董晨帆 吳海燕 李清云 顧海峰 譚志軍

櫛孔扇貝對(duì)氮雜螺環(huán)酸毒素代謝解毒的生理應(yīng)激響應(yīng)*

董晨帆1, 2吳海燕2李清云2顧海峰3譚志軍2①

(1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海 201306; 2. 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071; 3. 自然資源部第三海洋研究所 廈門 361005)

將櫛孔扇貝()暴露于分離自我國(guó)近海的一株氮雜螺環(huán)酸毒素(azaspiracids, AZAs)產(chǎn)毒藻——腹孔環(huán)胺藻(, AZDY06株, 主產(chǎn)AZA2), 研究了櫛孔扇貝對(duì)AZAs的代謝解毒效應(yīng)以及代謝過(guò)程中血細(xì)胞數(shù)量、抗氧化酶活性及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化等生理應(yīng)急響應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 櫛孔扇貝對(duì)AZDY06所產(chǎn)的AZA2具有一定的代謝解毒能力, 可將AZA2轉(zhuǎn)化成AZA6、AZA12、AZA19和AZA23等4種極性較強(qiáng)且毒性較低的代謝產(chǎn)物。代謝解毒過(guò)程中, 櫛孔扇貝血細(xì)胞數(shù)量、關(guān)鍵抗氧化酶活性及靶器官細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)一定的應(yīng)激效應(yīng), 且總體表現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。櫛孔扇貝血細(xì)胞數(shù)量對(duì)AZAs表現(xiàn)出較強(qiáng)的應(yīng)激反應(yīng), 且隨實(shí)驗(yàn)過(guò)程出現(xiàn)較大波動(dòng), 最高可達(dá)對(duì)照組的2—3倍; 抗氧化系統(tǒng)酶如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化物酶(POD)和酸性磷酸酶(ACP)活性也出現(xiàn)不同程度的變化: GSH-Px與POD在整個(gè)蓄積代謝過(guò)程中均表現(xiàn)出持續(xù)激活狀態(tài), 且血液中這兩種酶活性最高, 可達(dá)內(nèi)臟和鰓中的20倍以上; SOD活性與扇貝中AZAs含量有一定關(guān)系, AZAs含量為74.2—168.2μg AZA1 eq/kg時(shí)為誘導(dǎo)狀態(tài), 過(guò)高或過(guò)低劑量均表現(xiàn)為抑制效果; 而ACP對(duì)AZAs的應(yīng)激表現(xiàn)也十分敏感, 但代謝過(guò)程中大部分時(shí)間為被持續(xù)抑制狀態(tài)。此外, AZAs還導(dǎo)致櫛孔扇貝內(nèi)臟和鰓細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)空泡化、核固縮等病理性變化; 實(shí)驗(yàn)后期, 低暴露組細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)一定的自我修復(fù)現(xiàn)象, 而高暴露組則無(wú)此現(xiàn)象。本研究可為進(jìn)一步深入探索AZAs的解毒機(jī)制, 對(duì)其進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)并制定限量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

櫛孔扇貝; 氮雜螺環(huán)酸毒素(AZAs); 代謝解毒; 生理應(yīng)激

氮雜螺環(huán)酸毒素(Azaspiracid, AZAs)是1995年在歐洲發(fā)現(xiàn)的一類具有獨(dú)特螺環(huán)結(jié)構(gòu)的含氮聚醚類毒素(McMahon, 1995), 由甲藻()類腹孔環(huán)胺藻屬產(chǎn)生(Tillmann, 2009)。研究發(fā)現(xiàn), AZAs極易在海洋貝類中蓄積, 且會(huì)導(dǎo)致消費(fèi)者出現(xiàn)嘔吐、腹瀉等不良癥狀, 其與腹瀉性貝類毒素誘發(fā)的癥狀相似, 但毒性更強(qiáng)(James, 2002)。因此, 歐盟針對(duì)AZAs建立了160.0μg AZA1 eq/kg的限量標(biāo)準(zhǔn)并被多個(gè)國(guó)家采用(McCarron, 2009), 而我國(guó)還未設(shè)立該毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)。但是, 我國(guó)沿海地區(qū)已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)20多種腹孔環(huán)胺藻, 且超過(guò)86%的藻株可產(chǎn)AZAs, 分布范圍基本覆蓋我國(guó)四大近海海域(Gu et, 2013; Krock, 2014)。近年調(diào)查發(fā)現(xiàn), 我國(guó)廣州及大連等地采集的貝類中已檢測(cè)到AZAs殘留, 其中尤以北黃海和渤海區(qū)域主產(chǎn)的櫛孔扇貝中AZAs檢出情況最為普遍, 且部分樣品中AZAs含量超過(guò)歐盟限量, 表明AZAs已成為影響我國(guó)櫛孔扇貝等海洋貝類安全的新風(fēng)險(xiǎn)因子。

