張園，夏心如，蔣春艷，舒黎，吳畏，高彥，黃潔，冒韻東，劉嘉茵，馬翔

卵巢功能減退（diminished ovarian reserve，DOR）是指卵巢儲(chǔ)備功能下降，表現(xiàn)為產(chǎn)生卵母細(xì)胞的能力和質(zhì)量下降，伴有生育力低下，是體外受精/胞漿內(nèi)單精子注射（IVF/ICSI）助孕的重要指征之一。近年來(lái)，DOR在接受IVF/ICSI助孕的不孕人群中的比例不斷升高，接近10%～15%[1]。DOR患者表現(xiàn)為基礎(chǔ)卵泡刺激素（bFSH）水平升高、抗苗勒管激素（AMH）水平下降、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)（AFC）下降；在IVF/ICSI助孕過(guò)程中具有卵巢低反應(yīng)、臨床妊娠率下降、流產(chǎn)率增加等特點(diǎn)[2]。盡管促排卵方案不斷優(yōu)化、囊胚培養(yǎng)等技術(shù)不斷改進(jìn)，但DOR患者助孕后臨床結(jié)局仍不夠理想。眾所周知，年齡是DOR發(fā)生的重要因素，高齡DOR患者被更多地關(guān)注。然而非高齡DOR患者生育需求迫切，是接受助孕的一類重要人群，近年來(lái)也越來(lái)越被關(guān)注。非高齡DOR患者在IVF助孕過(guò)程中仍存在卵巢反應(yīng)低下、周期取消率高及流產(chǎn)率增加的不良結(jié)局[3]，但病因不明。因此，如何改善非高齡DOR患者的臨床結(jié)局，特別是提高胚胎種植率、降低流產(chǎn)率，是目前生殖醫(yī)學(xué)的討論熱點(diǎn)。近年來(lái)，免疫因素作為一種重要的DOR致病因素，已逐漸引起人們的重視[4-5]。有研究顯示DOR患者存在免疫異常，特別是自身免疫異常，表現(xiàn)為自身免疫抗體水平增加[6]。然而相關(guān)研究存在一定的局限性，例如未排除年齡對(duì)DOR的影響、DOR篩查標(biāo)準(zhǔn)不夠嚴(yán)格等。研究顯示，胚胎種植失敗可能和母體免疫紊亂相關(guān)[7]，這可能是胚胎種植失敗、流產(chǎn)率升高的原因，對(duì)自身免疫抗體的篩查有助于早期發(fā)現(xiàn)這類生育力下降患者的免疫失穩(wěn)狀態(tài)。而對(duì)自身免疫抗體的篩查存在篩查成本高、特異度和敏感度不高等特點(diǎn)，篩查開展難度大。目前，抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）、 抗 心 磷 脂 抗 體（anticardiolipin antibody，aCL） 和抗β2 糖蛋白1 抗體 （anti-β2-glycoprotein 1 antibody，aβ2GP1） 被認(rèn)為是生殖免疫的重要篩查指標(biāo)，聯(lián)合篩查成本可控，但與非高齡DOR關(guān)系尚不明確。因此，本研究通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)并分析非高齡DOR患者血清中ANA、aCL和aβ2GP1這3項(xiàng)指標(biāo)的陽(yáng)性率，綜合判斷其對(duì)篩查非高齡DOR患者免疫狀態(tài)的臨床應(yīng)用價(jià)值，為尋找非高齡DOR患者的免疫致病因素、改善非高齡DOR患者臨床結(jié)局提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年1月—2019年4月在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（我院）生殖醫(yī)學(xué)科接受IVF/ICSI助孕的127例非高齡DOR患者作為研究對(duì)象，即非高齡DOR組。所有患者均按照科室診療常規(guī)，經(jīng)過(guò)病史詢問(wèn)、全身及婦科檢查、超聲檢查、染色體核型分析以及內(nèi)分泌等系統(tǒng)性檢查后入組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≤35歲；②AMH≤1.1 ng/mL；③既往無(wú)自身免疫性疾病史；④3個(gè)月內(nèi)無(wú)激素治療史；⑤女方染色體核型正常。選取同期在我院生殖醫(yī)學(xué)科單純因男方因素（嚴(yán)重少弱精癥、梗阻性無(wú)精癥）行IVF/ICSI助孕的女性共82例作為對(duì)照組，排除女方患有自身免疫性疾病、染色體異常等。所有患者均簽署知情同意書，本研究已獲得我院倫理委員會(huì)許可。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)備和試劑 實(shí)驗(yàn)設(shè)備主要包括熒光顯微鏡和分光光度計(jì)。試劑主要包括ANA檢測(cè)試劑盒、aCL-IgG/IgM測(cè)定試劑盒和aβ2GP1檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自歐蒙醫(yī)學(xué)診斷（中國(guó)）有限公司。

