王安鴻 史尉利 余慧鐳 傅欣 段小寧 胡曉青 郭秦?zé)?/p>

北京大學(xué)第三醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科，北京大學(xué)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所，運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)關(guān)節(jié)傷病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京100191）

關(guān)節(jié)軟骨是關(guān)節(jié)重要的組成部分，能承受和平衡應(yīng)力負(fù)荷，在關(guān)節(jié)活動(dòng)中起著重要作用，關(guān)節(jié)軟骨損傷后會(huì)造成疼痛等癥狀，影響關(guān)節(jié)活動(dòng)，造成功能障礙，若得不到良好的治療，會(huì)逐漸進(jìn)展為骨關(guān)節(jié)炎，甚至導(dǎo)致殘疾[1]。但軟骨缺乏血管、神經(jīng)、淋巴等組織，無法有效地進(jìn)行自我修復(fù)，臨床上的傳統(tǒng)手術(shù)如微骨折術(shù)等又無法再生關(guān)節(jié)軟骨[2，3]。自體軟骨細(xì)胞移植需二次手術(shù)，操作復(fù)雜、耗時(shí)長，易造成移植物的增生肥大，且軟骨細(xì)胞體外擴(kuò)增時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)去分化和軟骨細(xì)胞的表型無法維持穩(wěn)定等問題[4-6]。因此，國內(nèi)外開展了眾多以多向潛能間充質(zhì)干細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程技術(shù)用于修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷，應(yīng)用較多的主要有骨髓、滑膜和脂肪起源的干細(xì)胞[7]，但現(xiàn)有的研究表明這些干細(xì)胞修復(fù)效果不佳[8-10]。因此，尋找更為有效的種子細(xì)胞是目前組織工程的一項(xiàng)重要任務(wù)。Reinholz 等將兔脛骨近端內(nèi)側(cè)骨膜經(jīng)轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth fac?tor，TGF-β）和胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）處理后體外培養(yǎng)，結(jié)果顯示骨膜生發(fā)層的厚度和細(xì)胞數(shù)都顯著增加，成軟骨的能力也增加了近12 倍[11]。在他們的后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將兔骨膜經(jīng)TGF-β預(yù)處理后，再將骨膜移植物移植到骨軟骨缺損區(qū)，能促進(jìn)缺損區(qū)的組織更新修復(fù)[12]。而在我們的前期研究中，在脛骨近端內(nèi)側(cè)骨膜下注射TGF-β后，骨膜的生發(fā)層可出現(xiàn)明顯的增殖反應(yīng)[13]。結(jié)合文獻(xiàn)和我們的前期工作，推測(cè)動(dòng)物骨膜的生發(fā)層可能存在骨膜祖細(xì)胞或骨膜起源的干細(xì)胞。鑒于此，本研究旨在從哺乳動(dòng)物分離、鑒定骨膜干細(xì)胞，驗(yàn)證動(dòng)物骨膜中存在骨膜起源的干細(xì)胞，探索為軟骨損傷修復(fù)的組織工程技術(shù)提供細(xì)胞來源。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

貴州小香豬3 只，1月半（離乳，未成年），體重約15 kg。本實(shí)驗(yàn)已通過北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理審查委員會(huì)審批。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

DMEM培養(yǎng)基（Thermo Fisher，31600034）、FITC標(biāo)記的鼠抗豬單克隆抗體CD90（BD Pharmingen，555595）、PE 標(biāo)記的鼠抗豬的單克隆抗體CD105（EX?BIO，1P-453-T100）、FITC標(biāo)記的鼠抗豬的單克隆抗體CD45（INVITROGEN，MA5-28383）、APC標(biāo)記的鼠抗豬的單克隆抗體CD44（EXBIO，1A-341-T100）、FITC 標(biāo)記的鼠抗豬的單克隆抗體CD14（INVITROGEN，MA5-28286）、Ⅰ型膠原酶、Ⅱ型膠原酶、青霉素、鏈霉素、PBS、胎牛血清、成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒（Cyagen，HUXMA-90021）、成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒（Cya?gen，HUXMA-90041）、成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒（Cyagen，HUXMA-90031）、離心機(jī)、流式細(xì)胞儀（Flow Cytometer，F(xiàn)CM）、倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（LEICA）等。

1.3 骨膜來源的細(xì)胞分離培養(yǎng)

