左亞奇 高志紅 龐 策 孫轉(zhuǎn)友 李 芳 甄 攀

1.河北北方學(xué)院，張家口，075000，中國(guó)

2.廣宗縣中醫(yī)醫(yī)院，邢臺(tái)，054600，中國(guó)

3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方學(xué)院，廊坊，065000，中國(guó)

桑屬植物分為35 個(gè)品種和10 個(gè)變種，我國(guó)發(fā)現(xiàn)的有15 個(gè)品種和4個(gè)變種［1］。桑屬植物的藥用價(jià)值很高，歷代本草及醫(yī)藥典籍對(duì)桑屬藥材都有記錄，常用于治療咳嗽、水腫、風(fēng)痹等癥。川桑（Morus notabilis Schneid）是桑屬植物中的一種，又名毛脈桑、圓葉桑，分布在我國(guó)四川和云南等地［2］。課題組前期研究證實(shí)［3］川桑中桑皮素（Mulberrin）含量較高，最佳提取溶劑為乙醇。桑皮素具有廣泛的生物活性，如降血糖［4-5］、降血脂［6］、降血壓［7］、抗腫瘤［8-9］、抗氧化［10］、抗炎［11］等。

本研究以桑皮素含量為指標(biāo)，利用4 因素3 水平L9（34）正交試驗(yàn)，分析乙醇濃度、提取時(shí)間、溶媒倍數(shù)（提取溶劑體積與藥材質(zhì)量之比）、提取次數(shù)對(duì)桑皮素提取效率的影響，探討川桑中桑皮素的最優(yōu)提取工藝。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Agilent 1 100 HPLC，美 國(guó)Agilent 公 司；YMCPack ODS-A 色譜柱，日本YMC 公司；HP HPLC 3D 化學(xué)工作站，UV 檢測(cè)器。

川桑枝：采集于云南省金平縣，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所馬林副研究員鑒定為川桑Morus notabilis Schneid。

桑皮素對(duì)照品：自制，從川桑中提取。乙醇，分析純；甲醇，色譜純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 桑皮素含量測(cè)定方法的建立

1.2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 桑皮素對(duì)照品的制備：川桑枝干燥，粉碎，過(guò)20 目篩，稱(chēng)取約2.0 kg，95%乙醇浸泡，提取、過(guò)濾、減壓濃縮等，得浸膏。浸膏經(jīng)硅膠、D101 大孔樹(shù)脂、C18 等柱色譜分離，最后經(jīng)色譜儀純化得到桑皮素純品。NMR 鑒定桑皮素結(jié)構(gòu)，HPLC 檢測(cè)純度≥98%。

精密稱(chēng)取桑皮素對(duì)照品適量，乙醇溶解，制備500 μg·mL-1的桑皮素對(duì)照品溶液。

色譜條件：Agilent 1 100 液相色譜儀，YMC-Pack ODS-A 色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：甲醇-水（80∶20）；檢測(cè)波長(zhǎng)268 nm；柱溫25 ℃；流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μL。桑皮素對(duì)照品色譜圖（Fig.1）。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立 利用倍比法對(duì)500 μg·mL-1的桑皮素對(duì)照品溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)玫讲煌瑵舛鹊膶?duì)照品溶液，依次進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，桑皮素濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，回歸方程為y=140.5x+632.9，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，線(xiàn)性范圍為3.906～250.0 μg·mL-1。

1.2.1.3 提取液的制備 川桑枝干燥，粉碎，過(guò)60 目篩，稱(chēng)取約2.0 g，精密稱(chēng)定。按照L9（34）正交試驗(yàn)表（Tab.1）進(jìn)行提取，提取前均以提取溶劑浸泡3 h，提取液定容為50.00 mL。

Fig.1 HPLC chromatogram of Mulberrin reference substance 1-Mulberrin

1.2.1.4 桑皮素穩(wěn)定性考察

1.2.1.4.1 放置時(shí)間對(duì)桑皮素穩(wěn)定性影響 桑皮素提取液在室溫下放置10 d，每天測(cè)定桑皮素含量，RSD 為3.3%，表明室溫下10 d 內(nèi)桑皮素穩(wěn)定性良好。

1.2.1.4.2 溫度對(duì)桑皮素穩(wěn)定性影響 提取液分別水浴加熱至24、30、40、50、60、70、80、96 ℃，并保持10 min，冷卻后分別測(cè)定桑皮素含量，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（relative standard deviation，RSD）為3.7%，表明小于100 ℃時(shí)，溫度對(duì)桑皮素穩(wěn)定性無(wú)顯著影響。

1.2.2 桑皮素提取工藝優(yōu)化

采用L9（34）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)研究桑皮素提取工藝，設(shè)置乙醇濃度、提取時(shí)間、溶媒倍數(shù)（提取溶劑體積與藥材質(zhì)量之比）、提取次數(shù)4 個(gè)因素，每個(gè)因素均設(shè)置3 個(gè)水平。平行測(cè)定3 次，以3 次測(cè)定的桑皮素總和計(jì)量。

1.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

取2 g 粉碎后的川桑，精密稱(chēng)定，按本文建立的最優(yōu)提取工藝進(jìn)行提取。

2 結(jié)果

2.1 桑皮素的計(jì)量測(cè)定

正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，川桑中桑皮素的最優(yōu)提取工藝為A3B3C3D1，即20 倍95%乙醇回流提取3 次，每次提取0.5 h，提取前用提取溶劑浸泡3 h。從極差R 分析，因素A 和C 即乙醇濃度和溶媒倍數(shù)對(duì)提取效率的影響較為敏感，因素B 即提取時(shí)間的影響不顯著。影響桑皮素提取率的順序?yàn)槿苊奖稊?shù)＞乙醇濃度＞提取次數(shù)＞提取時(shí)間。因素和水平（Tab.1），正交試驗(yàn)結(jié)果（Tab.2）。

2.2 桑皮素含量的測(cè)定

通過(guò)HPLC 法檢測(cè)桑皮素含量，結(jié)果顯示最優(yōu)條件下提取所得桑皮素含量為1.510 mg·g-1，（Tab.3）。川桑提取液色譜圖（Fig.2）。

Tab.1 Factor level table

Tab.2 Orthogonal test results of L9（34）

Tab.3 Content of Mulberrin

Fig.2 HPLC chromatogram of Morus notabilis extract 1-Mulberrin

3 討論

3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果顯示川桑中桑皮素最優(yōu)提取工藝為：20 倍95%乙醇回流提取3 次，每次提取0.5 h，提取前提取溶劑浸泡3.0 h。極差顯示，影響桑皮素提取效率的順序?yàn)槿苊奖稊?shù)＞乙醇濃度＞提取次數(shù)＞提取時(shí)間。

3.2 桑皮素具有廣泛的生物學(xué)活性，降血糖及抗腫瘤效果顯著。我們前期研究證實(shí)，桑皮素對(duì)人食管鱗癌ECA109 細(xì)胞和人前列腺癌Du145 細(xì)胞的增殖有較強(qiáng)的抑制作用。最優(yōu)條件下提取所得桑皮素含量為1.510 mg·g-1，本課題組前期測(cè)得［3］同一份川桑樣品中桑皮素含量為1.070 mg·g-1，表明優(yōu)化后的提取工藝確實(shí)提高了桑皮素的提取效率，有較高的實(shí)用價(jià)值。