìn)樣器；紫外檢測(cè)器（2489 型），并配備二極管陣列檢測(cè)器（2998 型，方法建立及強(qiáng)制降解時(shí)采用），美國(guó)Waters公司生產(chǎn)；MSA225s-100-DA型分析天平，德國(guó)Sartrious公司生產(chǎn)。

1.2 試藥 對(duì)照品：鹽酸奧洛他定（批號(hào)R058Q0，含量99.9%，美國(guó)藥典委員會(huì)）鹽酸奧洛他定雜質(zhì)B（批號(hào)R077Q0，含量100.0%，美國(guó)藥典委員會(huì)）。鹽酸奧洛他定雜質(zhì)C（批號(hào)R065M0，含量99.0%，美國(guó)藥典委員會(huì)）。鹽酸奧洛他定雜質(zhì)甲醛衍生物（批號(hào) 1-VHP-134-4，含量 97.0%，Toronto Research Chemicals）。鹽酸奧洛他定雜質(zhì)E（批號(hào)101099-200901，含量100.0%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

國(guó)產(chǎn)鹽酸奧洛他定片、鹽酸奧洛他定原料（批號(hào) 17103006、17103007、17103009、17053010）。國(guó)產(chǎn)鹽酸奧洛他定膠囊、鹽酸奧洛他定原料（批號(hào)171001、170901、170903）。原研制劑：鹽酸奧洛他定片（日本協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會(huì)社，批號(hào)257AGC、269AGG、257AGF、250AGA、246PFK），乙腈（色譜純，Merck公司生產(chǎn)），實(shí)驗(yàn)用水為超純水，十二烷基硫酸鈉（分析純，河北百靈威精細(xì)材料有限公司），磷酸二氫鉀（分析純，國(guó)藥試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 辛基硅烷鍵合硅膠色譜柱（Intertsil C8，5 μm，4.6 mm×250 mm 或效能相當(dāng)）；以0.5%十二烷基硫酸鈉的磷酸鹽溶液和乙腈的混合溶液為流動(dòng)相［取十二烷基硫酸鈉5.0 g，用0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（加10%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH 至3.5）-乙腈（55∶45）的混合溶液溶解并稀釋至1 000 mL］，檢測(cè)波長(zhǎng)為299 nm，柱溫為40 ℃。

2.2 供試品溶液的制備 取鹽酸奧洛他定片、膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，稱取粉末適量（約相當(dāng)于10 mg），置50 mL 量瓶中，加流動(dòng)相適量，振搖使溶解，再稀釋至刻度，搖勻并濾過(guò)。取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密量取供試品溶液適量，用流動(dòng)相定量稀釋成濃度為2μg/mL的溶液，作為對(duì)照溶液。

2.3 空白溶液的制備 按處方組成，取空白輔料，照“2.2”項(xiàng)制備方法，制備空白輔料溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性溶液的制備 精密稱取“1.2”項(xiàng)下的各對(duì)照品適量，制成含鹽酸奧洛他定200μg/mL，鹽酸奧洛他定雜質(zhì)C、鹽酸奧洛他定雜質(zhì)E、鹽酸奧洛他定雜質(zhì)甲醛衍生物均為2μg/mL 的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

圖1 高效液相色譜圖：A為系統(tǒng)適用性溶液，B為膠囊劑供試品溶液，C為空白溶液

2.5 測(cè)定法 精密量取對(duì)照溶液和供試品溶液各50μL，分別注入液相色譜儀，記錄至主成分保留時(shí)間的2 倍。供試品溶液色譜峰如有雜質(zhì)峰，在相對(duì)保留時(shí)間為0.4 處的雜質(zhì)（雜質(zhì)A），應(yīng)不得大于對(duì)照溶液主峰面積的0.4 倍（0.4%）；在相對(duì)保留時(shí)間為0.9 處的雜質(zhì)（雜質(zhì)C），應(yīng)不得大于對(duì)照溶液主峰面積的0.4倍（0.4%）；在相對(duì)保留時(shí)間為1.5處的雜質(zhì)（雜質(zhì)E），峰面積乘以0.22，應(yīng)不得大于對(duì)照溶液主峰面積的0.4 倍（0.4%）；鹽酸奧洛他定E-異構(gòu)體（采用對(duì)照品定位），峰面積乘以0.77，應(yīng)不得大于對(duì)照溶液主峰面積的0.4 倍（0.4%）；其他單個(gè)雜質(zhì)面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積的0.2 倍（0.2%），雜質(zhì)總量不得大于對(duì)照溶液主峰面積（1.0%）。