AZAs進(jìn)入到貝體后, 通過(guò)分布、代謝及消除作用, 形成終端代謝產(chǎn)物并決定其安全風(fēng)險(xiǎn)大小(Jauffrais, 2013)。而作為一個(gè)外源毒素, AZAs在貝類中的代謝不僅對(duì)宿主直接產(chǎn)生危害, 而且還可以誘導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧自由基, 從而對(duì)宿主貝類造成氧化脅迫毒性(Ji, 2018)。研究發(fā)現(xiàn), 為了最大化消除AZAs代謝過(guò)程中對(duì)自身的危害, 宿主貝類除了通過(guò)醛酸化、谷胱甘肽等途徑加速消除AZAs殘留水平, 還會(huì)加速清除過(guò)量活性氧自由基以盡快恢復(fù)體內(nèi)氧化還原態(tài)勢(shì)。在自由基清除方面, 貝類主要依賴其先天免疫系統(tǒng), 主要包括細(xì)胞吞噬與凋亡和抗氧化系統(tǒng)應(yīng)激。其中血細(xì)胞主要發(fā)揮吞噬作用, 在消除外源危害的同時(shí)也會(huì)誘導(dǎo)新自由基的產(chǎn)生(Canesi, 2002; Ellis, 2011)。隨后, 貝類進(jìn)入第二階段的抗氧化作用, 主要通過(guò)激活抗氧化系統(tǒng)酶活以清除自由基。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn), AZAs可誘導(dǎo)扇貝和貽貝中的SOD活性(Ji, 2018), 但該毒素對(duì)其免疫系統(tǒng)的抗氧化作用還未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道, 限制了對(duì)于AZAs在貝類中代謝誘導(dǎo)的氧化脅迫毒性機(jī)制必要的科學(xué)認(rèn)知。

因此, 本實(shí)驗(yàn)以分離自我國(guó)南海的一株產(chǎn)AZAs的腹孔環(huán)胺藻屬(, AZDY06株)為研究對(duì)象(Gu, 2013), 以目前我國(guó)AZAs殘留嚴(yán)重的櫛孔扇貝()為受試動(dòng)物, 采用實(shí)驗(yàn)室暴露的方式, 研究了AZAs在櫛孔扇貝代謝過(guò)程中, 櫛孔扇貝血細(xì)胞數(shù)量及關(guān)鍵酶抗氧化活性的變化, 并通過(guò)對(duì)這一過(guò)程中櫛孔扇貝靶組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化, 解析櫛孔扇貝對(duì)AZAs氧化脅迫的應(yīng)激效應(yīng)。期望通過(guò)該研究, 科學(xué)評(píng)價(jià)AZAs對(duì)櫛孔扇貝產(chǎn)生的次生毒害效應(yīng)及其應(yīng)激機(jī)理, 為下一步建立生態(tài)和食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

自然資源部第三海洋研究所提供實(shí)驗(yàn)所需AZDY06株產(chǎn)毒藻,以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)得該株產(chǎn)毒藻主產(chǎn)AZA2, 檢出限10μg/kg (/=3)。實(shí)驗(yàn)室以f/2培養(yǎng)液, 溫度(20±1)°C, 光照6000lx, 光暗比12h︰12h的條件進(jìn)行單種培養(yǎng)(吳海燕等, 2017)。并以同樣條件培養(yǎng)餌料藻三角褐指藻()。

以經(jīng)測(cè)定未受AZAs污染的、產(chǎn)自青島市膠南靈山灣養(yǎng)殖海域的2齡櫛孔扇貝為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物, 其平均貝肉濕重為(13.9±1.1)g, 殼長(zhǎng)(66.5±0.8)mm, 殼寬(59.3±1.1)mm, 殼高(18.9±1.0)mm。以(16±1)°C水溫, 不間斷充氣暫養(yǎng)兩天, 不投喂餌料藻, 之后用于實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)所需酶活試劑盒均購(gòu)買于南京建成生物工程公司。實(shí)驗(yàn)用NaH2PO4·H2O、EDTA、冰乙酸、NaCl、KH2PO4、KCl、Na2HPO4·2H2O和Na2HPO4等試劑均購(gòu)買于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司, 均為優(yōu)級(jí)純。實(shí)驗(yàn)用主要儀器為Q-Exactive四級(jí)桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀、日本島津公司的紫外可見(jiàn)分光光度計(jì), 型號(hào)UV2550。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 櫛孔扇貝暴露實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)選取共240只櫛孔扇貝平均分為4組, 放置在各盛有30L海水的8個(gè)養(yǎng)殖容器中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)持續(xù)30天, 主要分為兩個(gè)階段, 包括蓄積階段6天, 代謝階段24天。實(shí)驗(yàn)均采用等生物量的方式進(jìn)行, 其中對(duì)照組全過(guò)程投喂餌料藻, 實(shí)驗(yàn)組暴露階段投喂方式分別為:

