周海巖，周建寶，易曉男，李勉，柳志強*

1(浙江省生物有機合成技術研究重點實驗室(浙江工業(yè)大學)，浙江 杭州，310014) 2(手性生物制造國家地方聯(lián)合工程研究中心(浙江工業(yè)大學)，浙江 杭州，310014) 3(浙江華康藥業(yè)股份有限公司，浙江 開化，324302)

昆布多糖是一類存在于海洋藻類中的聚糖，基本結(jié)構包括以β-1,3-糖苷鍵連接的葡萄糖作為主鏈，在結(jié)構內(nèi)部還含有β-1,6-糖苷鍵。作為一類與纖維素等多糖結(jié)構類似的自然資源，昆布多糖在生物燃料行業(yè)中也可作為發(fā)酵底物而發(fā)揮重要的作用[1-2]。據(jù)報道，褐藻中的昆布多糖可被細菌昆布多糖酶水解從而進行乙醇生產(chǎn)[3]。昆布多糖酶(EC 3.2.1.6)，又稱β-1,3-葡聚糖酶，是能夠催化β-D-葡聚糖中1,3-糖苷鍵和1,4-糖苷鍵斷裂的一類糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GH)。在細菌中，昆布多糖酶包括外切β-1,3-葡聚糖酶(EC 3.2.1.58)和內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶(EC 3.2.1.39)，都可將昆布多糖及其結(jié)構類似的多糖水解為單糖或寡糖[4]。據(jù)CAZy數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，昆布多糖酶分布于GH3、GH5、GH16、GH17、GH55、GH64、GH81、GH128、GH152、GH157和GH158家族；GH16家族的內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶所占比例最大[5]。

有研究人員以大腸桿菌(Escherichiacoli)為宿主對昆布多糖酶進行表達，如FLamA和FLamB[6]、Mzl86[7]和GFA[8]等。這些酶在E.coli中表達水平較低，最適溫度基本處于45～55 ℃，且熱穩(wěn)定性和pH耐受能力一般，難以滿足工業(yè)化應用需求。因此，開發(fā)不同來源的昆布多糖酶并選擇更適合的表達系統(tǒng)具有重要的意義。研究表明，嗜鹽微生物及其相關基因在工業(yè)應用中具有巨大的潛力[9-11]。嗜鹽紅色鹽桿菌Rhodohalobacterbarkolensissp. 15182T是從鹽湖中分離的一種新型嗜鹽非運動型細菌，其最適生長鹽質(zhì)量濃度為20～30 mg/mL[12]。UniProt[13]數(shù)據(jù)庫顯示，該菌基因組中含有豐富的GH基因，包括GH16家族的昆布多糖酶基因。因此，開發(fā)R.barkolensis來源的昆布多糖酶用于高鹽環(huán)境中昆布多糖等多糖的降解具有潛在的應用價值。畢赤酵母(Pichiapastoris)作為真核生物表達系統(tǒng)，不僅能對重組蛋白進行必要的修飾加工、分泌表達調(diào)控和高密度發(fā)酵，而且自身蛋白分泌較少，更有利于后續(xù)的分離純化等操作[14]。本文采用畢赤酵母GS115為表達宿主對來源于R.barkolensis的昆布多糖酶RbLam16進行基因克隆和表達，然后對RbLam16進行表征和生產(chǎn)條件優(yōu)化,以期為昆布多糖酶在生物質(zhì)資源化中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

E.coliDH5α及質(zhì)粒pPIC9K由旭冠生物科技有限公司提供，畢赤酵母GS115由實驗室保存。

1.1.2 試劑

Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase, azyme(南京)公司；SacI,NEB(北京)有限公司；質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、PCR清潔試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒,Axygen(杭州)有限公司；氨芐青霉素、遺傳霉素G418、蛋白Marker、核酸染料,上海生工；BCA蛋白含量檢測試劑盒,凱基生物；昆布多糖,百靈威；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物 5，蛋白胨 10，NaCl 10，pH 7.0，固體培養(yǎng)基添加20g/L瓊脂粉。

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，YPD)培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物 10，蛋白胨 20，葡萄糖 20，固體培養(yǎng)基添加20g/L瓊脂粉。