1.2.2 檢測(cè)方法 2組研究對(duì)象均在IVF/ICSI進(jìn)周期當(dāng)月抽取外周血，采血后離心分離血清，分別檢測(cè)血清中ANA、aCL和aβ2GP1水平。

1.2.2.1 ANA檢測(cè) 應(yīng)用間接免疫熒光法進(jìn)行ANA譜的檢測(cè)，利用ANA IgG檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。用磷酸鹽緩沖液（PBS）1∶100稀釋待測(cè)樣本，并將稀釋后的生物樣本25 μL加入生物載片反應(yīng)區(qū)，室溫孵育30 min。PBS沖洗載片后，用20 μL異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的抗人二抗進(jìn)行第2次孵育，室溫孵育30 min清洗后封片。熒光顯微鏡下觀察熒光顆粒及模型，并利用稀釋倍數(shù)判斷陽(yáng)性的滴度值。

1.2.2.2 aCL-IgG/IgM和aβ2GP1檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)aCL和aβ2GP1。稀釋液按1∶201對(duì)血清進(jìn)行稀釋，再往預(yù)包被板中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和待測(cè)樣品，室溫孵育30 min，洗板3次。每孔中加入100 μL抗人IgG/IgM辣根過(guò)氧化物酶（HRP）結(jié)合物，室溫避光孵育30 min，洗板3次。每孔中加入100 μL色原/底物液，孵育15 min后，加入100 μL終止液終止反應(yīng)。于波長(zhǎng)450 nm處讀取OD值，用折線擬合方式計(jì)算各樣品濃度值。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：aCL-IgG≥20 U、aCL-IgM≥20 U，或aβ2GP1-IgG≥20 RU/mL定義為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。非正態(tài)分布的定量資料用中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。定性資料用例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 非高齡DOR組與對(duì)照組一般情況比較 2組患者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、基礎(chǔ)黃體生成激素（bLH）、基礎(chǔ)雌二醇（bE2）水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。而非高齡DOR組bFSH水平高于對(duì)照組，AMH水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 非高齡DOR組患者3項(xiàng)抗體的檢測(cè)結(jié)果 將ANA、aCL、aβ2GP1 3項(xiàng)抗體作為聯(lián)合篩查，統(tǒng)計(jì)2組患者3項(xiàng)抗體中至少1項(xiàng)抗體陽(yáng)性的陽(yáng)性率，非高齡DOR組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。2組患者血清中ANA陽(yáng)性率、aCL總陽(yáng)性率、aCL-IgG陽(yáng)性率和aCL-IgM陽(yáng)性率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。非高齡DOR組血清中aβ2GP1陽(yáng)性率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

DOR是指女性卵巢內(nèi)正常卵泡閉鎖過(guò)程加速或出生后卵子被不同機(jī)制破壞致使卵泡過(guò)早耗竭，剩余的卵母細(xì)胞數(shù)量較少或質(zhì)量較低，從而導(dǎo)致生殖能力衰減的一種病理癥狀[8]。DOR病因復(fù)雜，目前研究認(rèn)為主要包括年齡因素、遺傳因素、免疫因素、感染因素、醫(yī)源性因素等[9]，病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，非年齡因素相關(guān)的DOR患者尤其值得關(guān)注。