(1) 低暴露組: 產(chǎn)毒藻AZDY06密度為1.0× 107cells/(ind.·d), 并以餌料藻補(bǔ)足生物量;

(2) 中暴露組: 產(chǎn)毒藻AZDY06密度為2.0× 107cells/(ind.·d), 并以餌料藻補(bǔ)足生物量;

(3) 高暴露組: 產(chǎn)毒藻AZDY06密度為4.0× 107cells/(ind.·d), 并以餌料藻補(bǔ)足生物量。

在投喂AZDY06后12h采樣鏡檢以確認(rèn)藻細(xì)胞是否全部被攝食。暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 全部投喂等生物量小球藻直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。分別在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的0.5、1、3、5、6、7、10、14、18、22、26、30d分別采樣。每次隨機(jī)取4只貝, 清除其污泥和寄生物, 并測(cè)量其貝肉濕重與殼長(zhǎng)、殼寬、殼高, 現(xiàn)場(chǎng)取淋巴血細(xì)胞制備血細(xì)胞樣品, 并將其內(nèi)臟團(tuán)、鰓和外套膜組織分離均質(zhì),-80°C凍存。

1.2.2 血細(xì)胞樣品的制備 參考文獻(xiàn)(李清云, 2017)用內(nèi)含抗凝劑(0.02mol/L EDTA, 0.14mol/L NaCl, 3mmol/L KCl, 8mmol/L Na2HPO4, 1.5mmol/L KH2PO4, pH=7.4)的無(wú)菌注射器從扇貝包心團(tuán)中按體積比1︰1抽血, 每只扇貝抽取0.1—0.2mL血淋巴。混合液均分兩份, 一份于4°C、750r/min、離心10min, 分裝(1mL/管),-80°C凍存; 一份按血淋巴︰抗凝劑=1︰10的比例加入抗凝劑重懸并充分混勻, 以血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù), 繪制4組櫛孔扇貝血細(xì)胞數(shù)量(Total Hemocyte Counts, THC)變化曲線。

1.2.3 抗氧化系統(tǒng)酶活性的測(cè)定 各組織分別稱取1g, 以質(zhì)量(g)︰體積(mL)=1︰9加入任氏生理鹽水, 在冰水浴下勻漿得10%組織勻漿液, 在4°C條件下離心勻漿液(2500r/min, 10min), 取上清液按照試劑盒說(shuō)明書(南京建成生物工程研究所)進(jìn)行操作, 測(cè)定櫛孔扇貝血清和內(nèi)臟團(tuán)、鰓組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化物酶(POD)、酸性磷酸酶(ACP)活性大小。

1.2.4 透射電鏡組織切片的制備與處理 選取1、3、6、14、22、30d鰓和內(nèi)臟團(tuán)樣品, 參考文獻(xiàn)(李清云, 2017)在蠟片上切塊(2nm×2nm×2nm), 以2.5%戊二醛(0.1mol/L磷酸緩沖液配制, pH 7.4)固定。隨后進(jìn)行鋨酸后固定、樹脂包埋、超薄切片、醋酸鈾染色處理后, 用透射電鏡(TEM)進(jìn)行觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

參考文獻(xiàn)計(jì)算櫛孔扇貝的生長(zhǎng)率(濕重生長(zhǎng)率、殼長(zhǎng)增長(zhǎng)率)與攝食率(賈秋紅等, 2015), 根據(jù)毒素當(dāng)量因子(Pelin, 2018)(toxic equivalency factor, TEF)換算毒素蓄積含量, 根據(jù)公式計(jì)算毒素蓄積速度以及殘留率。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23和Excel 2015等軟件整理分析, 結(jié)果均采用單因素方差分析, 以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)表示。采用Origin 8.5軟件作圖說(shuō)明。

式中,1為蓄積1天時(shí)扇貝體內(nèi)的毒素含量,2為蓄積2天時(shí)扇貝體內(nèi)的毒素含量。

式中,7為貝體內(nèi)蓄積的最高毒素含量(蓄積第7天);30為代謝30天后貝體內(nèi)的毒素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 AZAs在櫛孔扇貝的代謝及對(duì)其生長(zhǎng)的影響

