史向輝 嚴婷婷 沈 潔 葉 俏

類風濕關節(jié)炎（RA）的發(fā)病機制尚不明確[1]。研究顯示，在疾病進展中，調節(jié)性T 細胞發(fā)揮重要作用，在免疫反應過程中，調節(jié)性B 細胞（Breg）具有重要作用，CD19+CD24hiCD38hi Breg 細胞的表達率與類風濕性疾病患者的活動度呈現(xiàn)顯著相關性，CD20+B 細胞、CD5+B 細胞在機體的免疫調節(jié)以及免疫耐受中發(fā)揮重要作用[2-3]。通過對CD19+CD24hi-CD38hi Breg 細胞、CD20+B 細胞、CD5+B 細胞表達率的分析，對于臨床治療方向的調整具有重要價值[4]。本研究探討RA 患者CD19+CD24hiCD38hi Breg 細胞、CD20+B 細胞、CD5+B 細胞的表達及其與疾病進展的關系，報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2016 年1 月—2019 年4 月浙江省嘉興市第二醫(yī)院診斷的RA 患者120 例為觀察組，其中男66 例，女54 例，年齡55～65 歲，病程（37.26±11.26）個月；依據(jù)美國風濕病學會確定的關節(jié)功能分類標準[5]，疾病嚴重程度分級：Ⅰ級患者67例，Ⅱ級患者53 例。另選取同期健康體檢者120 名為對照組，所有研究對象均簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過，符合《赫爾辛基宣言》倫理要求。

1.2 觀察組納入標準 （1）所有患者均符合美國風濕學會（ACR）[5]RA 診斷標準；（2）近3 個月內未使用糖皮質激素。

1.3 排除標準 （1）合并其他慢性疾病患者；（2）嚴重心臟、肝臟、腎臟疾病患者；（3）傳染性疾病患者；（4）孕婦或哺乳期患者。

2 研究方法

2.1 淋巴細胞的分離 所有研究對象空腹采集靜脈血4mL 置于Na2-EDTA 抗凝管中，將3mL Ficoll-Hypaque 淋巴細胞分離液與血液樣本充分混勻后，在4℃環(huán)境下對以上樣本進行離心，2000r/min 離心20min 后，樣本分為3 層面，上層和中層之間有白霧狀的帶狀平面，為單核細胞以及淋巴細胞。使用移液管抽取以上云霧層，置于另外一個潔凈離心管中，使用5 倍以上的hank 液體進行洗滌，混勻，在4℃環(huán)境下對以上樣本進行離心，1500r/min，離心半徑為20cm，離心15min 后，棄去上清液再次洗滌，再次棄去上清液，加入10%的小牛血清，重懸細胞，在4℃環(huán)境下進行保存。

2.2 CD19+CD24hiCD38hi Breg 細 胞、CD20+B 細胞、CD5+B 細胞檢測 使用流式細胞儀（貝克曼CytoFLEX 儀器，hank 液由上海羅氏提供）對上述樣本CD19+CD24hiCD38hi Breg 細胞、CD20+B 細胞、CD5+B 細胞進行檢測。分別對觀察組以及對照組研究對象CD19+CD24hiCD38hi Breg 細胞、CD20+B 細胞、CD5+B 細胞水平比較。分析患者的嚴重程度與CD19+CD24hiCD38hi Breg 細 胞、CD20+B 細 胞、CD5+B 細胞水平的相關性。

2.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（） 表示，采用獨立樣本t 檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。相關性分析采用Spearman 分析，以P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 兩組研究對象一般資料比較 兩組研究對象性別、年齡、體質指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組研究對象基線資料比較

3.2 兩組研究對象CD19+CD24hiCD38hi Breg 細胞、CD20+B 細胞、CD5+B 細胞水平比較 觀察組患者CD19+CD24hiCD38hi Breg 細胞、CD20+B 細胞比例顯著低于對照組，CD5+B 細胞比例顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組研究對象CD19+CD24hiCD38hi Breg 細胞、CD20+B 細胞、CD5+B 細胞水平比較（%，）