近年來(lái)，生殖免疫學(xué)的發(fā)展突飛猛進(jìn)。越來(lái)越多的研究顯示，生育力下降、胚胎丟失和反復(fù)種植失敗可能與母體自身免疫紊亂密切相關(guān)[10]，常常伴有血清中一種或多種自身抗體表達(dá)異常。通過(guò)對(duì)自身抗體的篩查，可以及時(shí)、有效地反映機(jī)體失穩(wěn)的免疫狀態(tài)。其中，ANA、aCL和aβ2GP1等自身免疫抗體被認(rèn)為和不孕不育癥、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、反復(fù)種植失敗以及一些妊娠期合并癥的發(fā)生和遠(yuǎn)期結(jié)局密切相關(guān)，可作為篩查指標(biāo)。既往研究顯示，不明原因不孕患者ANA、aCL陽(yáng)性率升高[11]，中重度子宮內(nèi)膜異位癥患者aβ2GP1陽(yáng)性率升高[12]，推薦在接受助孕的高危人群中進(jìn)行自身抗體的聯(lián)合篩查。

近年來(lái)越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注自身免疫相關(guān)DOR，其中早發(fā)性卵巢功能不全（POI）及卵巢早衰（POF）等可能存在交叉也可能處于不同發(fā)展階段的卵巢功能異常，均被證實(shí)與自身免疫異常存在相關(guān)性[4-5]，合并自身免疫性疾病的概率也高于正常人群[13-14]。研究顯示，約20%的POI患者合并至少一種自身免疫性疾病，最常見(jiàn)的是甲狀腺和腎上腺的免疫性疾病，然而病因不明[13]。10%～30%的POF患者合并其他自身免疫性疾病，包括自身免疫性甲狀腺炎、1型糖尿病、Addison病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）等[14]。Gleicher等[15]對(duì)38歲以下DOR患者（AMH＜1.5 ng/mL）進(jìn)行病因篩查，結(jié)果顯示37.8%的患者存在自身免疫異常。因此，對(duì)DOR患者進(jìn)行血清抗體特別是自身免疫抗體的篩查值得臨床關(guān)注。然而，目前關(guān)于非高齡DOR患者自身免疫異常的研究較少，缺乏非高齡DOR患者自身免疫狀態(tài)篩查的有效指標(biāo)。本研究將ANA、aCL、aβ2GP1 3項(xiàng)抗體作為聯(lián)合篩查，結(jié)果顯示24.41%的非高齡DOR患者至少存在1項(xiàng)自身免疫抗體陽(yáng)性，符合DOR的發(fā)展規(guī)律。提示在DOR疾病發(fā)展早期對(duì)患者進(jìn)行免疫病因篩查，可為非高齡DOR患者早期干預(yù)、改善后續(xù)助孕結(jié)局提供依據(jù)。

ANA是多種自身免疫性疾病的特征性抗體，是一組對(duì)細(xì)胞核內(nèi)的核酸、細(xì)胞核蛋白和核糖體蛋白作為靶抗原的自身抗體的總稱[16]。臨床中，ANA可應(yīng)用于SLE、混合性結(jié)締組織病、干燥綜合征等[17]自身免疫性疾病的篩查。除此之外，ANA還在生殖系統(tǒng)中發(fā)揮作用，被認(rèn)為與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和反復(fù)種植失敗等多種不良妊娠結(jié)局密切相關(guān)。研究顯示，超過(guò)一半的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者血清中ANA抗體陽(yáng)性[18-19]，不明原因不孕患者中ANA陽(yáng)性率約為14.8%[11]，約35.1%的反復(fù)種植失敗患者也存在ANA表達(dá)水平增加[20]。POF患者中ANA抗體的檢出率約為20%～40%[21]。Gleicher等[15]研究發(fā)現(xiàn)，約2.7%的38歲以下DOR患者ANA陽(yáng)性。本研究結(jié)果顯示，非高齡DOR患者ANA陽(yáng)性率為3.15%，略高于對(duì)照組（1.22%），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但本研究樣本量較少，而且僅選擇了ANA作為初步篩查，未進(jìn)行ANA譜的系統(tǒng)檢測(cè)，后續(xù)可以通過(guò)增加樣本量、必要時(shí)進(jìn)行ANA譜檢測(cè)進(jìn)一步篩查。