結(jié)果表明, AZAs產(chǎn)毒藻暴露對(duì)扇貝生長(zhǎng)和存活等基本生理表征具有顯著影響。實(shí)驗(yàn)30天結(jié)束后, 對(duì)照組櫛孔扇貝殼長(zhǎng)和濕重增長(zhǎng)率分別為2.1%和13.2%, 而毒素暴露組分別為0.3%—0.4% (>0.05)和0.5%—4.0%。殼長(zhǎng)和濕重增長(zhǎng)率與暴露劑量呈負(fù)相關(guān), 即高暴露組增長(zhǎng)最少。另外, 高暴露組的產(chǎn)毒藻直接導(dǎo)致櫛孔扇貝的高死亡率, 可達(dá)20.0% (7d)與88.3% (30d), 而其他暴露組死亡率均小于20.0%。

櫛孔扇貝對(duì)AZAs的蓄積能力較強(qiáng), 且與其暴露水平基本呈正相關(guān)。其中, 高暴露組蓄積含量最高, 可達(dá)303.6μg AZA1 eq/kg, 其次分別是中、低暴露組282.6和175.0μg AZA1 eq/kg。從攝食率水平分析, 低暴露組轉(zhuǎn)化率最高, 可將17.3%產(chǎn)毒藻轉(zhuǎn)化為AZAs。AZAs可在櫛孔扇貝體內(nèi)緩慢代謝, 主要轉(zhuǎn)化為AZA6、AZA12、AZA19和AZA23 4種組分, 其中主要代謝產(chǎn)物為AZA19和AZA12。

不同暴露組AZAs在櫛孔扇貝中的蓄積代謝趨勢(shì)一致, 組間差異不顯著。由圖1可看出, 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程可劃分為3個(gè)階段: I階段為快速蓄積期(1—7d), 中暴露組蓄積速率最快[28.2μg AZA1 eq/(kg·d)], 而低暴露組蓄積速率最慢, 三組均于暴露第7天毒素含量達(dá)最高; II階段為慢速代謝期(7—18d), 毒素含量平穩(wěn)下降; III階段為快速代謝期(18—22d),毒素代謝速度顯著提高可達(dá)Ⅱ階段的4—7倍。試驗(yàn)22天后毒素含量再無(wú)顯著變化, 直至代謝實(shí)驗(yàn)結(jié)束殘留率仍為11.9%—17.3%。由此可知, 櫛孔扇貝對(duì)AZAs具有較強(qiáng)的蓄積能力, 短時(shí)間內(nèi)即可超過(guò)限量標(biāo)準(zhǔn); 但其對(duì)AZAs的代謝消除能力較弱, 經(jīng)過(guò)24天的代謝消除仍然存在較高含量的AZAs。

圖1 櫛孔扇貝的AZAs代謝曲線與生長(zhǎng)生理影響(x%為增長(zhǎng)率)

2.2 AZAs對(duì)櫛孔扇貝免疫系統(tǒng)氧化應(yīng)激的影響

本研究發(fā)現(xiàn), 櫛孔扇貝血細(xì)胞對(duì)AZAs應(yīng)激響應(yīng)十分迅速, 暴露后即出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng), 數(shù)量顯著上升。血細(xì)胞總數(shù)(total hemocyte counts, THC)隨時(shí)間變化趨勢(shì)總體一致, 先迅速上升, 3天時(shí)達(dá)到首峰, 隨后開始緩慢下降, 第6天起降低到對(duì)照組以下并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持一個(gè)穩(wěn)定水平, 第14天時(shí)又迅速上升并在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)到最高水平, 實(shí)驗(yàn)組血細(xì)胞數(shù)量可達(dá)對(duì)照組的2—3倍(圖2)。