MD(minimal dextrase)培養(yǎng)基(g/L)：酵母無氨基氮源(yeast nitrogen base，YNB)13.4，葡萄糖 20，固體培養(yǎng)基添加20g/L瓊脂粉。待培養(yǎng)基溫度降至60℃以下，補加終濃度為400 μg/L的生物素溶液。

基本培養(yǎng)基(minimal medium，MM)(g/L)：YNB 13.4，固體培養(yǎng)基添加20g/L瓊脂粉。使用前補加終濃度為400 μg/L的生物素溶液，以0.5%(體積分數(shù))的比例補加甲醇。

緩沖型最小甘油復合(buffered minimal glycerol-complex，BMGY)培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物 10，蛋白胨 20，YNB 13.4，KH2PO4-K2HPO4緩沖液(pH 6.0)10%(體積分數(shù))，丙三醇1%(體積分數(shù))。使用前補加終濃度為400 μg/L的生物素溶液。

緩沖型甲醇復合(buffered methanol-complex，BMMY)培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物 10，蛋白胨 20，YNB 13.4，KH2PO4-K2HPO4緩沖液(pH 6.0)10%(體積分數(shù))。使用前補加終濃度為400 μg/L的生物素溶液。

1.1.4 主要儀器

TAd anced 96/96G PCR儀，德國Analytikjena；Bio-Rad瓊脂糖凝膠電泳儀、GelDoc凝膠成像系統(tǒng)、Bio-Rad電穿孔儀、Bio-ScaleTM鎳柱及蛋白純化儀，美國Bio-Rad公司；NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白濃度測定儀，美國Thermo公司；ThermoMIXER C恒溫混勻儀，德國Eppendorf公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 序列分析

昆布多糖酶RbLam16的氨基酸序列(GenBank ID:PKD44866.1)從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得；使用SignalP 4.1[15](http://www.cbs.dtu.dk/ser ices/SignalP-4.1/)預測信號肽；蛋白分子量和等電點(pI)使用ProtParam[16](https://web.expasy.org/protparam/)工具；蛋白親疏水性使用ProtScale[16](https://web.expasy.org/protscale/)進行分析；氨基酸多序列比對以及蛋白二級結(jié)構預測分別使用Clustal Omega[17](https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)和ESPript 3.0[18](http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript)。

1.2.2 基因克隆及重組表達

根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性對RbLam16基因序列進行優(yōu)化，目的基因大小為798 bp，G+C含量為48%。優(yōu)化后的RbLam16基因于3′端加入6個His-Tag序列，并在5′和3′端分別加入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點，由上海旭冠生物公司合成、構建表達質(zhì)粒pPIC9K/rblam16，并轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中。

將含有pPIC9K/rblam16的E.coliDH5α經(jīng)含有氨芐的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后，使用試劑盒提取質(zhì)粒并純化。純化產(chǎn)物經(jīng)SacI進行線性化，電泳驗證并膠回收線性化產(chǎn)物。

將線性pPIC9K/rblam16電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞中，在MD平板培養(yǎng)基培養(yǎng)3～5 d(30 ℃)。挑取單菌落轉(zhuǎn)接至含不同G418質(zhì)量濃度(0.25、0.5和1.0 mg/mL)的YPD平板培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，挑取G418最高質(zhì)量濃度平板上的單菌落進行PCR驗證，引物為α-Factor(5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′)和3′AOX(5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′)。

挑取陽性轉(zhuǎn)化子接種至25 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)至菌體OD600為2～6；離心(4 ℃、5 000 r/min，5 min)收集菌體，轉(zhuǎn)接至35 mL BMMY培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)96 h，每24 h添加1%(體積分數(shù))純甲醇誘導RbLam16表達。同時，每24 h取樣離心(4 ℃、8 000 r/min,10 min)進行SDS-PAGE分析。發(fā)酵結(jié)束后，對發(fā)酵液進行離心、Bio-ScaleTM鎳柱純化以及SDS-PAGE分析。蛋白濃度使用BCA試劑盒進行測定。

1.2.3 酶活力測定

采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法[19]測定RbLam16的酶活力。將150 μL 10 mg/mL昆布多糖溶液溶于50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH 7.0)在55 ℃預熱10 min，加入純化后的酶液50 μL。55 ℃、500 r/min反應2.5 min；立即加入200 μL DNS溶液，混勻后于沸水中加熱10 min，冷卻后在560 nm測定吸光值；根據(jù)葡萄糖標準曲線計算還原糖的量。酶活力單位定義：在55 ℃、pH 7.0條件下，每分鐘生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