aCL是抗磷脂抗體的一種，也是抗磷脂抗體綜合征的標(biāo)志性抗體，其靶抗原是血小板和內(nèi)皮細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的心磷脂，常見(jiàn)于SLE及其他自身免疫性疾病。在生殖領(lǐng)域，aCL被認(rèn)為與妊娠丟失有關(guān)，推測(cè)可能和血清中aCL增加繼發(fā)性引起胎盤與蛻膜血管內(nèi)微小血栓形成有關(guān)[22]。隨著妊娠進(jìn)展，aCL陽(yáng)性患者胎盤功能異常會(huì)增加子癇前期的發(fā)生率，影響母嬰安全[23]。研究顯示，POF患者中aCL陽(yáng)性率為10%～20%。卵巢局部血栓形成增加，減少卵巢供血，干擾卵細(xì)胞的正常生長(zhǎng)發(fā)育，可能是DOR的原因之一[24]。國(guó)內(nèi)小樣本研究顯示，DOR患者抗卵巢抗體（16/178）及aCL陽(yáng)性率（15/178）較高，使用免疫抑制劑及阿司匹林可適當(dāng)恢復(fù)患者卵巢功能，但研究并未排除年齡對(duì)DOR的影響[25]。此外，國(guó)外研究顯示38歲以下DOR患者中約16.2%存在aCL陽(yáng)性[15]，但研究并未設(shè)置對(duì)照組。本研究非高齡DOR組aCL總陽(yáng)性率為8.66%，和對(duì)照組（6.10%）相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)aCL陽(yáng)性與DOR的早期發(fā)病關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)，但值得進(jìn)一步關(guān)注。

表1 2組患者一般情況比較 [M（P25，P75）]

表2 2組患者ANA、aCL和aβ2GP1抗體陽(yáng)性率比較 [例（%）]

aβ2GP1也是一類抗磷脂抗體，是一種重要的抗磷脂抗體結(jié)合輔因子，其靶抗原為β2糖蛋白1（β2GP1，一種磷脂結(jié)合蛋白）。aβ2GP1可與多種細(xì)胞表面受體結(jié)合，包括內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞的表面受體以及凝血因子，介導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、凝血功能異常等病理改變。因此，aβ2GP1可作為自身免疫性血栓的一種重要標(biāo)志物[26]，可作為區(qū)分自身免疫性疾病和感染性疾病的血清學(xué)證據(jù)之一。近年來(lái)研究顯示，aβ2GP1與IVF種植失敗和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等不良生殖結(jié)局有關(guān)[27]。不明原因不孕的患者中約有10%存在aβ2GP1陽(yáng)性[11]，16.3%的中重度子宮內(nèi)膜異位癥患者血清中aβ2GP1表達(dá)增加[12]。本研究結(jié)果顯示，非高齡DOR患者aβ2GP1的總陽(yáng)性率為15.75%，顯著高于對(duì)照組（6.10%）。推測(cè)aβ2GP1陽(yáng)性可能與DOR患者免疫失穩(wěn)密切相關(guān)，其相關(guān)機(jī)制值得后續(xù)研究深入探討。

研究表明，對(duì)自身免疫抗體陽(yáng)性的不孕患者進(jìn)行早期干預(yù)，有助于提高妊娠結(jié)局[28]。對(duì)ANA、aCL、aβ2GP1的陽(yáng)性患者，在開展IVF/ICSI助孕前進(jìn)行深入免疫病因追蹤，必要時(shí)給予免疫調(diào)節(jié)劑和抗凝治療，可顯著提高這些人群的胚胎種植率和臨床妊娠率[29]。是否可以對(duì)自身免疫抗體陽(yáng)性的非高齡DOR患者早期進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)治療，將有待于進(jìn)一步深入研究隨訪，以期更好地闡明自身抗體陽(yáng)性對(duì)非高齡DOR患者妊娠結(jié)局的影響，為非高齡DOR患者的臨床治療提供新的理論依據(jù)。

綜上所述，非高齡DOR患者血清中aβ2GP1陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組，部分反映了非高齡DOR患者自身免疫異常的狀態(tài)，推測(cè)可能是影響非高齡DOR患者后續(xù)IVF/ICSI助孕結(jié)局的重要因素之一。對(duì)非高齡DOR患者在IVF/ICSI助孕前推薦進(jìn)行血清ANA、aCL和aβ2GP1的聯(lián)合篩查，為揭示DOR免疫致病因素、改善DOR患者助孕結(jié)局提供臨床依據(jù)。