本研究重點(diǎn)評(píng)價(jià)了櫛孔扇貝SOD、GSH-Px、POD及ACP抗氧化酶活性變化情況。在血液中, 四種酶的對(duì)照酶活水平相差很大, 活性最高的酶是GSH-Px, 其酶活為(756.4±27.1)U/mg·prot, 其分別可達(dá)到SOD、POD以及ACP酶活的12、47、135倍左右。以對(duì)照組酶活為基準(zhǔn), 以誘導(dǎo)/抑制率指標(biāo)將四種酶的暴露組數(shù)據(jù)統(tǒng)一量綱(圖3)。總體發(fā)現(xiàn), 與對(duì)照組相比, 暴露組中4種酶活性均表現(xiàn)出一定的應(yīng)激反應(yīng)。但比較而言, SOD和ACP活性整體處于被抑制狀態(tài), 而POD和GSH-Px則呈現(xiàn)出誘導(dǎo)效應(yīng)。其中, SOD對(duì)AZAs脅迫不敏感, 其誘導(dǎo)與毒素蓄積量有關(guān), 從暴露第6天起, 僅中、高暴露組出現(xiàn)一定的誘導(dǎo)效應(yīng), 且高暴露組在暴露14天時(shí)出現(xiàn)明顯誘導(dǎo)效果, 對(duì)應(yīng)的誘導(dǎo)劑量為74.2—168.2μg AZA1 eq/kg, 誘導(dǎo)率最高為15.7%; 與SOD不同的是, ACP對(duì)AZAs十分敏感, 低暴露組暴露第3天就出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng), 但持續(xù)時(shí)間短暫, 第6天左右ACP就被抑制至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。雖然POD和GSH-Px在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中表現(xiàn)出持續(xù)性誘導(dǎo)效應(yīng), 但兩者仍然出現(xiàn)一定的差異性: 在蓄積階段(I), 二者響應(yīng)相反, 且高暴露組響應(yīng)最為激烈。在代謝階段(II與III), 二者誘導(dǎo)強(qiáng)度呈波動(dòng)上升趨勢(shì)。在最后平穩(wěn)階段, 二者誘導(dǎo)強(qiáng)度陡然上升。

針對(duì)GSH-Px和POD的高誘導(dǎo)效果, 本實(shí)驗(yàn)對(duì)二者在血液、內(nèi)臟、鰓組織中的活性變化情況進(jìn)一步比較研究(圖4)。對(duì)照組酶活數(shù)據(jù)表明, GSH-Px與POD在血液中呈高活性優(yōu)勢(shì), 活性分別可達(dá)其他組織的25、32倍, 而在內(nèi)臟和鰓中活性低且組織間差異甚微。暴露AZAs后發(fā)現(xiàn)依然是血液中這兩種酶活性變化最為顯著, GSH-Px和POD活性分別為內(nèi)臟的23—30倍, 為鰓的32—48倍, 表明血液應(yīng)是最主要的應(yīng)激部位。POD應(yīng)激與AZAs存在顯著劑量效應(yīng)關(guān)系。中、高暴露組酶活波動(dòng)幅度更為強(qiáng)烈, 在暴露1d可達(dá)到波動(dòng)首峰, 6d后達(dá)到酶活最高。與之相反, 低暴露組酶活波動(dòng)幅度小, 首峰值與最高值延至3d和14d。與POD相比, GSH-Px應(yīng)激無(wú)顯著劑量效應(yīng)關(guān)系。但其在整個(gè)蓄積代謝階段均有高活性應(yīng)激, 在血液中, GSH-Px活性最高可達(dá)POD的50倍。

圖2 AZAs暴露對(duì)櫛孔扇貝血細(xì)胞總數(shù)的影響

圖3 AZAs暴露時(shí)間及含量對(duì)扇貝四種抗氧化酶活性的影響

圖4 GSH-Px與POD在扇貝不同組織的抗氧化酶活性對(duì)比

注: 字母不同則實(shí)驗(yàn)組間差異顯著; *代表該組與對(duì)照組差異顯著,<0.05

2.3 櫛孔扇貝內(nèi)臟與鰓細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

本研究觀察了AZAs脅迫對(duì)櫛孔扇貝內(nèi)臟和鰓細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 三種脅迫強(qiáng)度下, 櫛孔扇貝目標(biāo)組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)均發(fā)生一定變化, 主要表現(xiàn)在線粒體等重要細(xì)胞器和膜結(jié)構(gòu)的損傷、破壞, 其變化程度與AZAs的暴露程度呈一定的相關(guān)性, 說(shuō)明高暴露組櫛孔扇貝受到的氧化脅迫傷害更大。而從實(shí)驗(yàn)過(guò)程來(lái)看, 毒素蓄積階段變化程度最為劇烈, 其中高暴露組導(dǎo)致的損傷最大; 而代謝階段, 低劑量組隨著時(shí)間延長(zhǎng), 櫛孔扇貝的內(nèi)臟和鰓超微結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)一定的自我修復(fù)現(xiàn)象, 但高暴露組則在實(shí)驗(yàn)全過(guò)程均無(wú)自我修復(fù)現(xiàn)象, 呈現(xiàn)出不可逆狀態(tài)。