2.6 色譜條件的建立 鹽酸奧洛他定原料藥的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法已有報(bào)道［4-6］。USP40［7］中收載了本品原料藥的有關(guān)物質(zhì)方法，并控制了雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E、雜質(zhì)甲醛衍生物。但該法需分別在兩種色譜系統(tǒng)下測(cè)定，操作繁瑣。本研究建立了同時(shí)測(cè)定上述4種已知雜質(zhì)的有關(guān)物質(zhì)方法，4種已知雜質(zhì)均能基線分離并準(zhǔn)確定量。強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步說(shuō)明，4種雜質(zhì)均為降解產(chǎn)物，因此建議增訂入制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中進(jìn)行定量控制。系統(tǒng)適用性溶液圖譜見圖1。

2.7 方法學(xué)驗(yàn)證

2.7.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 強(qiáng)制降解試驗(yàn)：（1）酸破壞試驗(yàn)：稱取鹽酸奧洛他定約5 mg，并置于25 mL 量瓶中，加 1 mL 的鹽酸溶液（0.01 mol/L），室溫放置0.5 h，加堿液中和處理，即得。（2）堿破壞試驗(yàn)：取鹽酸奧洛他定約5 mg，并置于25 mL 量瓶中，加1 mL的氫氧化鈉（0.01 mol/L），室溫放置0.5 h，加酸液中和處理，即得。（3）氧化破壞試驗(yàn)：取鹽酸奧洛他定約5 mg，并置于25 mL 量瓶中，加1 mL 0.5%過(guò)氧化氫溶液，室溫放置2 h，即得。（4）光照試驗(yàn)：取本品裸片，置于4 500±500 lx 照度下放置5、10 d，照供試品溶液制備方法，即得。（5）高溫破壞試驗(yàn)：取本品裸片，置于70 ℃空氣浴中分別放置5、10 d，精密稱取本品細(xì)粉（相當(dāng)于本品5 mg）照供試品溶液制備方法，即得。（6）高濕試驗(yàn)：取本品制劑，置于溫度25 ℃，相對(duì)濕度90%，分別放置5、10 d，照供試品溶液制備下方法。分別取上述溶液各50 mL，進(jìn)樣分析。強(qiáng)制降解結(jié)果表明：在氧化條件下，雜質(zhì)C與相鄰雜質(zhì)分離度為1.2。在其他降解條件下，分離度均大于1.5，二極管陣列檢測(cè)器結(jié)果顯示各已知雜質(zhì)純度角小于純度閾值，說(shuō)明峰純度良好，并且各雜質(zhì)不干擾主峰的測(cè)定。上述研究結(jié)果說(shuō)明專屬性良好。

2.7.2 線性關(guān)系考察 精密稱取鹽酸奧洛他定對(duì)照品10.20 mg，置于25 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，得線性關(guān)系溶液。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明：在0.254～254.2μg/L 的濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積的呈良好的線性關(guān)系。線性方程：Y＝2.32×105X+6 462，r＝0.999 7。

2.7.3 定量限 取線性關(guān)系項(xiàng)下的對(duì)照品貯備溶液逐級(jí)稀釋，直至約為信噪比的10 倍，作為定量限濃度。測(cè)得定量限濃度為0.127μg/mL。

2.7.4 精密度實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照溶液連續(xù)進(jìn)樣6 針，測(cè)得峰面積的RSD 值，結(jié)果RSD%小于0.8%，說(shuō)明本法精密度良好。