1.2.4 酶學性質(zhì)研究

1.2.4.1 RbLam16最適反應溫度及pH

為測定RbLam16的最適反應溫度，設定35、45、55、65、75、85和95 ℃ 7組反應溫度。按照1.2.3小節(jié)中酶活力測定方法分別測定上述條件下的酶活力。為測定RbLam16的最適反應pH，分別用100 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 3.0～6.5)、50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 6.5～8.5)和50 mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 8.5～10.5)配制不同pH的昆布多糖溶液。按照1.2.3小節(jié)中酶活力測定方法在最適溫度下測定各組酶活力。

1.2.4.2 RbLam16熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性

將酶液分別在45、55、65 ℃保溫30 min，每5 min取樣在最適反應條件下測定殘余酶活力，將未保溫的酶液活力設為100%，考察RbLam16的熱穩(wěn)定性。將酶液分別在4 ℃不同pH緩沖液(pH 6.0、6.5、7.0、7.5)存放24 h，每12 h在最適反應條件下測定殘余酶活力，以未做處理的酶液活力為100%，考察RbLam16的pH穩(wěn)定性。

1.2.4.3 金屬離子和化學試劑對酶活力的影響

為考察金屬離子和化學試劑對酶活力的影響，向反應體系中加入終濃度為5 mmol/L的MnCl2、KCl、CoCl2、NiCl2、NaCl、CaCl2、MgSO4、ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、(NH4)2SO4、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)和乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)，在最適反應條件下測定各組酶活力；以不加金屬離子或化學試劑的反應酶活力作為100%。

1.2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

為研究培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度、甲醇添加比例和發(fā)酵時間對GS115/pPIC9K/rblam16生長以及產(chǎn)酶的影響，分別將BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體離心后轉(zhuǎn)接至不同pH(4、5、6和7)的BMMY培養(yǎng)基中，在不同的發(fā)酵溫度(26、28、30和32 ℃)、150 r/min發(fā)酵，每24 h以不同的體積比例(0.5%、1.0%、1.5%及2.0%)添加甲醇。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液離心(4 ℃、8 000 r/min，10 min)，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后作為粗酶液進行酶活力測定；菌體干燥后測定生物量。

2 結(jié)果與討論

2.1 序列分析

來源于R.barkolensis的昆布多糖酶RbLam16一級序列包含285個氨基酸殘基，在N端1-21位存在信號肽(MFNFHPIILSLLMALSLTSCA)。成熟RbLam16的分子質(zhì)量為29.62 kDa，pI為4.43。蛋白平均親水性系數(shù)為-0.657 1，預測為親水蛋白。RbLam16的序列與同家族的ULam111[4]序列相似性為42%，與RmLamR[20]、BglF[21]、pfLamA[22]和TmLam[23]相似性分別為41%、39%、42%和39%。以ULam111(PDB ID：5 WUT_A)為模板對RbLam16進行二級結(jié)構預測，如圖1所示。

圖1 多序列比對及二級結(jié)構預測Fig.1 Multi-sequence alignment and secondary structure prediction

RbLam16二級結(jié)構包括2個α螺旋和18個β片層，具有GH16家族典型的“β-jelly roll”結(jié)構；存在Arg89、Trp116、Trp120和His154等4個保守氨基酸殘基(黑色星號標記)以及Glu136、Asp138和Glu141等3個催化殘基(橙色星號標記)。

2.2 基因克隆及表達純化

將質(zhì)粒pPIC9K/rblam16線性化處理后，電轉(zhuǎn)至GS115感受態(tài)細胞中，單菌落通過PCR進行驗證，結(jié)果如圖2所示。重組菌通過甲醇誘導分泌表達目的蛋白，粗酶液經(jīng)純化后進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3所示。

a-重組質(zhì)粒pPIC9K/rblam16：M-DL5000 DNA marker，1、2-PCR產(chǎn)物(1.2 kbp)；b-重組質(zhì)粒Sac I單酶切線性化：M-1 kb DNA Ladder marker,1-環(huán)狀質(zhì)粒對照,2、3、4-線性化產(chǎn)物(10 kbp)；c-GS115/pPIC9K/rblam16陽性轉(zhuǎn)化子篩選：M-DL5000 DNA marker，1、2、3-菌落PCR產(chǎn)物(1.0 kbp)圖2 核酸瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Nucleic acid agarose gel electrophoresis

a-發(fā)酵上清液SDS-PAGE:M-蛋白Marker,1、2、3、4分別為24、48、72、96 h發(fā)酵上清液；b-純酶液SDS-PAGE:M-蛋白Marker,1-純化產(chǎn)物(30 kDa)圖3 RbLam16的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the RbLam16