作為櫛孔扇貝攝入氧氣和食物的重要器官, 鰓首先接觸到AZAs, 且敏感易損傷。正常櫛孔扇貝鰓上皮組織(圖5a)細(xì)胞排列整齊, 各種細(xì)胞器如溶酶體、線粒體等結(jié)構(gòu)正常清晰。低暴露組I階段末期(圖5b)鰓上皮組織細(xì)胞開始損傷, 出現(xiàn)多處透明空泡, 線粒體出現(xiàn)輕微腫脹且數(shù)量減少, 細(xì)胞中溶酶體增多, 血細(xì)胞向管壁聚集。III階段末期(圖5c), 鰓細(xì)胞受損現(xiàn)象明顯改善, 細(xì)胞空泡化減輕, 大部分細(xì)胞趨于正常, 但仍可觀察到少數(shù)固縮細(xì)胞核。而中高暴露組對(duì)鰓組織損傷嚴(yán)重, 組間差異不顯著且無(wú)修復(fù)現(xiàn)象。

內(nèi)臟團(tuán)是櫛孔扇貝蓄積和代謝靶器官, 對(duì)AZAs耐受能力更強(qiáng)。正常櫛孔扇貝內(nèi)臟組織(圖5d)上皮細(xì)胞排列緊密, 細(xì)胞質(zhì)均勻, 細(xì)胞器觀察清晰, 腸腔中不同腔室緊密連接, 腔中纖毛清晰可辨。中低暴露組出現(xiàn)輕微損傷與修復(fù), 與鰓組織低暴露組變化情況基本一致, 而高暴露組結(jié)構(gòu)損傷較為嚴(yán)重。在I階段末期(圖5e), 高暴露組細(xì)胞線粒體數(shù)量下降且腫脹明顯, 并出現(xiàn)密集空泡化, 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)片段化, 溶酶體大量增加, 細(xì)胞核中染色質(zhì)凝集。III階段末期(圖5f), AZAs已對(duì)細(xì)胞造成不可逆損傷, 細(xì)胞膜破損, 內(nèi)容物逸散, 僅留少數(shù)細(xì)胞形態(tài)完整, 可觀察到細(xì)胞壞死后殘留的固縮細(xì)胞核及大量聚集的透明空泡與溶酶體。

圖5 AZAs對(duì)扇貝內(nèi)臟和鰓細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

注: a: 空白組鰓電鏡圖; b: 低暴露組實(shí)驗(yàn)6天鰓組織電鏡圖; c: 低暴露組實(shí)驗(yàn)30天鰓組織電鏡圖; d: 空白組內(nèi)臟電鏡圖; e: 高暴露組實(shí)驗(yàn)6天內(nèi)臟組織電鏡圖; f: 高暴露組實(shí)驗(yàn)30天內(nèi)臟組織電鏡圖; N: 細(xì)胞核; M: 線粒體; L: 溶酶體; V: 透明空泡; ER: 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

3 討論

3.1 AZAs對(duì)櫛孔扇貝生長(zhǎng)代謝的影響

AZAs作為一種典型的脂溶性貝類毒素, 其在海洋貝類中具有較強(qiáng)的蓄積能力, 但代謝速度卻相對(duì)緩慢, 現(xiàn)有結(jié)果發(fā)現(xiàn)其消除半衰期長(zhǎng)達(dá)11d左右, 因此自然條件下可長(zhǎng)時(shí)間存在于貝類中(Kittler, 2010)。而本研究中, 以2.0×107cells/(ind.·d)生物量的產(chǎn)毒藻暴露3天后, 櫛孔扇貝中AZAs毒素含量已超過(guò)其限量標(biāo)準(zhǔn), 連續(xù)暴露6天其毒素積累可超過(guò)限量標(biāo)準(zhǔn)的2—3倍。隨后經(jīng)過(guò)第一階段的代謝(7—18d), 毒素水平下降至限量標(biāo)準(zhǔn)以下, 這一階段的消除速率為(6.3±1.3)μg AZA1 eq/(kg·d); 第二階段代謝過(guò)程(18—22d), 其毒素以更快的速度消除下降, 可達(dá)(29.3±2.1)μg AZA1 eq/(kg·d)。由此可知, AZAs在櫛孔扇貝中的相對(duì)代謝速度呈現(xiàn)出由慢到快的過(guò)程, 整體消除速率為17.8μg AZA1 eq/(kg·d), 與其他研究的結(jié)果較為相似(邴曉菲等, 2017)。