2.7.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將本品供試品溶液，室溫放置2、4、6、8、12、24 h后依法測(cè)定，供試品溶液四個(gè)已知雜質(zhì)峰面積RSD 小于5.0%，主峰峰面積RSD 小于1.0%，也未發(fā)現(xiàn)其他新雜質(zhì)。說(shuō)明本品24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.6 測(cè)定結(jié)果 采用本研究實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)原研制劑及國(guó)產(chǎn)制劑有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)行雜質(zhì)種類和數(shù)量的對(duì)比研究。結(jié)果見表1。結(jié)果表明，國(guó)產(chǎn)片劑與原研制劑的雜質(zhì)水平基本一致，但國(guó)產(chǎn)膠囊劑雜質(zhì)水平高于原研制劑。

表1 原研制劑及國(guó)產(chǎn)制劑有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果/%

3 有效性、質(zhì)量可控性評(píng)價(jià)

經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研本品為BCS1 類或BCS3 類的藥物。在溶出度研究中，鹽酸奧洛他定片以水為介質(zhì)，在槳法50 轉(zhuǎn)的條件下迅速崩解，基本在5 min 內(nèi)可釋放85%以上，屬于非?？焖偃艹?。膠囊劑在小杯法中的釋放稍慢，但在15 min內(nèi)也可達(dá)到80%的溶出量。依據(jù)相關(guān)指導(dǎo)原則［8-9］，本品為速釋制劑，溶出不為本藥物吸收的“限速步驟”。因此，本研究將溶出度檢查項(xiàng)視為中低風(fēng)險(xiǎn)因素，未納入質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。但是為更好反應(yīng)制劑廠家工藝水平，我們開展國(guó)產(chǎn)制劑的批間溶出度考察，并與原研制劑溶出曲線的對(duì)比研究，結(jié)果顯示國(guó)產(chǎn)片劑與原研制劑溶出曲線基本一致，批間溶出度差異較小。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面，仿制藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均存在一定缺陷。如有關(guān)物質(zhì)檢查中未控制特定雜質(zhì)、檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定不合理等。其中膠囊劑中的溶出度檢查法為小杯法，為我國(guó)藥典特有，且該法易受漏槽條件等因素影響。隨著我國(guó)加入ICH 及國(guó)際化的不斷深入，該檢查法應(yīng)逐漸替代。因此本研究進(jìn)一步開展了小杯法與槳法的對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)槳法同樣適合本品溶出度檢查，因此建議更改為槳法。

4 討論

4.1 雜質(zhì)譜的分析 為更好闡述雜質(zhì)的來(lái)源，我們開展了雜質(zhì)的來(lái)源和降解途徑研究，結(jié)果見表2。研究表明，鹽酸奧洛他定具有比較好的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定性。相對(duì)來(lái)說(shuō)，光照條件對(duì)本品的降解影響最大，且以雜質(zhì)E 的增加最大。光照同時(shí)還可產(chǎn)生雜質(zhì)B、雜質(zhì)甲醛衍生物以及未知雜質(zhì)，提示本品的生產(chǎn)、檢測(cè)、貯藏、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)應(yīng)注意光照的影響。強(qiáng)制降解試驗(yàn)（氧化、酸、堿破壞）研究表明，本品在氧化條件下產(chǎn)生雜質(zhì)C，提示本品的貯存條件應(yīng)注意氧化。研究還發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)C 性質(zhì)不穩(wěn)定，容易發(fā)生二次降解。

表2 雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)、來(lái)源、降解途徑分析

對(duì)原料藥的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了雜質(zhì)E。進(jìn)一步從工藝的角度判斷，該雜質(zhì)也可在工藝中產(chǎn)生，即是工藝雜質(zhì)也是降解產(chǎn)物，研究表明本品原料藥的標(biāo)準(zhǔn)也應(yīng)注重該雜質(zhì)的控制。