2.3 酶學性質(zhì)

2.3.1 RbLam16最適反應溫度及pH

如圖4-a所示，RbLam16的最適反應溫度為55 ℃，此時酶活力為155.32 U/mg。當溫度高于55 ℃時，酶活力開始下降，而在95 ℃時仍有69.19 U/mg的酶活力，表明該酶對高溫有一定的耐受力。與已報道的昆布多糖酶GFA[8](來源于Formosaalgae，最適溫度45 ℃)、LA-Lam[24](來源于Pseudoalteromonas，最適溫度45 ℃)、LamC27[25](來源于Corallococcussp.，最適溫度45 ℃)和Mz186[7](來源于Mesofla ibacterzeaxanthinifaciens，最適溫度50 ℃)相比，RbLam16的最適反應溫度更高。如圖4-b所示，RbLam16最適反應pH為7.0，且在pH 4.5～10.5范圍內(nèi)酶活力均大于100 U/mg，說明該酶的活性范圍較廣，在偏堿性的環(huán)境下仍能發(fā)揮催化作用。RbLam16與同家族的LamC27[25]最適反應pH相當，說明2種酶更偏向在中性環(huán)境下發(fā)揮作用。

a-溫度對酶活力的影響; b-pH對酶活力的影響圖4 溫度及pH對RbLam16活力的影響Fig.4 The effect of temperature and pH on the acti ity of the RbLam16

2.3.2 RbLam16熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性

如圖5-a所示，在45 ℃下RbLam16的熱穩(wěn)定性最好，30 min后仍保留初始酶活力的88%左右；其次，在最適溫度55 ℃時也有較好的熱穩(wěn)定性，30 min后剩余酶活60%以上；而在65 ℃時的熱穩(wěn)定較差，30 min后酶活力只有40%左右。與GFA[8](其在45 ℃下保存20 min酶活力僅剩余50%，在55 ℃保存10 min后已無活性)相比，RbLam16的熱穩(wěn)定更高。

如圖5-b所示，RbLam16在pH 7.5時穩(wěn)定性最好，24 h保存后仍殘余93%的酶活力；而在pH 6.0時穩(wěn)定性較差，24 h僅剩余67%左右的酶活力；在pH 6.5和pH 7.5時保存24 h，殘余酶活力均為初始酶活力的72%左右。有研究發(fā)現(xiàn)，GH50家族的PaBglu50A[26]在pH 4.0～8.0范圍時保存30 min后穩(wěn)定性較好，后期可以進一步研究RbLam16在酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性。

a-RbLam16的熱穩(wěn)定性; b-RbLam16的pH穩(wěn)定性圖5 溫度及pH對RbLam16穩(wěn)定性的影響Fig.5 The effects of temperature and pH on the stability of RbLam16

2.3.3 金屬離子和化學試劑對酶活力的影響

由表1可知，Mn2+和Co2+對RbLam16酶活均有促進作用，酶活分別提高到122.96%和112.63%；Na+和Fe2+對RbLam16有輕微的抑制作用；而Cu2+、EDTA和SDS對RbLam16有較強的抑制作用，相對酶活分別為59.98%、51.75%和38.88%；其他試劑對RbLam16也有一定的抑制作用，酶活力均為對照的85%左右。

表1 金屬離子和化學試劑對RbLam16酶活力的影響Table 1 Effects of metal ions and chemicals on the acti ity of RbLam16

據(jù)報道，Mn2+對昆布多糖酶Mz186[7]和LamC27[25]也具有促進作用，可能它們的蛋白結(jié)構存在某種相似性，從而產(chǎn)生相似的作用效果。

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 培養(yǎng)基初始pH對菌體生長和產(chǎn)酶的影響