此外, 腹孔環(huán)胺藻產(chǎn)生的AZAs在櫛孔扇貝出現(xiàn)了顯著的生物轉(zhuǎn)化作用, 共代謝生成AZA6、AZA12、AZA19和AZA23四種低毒代謝產(chǎn)物; 初步研究表明這些代謝產(chǎn)物與AZA2相比, 極性增加, 從而加速了毒素的排出, 最終降低了AZAs對(duì)櫛孔扇貝自身的危害性(Kittler, 2010; Hess, 2016)。但櫛孔扇貝對(duì)AZAs的代謝消除雖然在一定程度上降低了自身的危害性, 仍然對(duì)其正常的生理生化活動(dòng)造成了不利影響。本研究直接暴露時(shí)間僅為6天, 但毒素的累積仍然造成其生長(zhǎng)、攝食等生理活動(dòng)受到抑制, 且存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。顯著體現(xiàn)在低暴露對(duì)應(yīng)低死亡率及高攝食轉(zhuǎn)化率/高暴露對(duì)應(yīng)高死亡率及低攝食轉(zhuǎn)化率現(xiàn)象。推測(cè)可能原因是低含量AZAs對(duì)扇貝的生理結(jié)構(gòu)破壞最小, 因此對(duì)其生理活動(dòng)影響程度較低。這與其他毒素對(duì)貝類生長(zhǎng)代謝影響相對(duì)一致。產(chǎn)麻痹性貝類毒素PSTs的塔瑪亞歷山大藻()可對(duì)扇貝生理活動(dòng)(攝食、爬升、附著率等)產(chǎn)生不良影響, 且與產(chǎn)毒藻細(xì)胞密度呈正相關(guān)關(guān)系, 以10000cells/mL暴露后扇貝生長(zhǎng)抑制率高達(dá)68% (Yan, 2003)。有學(xué)者認(rèn)為, 貝類應(yīng)對(duì)脅迫的部分成本投入是以其負(fù)面生理影響為代價(jià)的(Fellowes, 2000; Moret, 2000)。分析表明, 本研究中AZAs脅迫使得扇貝體內(nèi)能量供給方式發(fā)生改變, 可能是將細(xì)胞水平的能量從生理功能(包括繁殖、生長(zhǎng)等)中轉(zhuǎn)為促代謝模式, 從而導(dǎo)致其出現(xiàn)存活下降和生長(zhǎng)遲緩的現(xiàn)象。

3.2 AZAs對(duì)櫛孔扇貝抗氧化酶應(yīng)激的影響

除了櫛孔扇貝表現(xiàn)出的生長(zhǎng)遲緩等不利現(xiàn)象, AZAs脅迫也造成了櫛孔扇貝血細(xì)胞數(shù)量及抗氧化系統(tǒng)酶活性等變化。首先, 外源毒素會(huì)激活扇貝機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答, 其首要防御手段是血細(xì)胞的吞噬作用(陳慕雁, 2007)。在本研究中, AZAs脅迫過(guò)程中血細(xì)胞數(shù)量上升、吞噬活性增強(qiáng), 并產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species, ROS), 導(dǎo)致內(nèi)平衡破壞。而III階段, 血細(xì)胞數(shù)量迅速上升, 以促進(jìn)正常生理機(jī)能恢復(fù)。此外, 血細(xì)胞與體液免疫同樣關(guān)系密切, 可進(jìn)一步將體液因子通過(guò)脫顆粒的方式分泌到血漿中, 激活扇貝的體液免疫(抗氧化酶、凝集素等)。

貝類等生物的抗氧化系統(tǒng)中, SOD和ACP作為初級(jí)代謝酶, 在氧化應(yīng)激反應(yīng)中清除ROS。在Ji等(2018)和本研究中AZAs對(duì)扇貝和貽貝進(jìn)行暴露, SOD應(yīng)激遲緩, 誘導(dǎo)強(qiáng)度微弱。但貝類對(duì)其他異源物質(zhì)的應(yīng)激反應(yīng)中, SOD應(yīng)激高效。貽貝暴露麻痹性貝類毒素(PST)后, SOD在24h內(nèi)高效應(yīng)激, 其酶活被持續(xù)誘導(dǎo)(Qiu, 2013)。全氟化學(xué)品(PFCs)低水平(0—100mg/L)暴露翡翠貽貝后SOD被快速激活(Liu, 2014)。以不同濃度的苯并芘與金屬協(xié)同暴露貽貝, SOD顯示出很高的暴露敏感性, 且已有理論證實(shí), SOD被ROS激活, 可將其轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化物, 減輕組織損傷(李虎, 2017)。已知本實(shí)驗(yàn)中過(guò)氧化物酶都具有高效應(yīng)激性。由此推測(cè), SOD極有可能在AZAs暴露后24h內(nèi)已快速應(yīng)激, 應(yīng)激效應(yīng)強(qiáng)度與毒素暴露劑量有關(guān)。而ACP是一種對(duì)脅迫相當(dāng)敏感的典型的溶酶體酶, 是刺激抗氧化系統(tǒng)應(yīng)激的重要體液因子, 在本研究中, ACP被顯著抑制。其原因可能是AZAs脅迫使溶酶體膜完整性被破壞, 引起細(xì)胞脫顆粒(Zhang, 2006)。