分離：取豬髂骨近端內(nèi)側(cè)骨膜，加入含I00 UI/ml青霉素G，100 UI/ml 鏈霉素的PBS 中，在濃度為500 UI/ml抗生素（雙抗）浸泡10 min，PBS沖洗3遍，眼科剪剪碎成勻漿。消化：準(zhǔn)備含10%胎牛血清（FBS）和上述濃度抗生素的DMEM 培養(yǎng)基，加入0.125%Ⅰ型膠原酶+0.125%Ⅱ型膠原酶，37℃消化4.5 h 左右。6000 r離心，4 min，懸浮置于培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)：將上述培養(yǎng)皿放置于標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)條件中（95%的潮濕空氣，5%的CO2）培養(yǎng)3 天，3 天后觀察細(xì)胞形態(tài)，見散在的具有干細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞，每周換液2 次。2 周后觀察，細(xì)胞增殖迅速。

1.4 流式細(xì)胞學(xué)表面標(biāo)志鑒定

細(xì)胞培養(yǎng)至P3 代，4℃，PBS 清洗3 遍，調(diào)整密度約為2.5×106/mL，加入APC、FITC 或PE 標(biāo)記的抗CD90，CD44，CD105，CD14，CD45的單克隆抗體4 μL，避光孵育30～45 min，流式細(xì)胞學(xué)分析。

1.5 三系分化

1.5.1 成骨分化

當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，用0.25%Tryp?sin-0.04%EDTA進(jìn)行消化。將消化下來的細(xì)胞按照2×104 cells/cm2的細(xì)胞密度接種在事先包被0.1%明膠的六孔板中，每孔加入2 mL 完全培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%時(shí)，小心地將孔內(nèi)完全培養(yǎng)基吸走，向六孔板中加入2 mL 干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基。每隔3天換用新鮮的干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基（使用前需預(yù)熱至37℃）誘導(dǎo)2～4周后，視細(xì)胞的形態(tài)變化及生長情況，用茜素紅進(jìn)行染色。成骨誘導(dǎo)分化結(jié)束后，吸走六孔板中的成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基，用1×PBS 沖洗1～2 次。每孔加入2 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min。吸走中性甲醛溶液，用1×PBS 沖洗2次。每孔中加入1 mL 茜素紅染液染3～5 min。吸走茜素紅染液，用1×PBS 沖洗2～3 次。將培養(yǎng)板置于顯微鏡下觀察成骨染色效果。

1.5.2 成軟骨分化

進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)之前，需要對(duì)常規(guī)消化后的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。將3～4×105個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，250 g離心4 min。吸去上清。加入0.5 mL預(yù)混液，重懸上一步離心所得沉淀，以清洗細(xì)胞，室溫下150 g 離心5 min。重復(fù)步驟3，再次清洗細(xì)胞。將上一步所得沉淀用0.5 mL 干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基重懸。室溫下150 g 離心5 min。擰松離心管蓋以便于氣體交換，將其放置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。成軟骨誘導(dǎo)分化結(jié)束后，吸走六孔板中的成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基，用1×PBS 沖洗1～2次。每孔加入2 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min。吸走中性甲醛溶液，用1×PBS 沖洗2 次。每孔中加入1 mL阿利辛藍(lán)染液染3～5 min。吸走阿利辛藍(lán)染液，用1×PBS沖洗2～3次。將培養(yǎng)板置于顯微鏡下觀察成軟骨染色效果。

1.5.3 成脂分化

當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，用0.25%Tryp?sin-0.04%EDTA 進(jìn)行消化。消化下來的細(xì)胞按照2×104 cells/cm2的細(xì)胞密度接種在六孔板中，每孔加入2 mL 完全培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔3 天換液，直到細(xì)胞融合度達(dá)到100%或者過融合。小心地將間質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基吸走，向六孔板中加入2 mL干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A液。誘導(dǎo)3天后，吸走六孔板中的A液，加入2 mL干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B液。24 h后，吸走B液，換回A 液進(jìn)行誘導(dǎo)。 A 液和B 液交替作用3～5 次后（12～20天），繼續(xù)用B 液維持培養(yǎng)4～7天直到脂滴變得足夠大、圓。B液維持培養(yǎng)期間，每隔2～3天需要換用新鮮的B 液。成脂誘導(dǎo)分化結(jié)束后，吸走六孔板中的干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，用1×PBS 沖洗1～2次。每孔加入2 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min。吸走中性甲醛溶液，用1×PBS 沖洗2 次。每孔中加入1 mL 油紅O 染料工作液染色30 min。吸走油紅O 染液，用1×PBS 沖洗2～3 次。將培養(yǎng)板置于顯微鏡下觀察成脂染色效果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

從骨膜分離的細(xì)胞體外培養(yǎng)約3 周后，在倒差顯微鏡下觀察，可見大量細(xì)胞，細(xì)胞胞體較大，細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則三角形生長，胞質(zhì)向外伸出長短不同的突起，排列整齊。見圖1。