4.2 色譜條件的確定 在確定特定雜質(zhì)后，建立方法時(shí)參考并重現(xiàn)了現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)：國(guó)產(chǎn)片劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)YBH04732014）；原研片劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)JX20160058）；膠囊劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)YBH2382005）；滴眼劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)YBH06602008）；原研滴眼劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)JX20130147）；USP40；JP17。通過(guò)對(duì)上述標(biāo)準(zhǔn)的重現(xiàn)，原研片劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)能夠較好分離幾種雜質(zhì)。但方法需加入內(nèi)標(biāo)物，未采用校正因子定量。本研究對(duì)方法進(jìn)行了優(yōu)化并采用加校正因子的定量方式?？疾炝薈8和C18色譜柱對(duì)分離的影響，結(jié)果C8柱的保留時(shí)間較長(zhǎng)，使得雜質(zhì)C與主峰有更好的分離度。離子對(duì)試劑影響方法的選擇性，對(duì)分離效果有重大影響。研究考察了離子對(duì)試劑的種類和濃度，考察了庚烷磺酸鈉和十二烷基硫酸鈉對(duì)分離度的影響。結(jié)果表明十二烷基硫酸鈉的分離效果更好。又進(jìn)一步比較了十二烷基硫酸鈉的生產(chǎn)廠家，發(fā)現(xiàn)進(jìn)口試劑的分離效果優(yōu)于國(guó)產(chǎn)制劑，增加十二烷基硫酸鈉濃度至0.5%時(shí)，特定雜質(zhì)均實(shí)現(xiàn)了基線分離。為確定方法的檢測(cè)波長(zhǎng)，我們測(cè)定了4 種特定雜質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)。分別為雜質(zhì)B 300 nm，雜質(zhì)C 271 nm，雜質(zhì)E 299 nm，雜質(zhì)甲醛衍生物296 nm，因此最終確定為299 nm。在該波長(zhǎng)下，能夠兼顧各雜質(zhì)靈敏度的要求。在限度的確定上，本研究參考USP40現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，符合FDA 相關(guān)指導(dǎo)原則［10-11］及ICH［12-13］，并結(jié)合法定檢驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果。綜上，擬定限度能夠反應(yīng)本品質(zhì)量，保證本品安全性。

4.3 耐用性考察 采用Hypersil gold C8（4.6 mm×150 mm）色譜柱考察了系統(tǒng)適用性溶液，各雜質(zhì)峰位未發(fā)生改變，但是分離效果不如250 mm 色譜柱。結(jié)果說(shuō)明本法應(yīng)使用250 mm 色譜柱。進(jìn)一步考察了柱溫對(duì)分離的影響。當(dāng)升高柱溫至45 ℃，保留時(shí)間有所縮短，但對(duì)分離度無(wú)明顯影響，為延長(zhǎng)色譜柱壽命不采用高柱溫。

5 結(jié)論

本研究建立了鹽酸奧洛他定口服制劑的有關(guān)物質(zhì)高效液相色譜方法。本法優(yōu)勢(shì)為在同一條件下測(cè)定4 種已知雜質(zhì)，具有方便、快速的特點(diǎn)。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明本法符合我國(guó)藥典技術(shù)要求［14］。通過(guò)強(qiáng)制降解及影響因素試驗(yàn)，4 種雜質(zhì)均為制劑的降解產(chǎn)物，因此建議在制劑標(biāo)準(zhǔn)中控制。通過(guò)與原研制劑進(jìn)行雜質(zhì)對(duì)比研究，結(jié)果表明國(guó)產(chǎn)片劑雜質(zhì)種類和數(shù)量均不大于原研制劑，且未發(fā)現(xiàn)超過(guò)報(bào)告閾值的未知雜質(zhì)。因此，國(guó)產(chǎn)片劑雜質(zhì)譜與原研制劑一致。國(guó)產(chǎn)膠囊劑雜質(zhì)水平高于原研制劑，說(shuō)明應(yīng)提高國(guó)產(chǎn)膠囊劑產(chǎn)品質(zhì)量。通過(guò)開展有關(guān)物質(zhì)的對(duì)比研究，能夠客觀揭示國(guó)產(chǎn)制劑的安全性。在有效性和質(zhì)量可控性研究中，基于風(fēng)險(xiǎn)控制的理念，建議提升和統(tǒng)一有關(guān)物質(zhì)的檢查法，并將膠囊劑中溶出度檢查法由小杯法改為槳法。

綜上，本研究表明：從雜質(zhì)譜等方面考察，國(guó)產(chǎn)鹽酸奧洛他定片質(zhì)量為“好”，國(guó)產(chǎn)鹽酸奧洛他定膠囊質(zhì)量為“一般”。本研究結(jié)果及其他相關(guān)文獻(xiàn)表明［15］，現(xiàn)行膠囊劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)進(jìn)行必要提升。