表2 兩組研究對象CD19+CD24hiCD38hi Breg 細胞、CD20+B 細胞、CD5+B 細胞水平比較（%，）

注：觀察組為類風濕關節(jié)炎患者；對照組為健康體檢者

3.3 不同嚴重程度RA 患者CD19+CD24hiCD38hi Breg 細胞、CD20+B 細胞、CD5+B 細胞水平比較 Ⅰ級RA 患者CD19+CD24hiCD38hi Breg 細胞、CD20+B細胞比例顯著高于Ⅱ級患者，CD5+B 細胞比例顯著低于Ⅱ級患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 不同嚴重程度RA 患者CD19+CD24hiCD38hi Breg細胞、CD20+B 細胞、CD5+B 細胞水平比較（%，）

表3 不同嚴重程度RA 患者CD19+CD24hiCD38hi Breg細胞、CD20+B 細胞、CD5+B 細胞水平比較（%，）

注：RA 為類風濕關節(jié)炎

3.4 相關性分析 RA 患者的疾病嚴重程度分級與CD19+CD24hiCD38hi Breg 細胞（r=-0.542，P=0.000）、CD20+B 細胞的（r=-0.459，P=0.000）比例呈負相關，與CD5+B 細胞（r=-0.380，P=0.000）比例現(xiàn)正相關。

4 討論

RA 是多以對稱性以及多關節(jié)慢性炎癥反應為主的全身性免疫疾病[6]，發(fā)病機制尚不明確。目前認為，RA 發(fā)病主要與機體免疫活性細胞及抗原提呈細胞的異常性活動相關[7]。在對免疫調節(jié)機制的分析中，B 淋巴細胞主要通過對白介素10 以及腫瘤壞死因子的抑制性表達，進而對機體免疫平衡以及免疫耐受進行調節(jié)[8]。對病程在5 年以下RA 患者的研究顯示，通過激素治療，患者CD19+CD24hiCD38hi Breg 細胞水平顯著升高，且與疾病活動度以及抗環(huán)胍氨酸抗體呈現(xiàn)負相關[9]。有研究指出，CD19+CD24 hiCD38hi Breg 細胞是重要的白介素10 前體細胞[10]；吳桂英和李鴻斌[11]研究顯示，健康組CD19+CD24hi CD38hi Breg 細胞水平顯著高于RA 組。本研究結果顯示，觀察組CD19+CD24hiCD38hi Breg 細胞比例顯著低于對照組（P＜0.05），與上述研究一致。

本研究顯示，觀察組患者CD20+B 細胞比例顯著低于對照組，且隨著患者疾病進展，CD20+B 細胞水平顯著下降（P＜0.05）。CD20 是B 細胞的特異性抗原，外周血中CD20 表達水平在一定程度上反映了B細胞的水平，當B 細胞分化為漿細胞后，患者B 細胞的CD20 表達基本消失，在CD20 消失過程中，大量的炎性介質分泌，造成臨床癥狀的產生[12]。同時，CD20還可以在一定程度上通過跨膜鈣離子通道對B 細胞信號的轉導進行活化，進而對機體免疫功能進行調節(jié)[13]。王鑫[14]研究顯示，CD20+B 細胞水平的下降以及凋亡，參與了RA 患者的疾病進展，與本研究相互印證。本研究顯示，觀察組患者CD5+B 細胞比例顯著高于對照組，Ⅰ級RA 患者的CD5+B 細胞比例顯著低于Ⅱ級患者（P＜0.05）。艾汐汐[15]研究顯示，自身免疫性疾病患者的CD5+B 細胞比例顯著升高，與本研究一致。認為可通過患者淋巴細胞水平對其免疫狀態(tài)進行分析，對患者疾病進展進行預測。本研究相關性分析顯示，RA 患者的疾病嚴重程度分級與CD19+CD24hiCD38hi Breg 細胞（r=-0.542）、CD20+B 細胞的（r=-0.459）比例呈現(xiàn)負相關，與CD5+B 細胞（r=-0.380）比例呈現(xiàn)正相關。

綜上所述，CD19+CD24hiCD38hi Breg 細胞、CD20+B 細胞、CD5+B 細胞表達情況與類風濕性關節(jié)炎患者及其基本分級相關性顯著，可作為患者疾病進展的預測指標。