圖1 骨膜分離的細(xì)胞體外培養(yǎng)3周的細(xì)胞形態(tài)（×10）

2.2 流式細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果

本研究選用CD44、CD90、CD105、CD14 和CD45 進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示，從骨膜分離的細(xì)胞表達(dá)CD44、CD90 和CD105，而CD14 和CD45 呈陰性表達(dá)。見圖2。這表明從骨膜分離的細(xì)胞能表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞特異的表面抗原。

圖2 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.3 三系分化

骨膜分離的細(xì)胞經(jīng)成骨、成軟骨、成脂誘導(dǎo)試劑盒誘導(dǎo)分化2 周后，分別經(jīng)茜素紅、阿利辛藍(lán)和油紅O 染色。經(jīng)茜素紅染色后，鈣化的細(xì)胞外基質(zhì)呈紅色（圖3A），證明其向成骨分化；成軟骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)蛋白多糖沉積，可見大量被阿利辛藍(lán)染為藍(lán)色的細(xì)胞（圖3B）；而油紅O 將脂滴或脂肪空泡染為紅色，表明其向脂肪組織分化（圖3C）。結(jié)果顯示骨膜分離的細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，可向三系分化，即成骨、成軟骨和成脂肪分化。

圖3 三系分化結(jié)果

3 討論

為修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，研究者開展了大量的研究工作，其中比較有代表性的是自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)和組織工程技術(shù)。自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)及其迭代技術(shù)是從關(guān)節(jié)的非負(fù)重區(qū)獲取軟骨組織、體外分離軟骨細(xì)胞，經(jīng)3～8 周的擴(kuò)增，再通過二次手術(shù)將擴(kuò)增的軟骨細(xì)胞植入軟骨缺損區(qū)，覆蓋以骨膜移植物或Ⅰ/Ⅲ型膠原膜。自體軟骨細(xì)胞移植雖可產(chǎn)生透明軟骨樣的修復(fù)，但移植物的增生肥大是限制其應(yīng)用的最大挑戰(zhàn)。Bartlett 等[14]利用基質(zhì)誘導(dǎo)的自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)修復(fù)膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)側(cè)髁和髕骨骨軟骨損傷，在術(shù)后6月接受關(guān)節(jié)鏡評(píng)估的4位患者中，有1位發(fā)生了移植物的肥大，而需進(jìn)一步刮除。他們進(jìn)一步比較了自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)和基質(zhì)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞移植術(shù)的效果，發(fā)現(xiàn)術(shù)后1年自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)（autologous chondrocyteimplantation，ACI）的移植物肥大率為9%（4/44），而基質(zhì)誘導(dǎo)的自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)（matix -autologouschondrocyte implantation，MACI）的移植物肥大率為6%（3/47），并且每組的再手術(shù)率都達(dá)9%[15]。Gomoll 等[16]在一項(xiàng)隊(duì)列研究中對(duì)比了骨膜移植的ACI和基質(zhì)膜移植的ACI的術(shù)后移植物肥大發(fā)生率，在術(shù)后1年通過移植物位置的疼痛癥狀和核磁共振檢查，發(fā)現(xiàn)25.7%的用骨膜作移植物的ACI 患者因移植物肥大而需再手術(shù)，而以基質(zhì)膜覆蓋的ACI 患者5%因移植物肥大而需再手術(shù)。這表明移植物的增生肥大仍然是ACI類技術(shù)的主要問題。

利用組織工程技術(shù)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，通過體外培養(yǎng)、擴(kuò)增種子細(xì)胞，并將擴(kuò)增的種子細(xì)胞植于具有良好生物組織相容性和降解性的支架材料中，然后植入軟骨缺損的部位，在一定的調(diào)控狀態(tài)下完成關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)和重建。組織工程中目前最常用的種子細(xì)胞是骨髓干細(xì)胞，研究表明[17]將骨髓干細(xì)胞移植到軟骨缺損區(qū)后，可產(chǎn)生透明軟骨樣的組織；但也有研究者將骨髓干細(xì)胞移植于裸鼠皮下后，產(chǎn)生了軟骨內(nèi)鈣化[8]。并且，隨著體外的擴(kuò)增傳代，骨髓干細(xì)胞的成軟骨分化潛能會(huì)逐漸降低，而鈣化（成骨分化）增加，且獲取這些細(xì)胞會(huì)造成患者的疼痛和供區(qū)并發(fā)癥[7]。這表明骨髓干細(xì)胞移植可能會(huì)造成移植區(qū)鈣化等問題。關(guān)節(jié)滑膜起源的干細(xì)胞獲取方便，體外擴(kuò)增速度快，體外成軟骨分化可較骨髓干細(xì)胞產(chǎn)生更多軟骨細(xì)胞[18]，但將其移植到體內(nèi)分化時(shí)，其膠原含量會(huì)逐漸下降[8]，不利于軟骨修復(fù)。骨膜干細(xì)胞體外擴(kuò)增速度較快，具有更好的體外成軟骨分化的能力[19，20]，研究者將骨膜干細(xì)胞連續(xù)三代移植于小鼠脂肪墊后，骨膜干細(xì)胞仍能保持自我更新的潛能[21]。Wakitani 等[17]將骨髓干細(xì)胞和骨膜干細(xì)胞分別移植于兔股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨缺損模型后，發(fā)現(xiàn)缺損區(qū)均可產(chǎn)生透明軟骨樣的修復(fù)，而骨膜干細(xì)胞修復(fù)的軟骨表面更加規(guī)整，與周圍正常的關(guān)節(jié)軟骨整合更好。這表明相較于其他組織來源的干細(xì)胞，骨膜干細(xì)胞具有更穩(wěn)定、更持久的軟骨分化潛能。