研究表明，不同pH環(huán)境對酵母細胞生長及蛋白分泌表達產(chǎn)生重要影響，過酸或過堿均會抑制菌體生長甚至導致菌體死亡[27]。如圖6-a所示，GS115/pPIC9K/rblam16的生物量在pH 6.0時達到高。在pH 4.0～6.0時，酶活力由12.51 U/mL提高至16.88 U/mL；而在pH 7.0時，酶活力開始降低。綜合考慮，確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最適初始pH為6.0。

2.4.2 培養(yǎng)溫度對菌體生長和產(chǎn)酶的影響

在不同的培養(yǎng)溫度下，細胞的生長和代謝均會發(fā)生變化，直接或間接影響蛋白的分泌表達[27]。如圖6-b所示，在不同溫度下，生物量和酶活力呈現(xiàn)相似的變化趨勢，當生物量達到最大時，酶活力也最高；反之亦然。在28 ℃時，兩者達到最高水平，分別為31.95 g/L和19.52 U/mL。因此，發(fā)酵的最適溫度為28 ℃。

a-pH對菌株生長及產(chǎn)酶的影響;b-溫度對菌株生長及產(chǎn)酶的影響圖6 發(fā)酵液初始pH和發(fā)酵溫度對重組GS115/pPIC9K/rblam16生長及產(chǎn)酶的影響Fig.6 The effects of initial pH and fermentation temperature on the growth and enzyme production of recombinant GS115/pPIC9K/rblam16

2.4.3 甲醇添加比例對菌體生長和產(chǎn)酶的影響

畢赤酵母是甲醇營養(yǎng)型酵母，可利用甲醇可作為誘導劑促進重組酶的分泌表達[14]。由圖7-a可知，在0.5%～1.5%范圍內(nèi)，提高甲醇添加比例，生物量和酶活力也相應的增加，在甲醇添加比例為1.5%時，兩者達到最高，分別為27.5 g/L和21.84 U/mL；而過高的添加量(2%)對重組菌產(chǎn)生毒性作用。因此，最適甲醇添加比例為1.5%。

2.4.4 發(fā)酵時長對菌體生長和產(chǎn)酶的影響

由圖7-b可知，隨著發(fā)酵的進行(24～120 h)，生物量和酶活力逐漸增加，在120 h時均達到最高值，分別為27.73 g/L和27.42 U/mL。而當發(fā)酵延長至144 h時，生物量和酶活力均有所下降。因此，最適發(fā)酵時間為120 h。

a-甲醇添加量對菌株生長及產(chǎn)酶的影響; b-發(fā)酵時間對菌株生長及產(chǎn)酶的影響圖7 甲醇添加比例和發(fā)酵時間對重組GS115/pPIC9K/rblam16生長及產(chǎn)酶的影響Fig.7 The effects of methanol addition ratio and fermentation time on the growth and enzyme production of recombinant GS115/pPIC9K/rblam16

3 結(jié)論

本研究將來源于R.barkolensis的昆布多糖酶RbLam16的基因通過整合到畢赤酵母GS115基因組中實現(xiàn)分泌表達。RbLam16屬于GH16家族，該酶最適反應溫度和pH分別為55 ℃和7.0。相較于已報道的其他同類酶，RbLam16在45～65 ℃和pH 6.0～7.5范圍內(nèi)熱穩(wěn)定性和酸堿耐受能力更為出色。因此，該酶在能源開發(fā)、食品等領域具有更大的應用價值。

通過發(fā)酵條件優(yōu)化，確定了GS115/pPIC9K/rblam16的最適培養(yǎng)基pH為6.0、溫度為28 ℃、甲醇添加比例為1.5%(體積分數(shù))以及發(fā)酵時間為120 h；在該條件下，酶活力達到27.42 U/mL，比初始值提高26.42%。

為進一步提高昆布多糖酶RbLam16的活性及穩(wěn)定性并深入了解其催化機理，后期可對RbLam16蛋白結(jié)構進行預測；在此基礎上通過半理性設計對其進行分子改造。此外，后期可在發(fā)酵罐水平通過高密度發(fā)酵方式進一步提高重組菌的產(chǎn)酶能力。在應用方面，可以選擇合適的固定化載體對RbLam16進行固定化，進一步開發(fā)昆布多糖酶的應用潛力。