骨膜在關(guān)節(jié)置換術(shù)中可能作為廢物而被丟棄，但它可能是自體干細(xì)胞的重要來源[22]。在本次研究中，從骨膜分離的細(xì)胞在P3 代時(shí)鏡下觀察呈現(xiàn)長梭形或纖維狀，這與文獻(xiàn)報(bào)道骨膜分離的細(xì)胞形態(tài)相似[22，23]。表面抗原可用來鑒定骨膜來源的前體細(xì)胞，其中CD105 是TGF-β受體的重要組分，在成軟骨分化中具有重要作用，Lim等研究者分離、體外培養(yǎng)人PDPCs時(shí)，CD105 表型能保持至P15[24]。CD90 和CD44 也是間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定常用的表面標(biāo)志，能在間充質(zhì)干細(xì)胞和骨膜來源的前體細(xì)胞中高表達(dá)[25-27]。CD45 和CD14 是造血細(xì)胞系的表面標(biāo)志，不會(huì)在間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)[23，25，28]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示從骨膜分離的細(xì)胞能表達(dá)CD44、CD90 和CD105，而CD14 和CD45 表面標(biāo)記呈陰性表達(dá)；這說明從骨膜分離的細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞的表型特征。

能向骨、軟骨、脂肪分化是鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)[7，29]。Lim等研究者的實(shí)驗(yàn)證明從人骨膜分離的細(xì)胞在體外培養(yǎng)至P15 時(shí)仍能保持成軟骨的能力[24]。Yoon等的研究結(jié)果也表明人骨膜分離的細(xì)胞可向骨、軟骨和脂肪進(jìn)行分化[30]。Jaquiery等比較了人下頜骨骨膜來源的細(xì)胞和骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)骨膜來源的細(xì)胞成骨能力不如骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞[31]。而Wakitani 等的研究表明兔骨膜來源的細(xì)胞成軟骨的能力較骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞強(qiáng)[17]。Choi 等在誘導(dǎo)人骨膜來源的細(xì)胞成脂分化時(shí)，發(fā)現(xiàn)形成的脂肪空泡小且多，都在核的周圍，且空泡隨著成脂分化的過程而不斷增大[27]。在本次實(shí)驗(yàn)中，從骨膜分離的細(xì)胞能向骨、軟骨和脂肪進(jìn)行分化。我們觀察到，從骨膜分離的細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)分化2周后，經(jīng)茜素紅染色，在鏡下可見典型紅染的鈣化結(jié)節(jié)；經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)分化14 天后，可見大量藍(lán)染的細(xì)胞；而在成脂誘導(dǎo)分化14 天左右，可見部分紅染的脂滴，且隨成脂誘導(dǎo)分化的時(shí)間延長，脂滴并無明顯增加。這可能表明成骨分化和成軟骨分化的染色較成脂分化更強(qiáng)。我們推測(cè)可能骨膜分離的細(xì)胞更傾向于向骨和軟骨細(xì)胞系分化，可能有更好的成骨和成軟骨分化的能力，而成脂分化的能力較差；但這尚需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

從骨膜分離的細(xì)胞能表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞特異性的表面標(biāo)志，還能誘導(dǎo)向成骨、成軟骨和成脂分化。因此，本研究從小型豬骨膜分離的細(xì)胞可被認(rèn)為是間充質(zhì)干細(xì)胞。

4 結(jié)論

本研究成功分離并鑒定了小型豬的骨膜來源的干細(xì)胞，為軟骨缺損修復(fù)的組織工程技術(shù)提供了種子細(xì)胞來源。