POD與GSH-Px協(xié)同清除過(guò)氧化物, 以減輕細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的傷害。二者應(yīng)激劑量存在差異。重金屬暴露牡蠣(Ferreira, 2019) 實(shí)驗(yàn)證實(shí), 低劑量暴露下GSH-Px有良好的應(yīng)激反應(yīng), 可指示重金屬早期污染。而斑馬魚暴露高濃度銅時(shí)POD活性誘導(dǎo)效果更為顯著(郭京君, 2018)。本研究結(jié)果顯示, 血液中GSH-Px高效應(yīng)激, II和III階段酶活呈波動(dòng)上升誘導(dǎo)趨勢(shì), 與毒素代謝過(guò)程密切相關(guān)。而POD雖有相似趨勢(shì), 但上升幅度較小, 酶活力相對(duì)較低, 推測(cè)是因?yàn)楸┞秳┝课催_(dá)到POD高效誘導(dǎo)水平或其對(duì)AZAs不敏感。二者在代謝后期細(xì)胞結(jié)構(gòu)恢復(fù)階段誘導(dǎo)效果陡升, 或與細(xì)胞修復(fù)相關(guān)。

3.3 AZAs對(duì)櫛孔扇貝組織細(xì)胞的損傷

被異源物質(zhì)脅迫后, 櫛孔扇貝為維持組織穩(wěn)態(tài)激活機(jī)體細(xì)胞凋亡(Romero, 2015)。細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯示, AZAs蓄積過(guò)程中, 櫛孔扇貝核內(nèi)染色質(zhì)濃縮, 細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)片段化等質(zhì)膜異化現(xiàn)象, 這是細(xì)胞凋亡的典型表觀特征。貝類主要有兩種凋亡途徑: 一是死亡受體(外源性)途徑, 其中最具特征的配體/死亡受體FasL/FasR已在櫛孔扇貝中證實(shí)(Li, 2009); 二是線粒體(內(nèi)源性)途徑, 活性氧積累、線粒體損傷、環(huán)境污染物刺激等都可激發(fā)這一途徑(Quon, 2001)。兩種凋亡途徑最終都集中在放大凋亡信號(hào), 觸發(fā)天冬氨酸蛋白水解酶(Caspases)自催化活化(Feig, 2007)。Cd2+通過(guò)線粒體/caspase途徑以劑量依賴的方式誘導(dǎo)了紫貽貝鰓細(xì)胞和牡蠣血細(xì)胞的凋亡(Pruski, 2002); 在除草劑等環(huán)境污染物的作用下, 靜水椎實(shí)螺的血細(xì)胞由凝集素和ROS的產(chǎn)生介導(dǎo)發(fā)生凋亡(Chatel, 2011)。麻痹性貝類毒素STX可通過(guò)Caspase依賴途徑靶向作用于細(xì)胞質(zhì), 以非ROS方式誘導(dǎo)牡蠣免疫細(xì)胞凋亡(Abi-Khalil, 2017)。本研究中, 抗氧化酶高效應(yīng)激證實(shí)了ROS的積累, 同時(shí)電鏡結(jié)果顯示線粒體出現(xiàn)數(shù)量減少、外廓腫脹、空泡化等損傷現(xiàn)象, 且次級(jí)溶酶體增多, 其異噬和自噬作用進(jìn)一步證實(shí)AZAs對(duì)細(xì)胞脅迫造成細(xì)胞內(nèi)部損傷。由此初步證實(shí)AZAs脅迫櫛孔扇貝產(chǎn)生ROS、損傷線粒體, 啟動(dòng)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑。而線粒體與細(xì)胞的能量代謝密切相關(guān)(Green, 1998, 2014), 因此進(jìn)一步推斷其凋亡過(guò)程與能量代謝有關(guān)。

有學(xué)者提出, AZAs對(duì)細(xì)胞的毒性作用是不可逆的損傷細(xì)胞骨架(Vilari?o, 2008), 目前未有直接證據(jù)。但部分毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)有相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。比如, 小鼠口服AZAs 24h后上皮細(xì)胞開始恢復(fù), 表現(xiàn)出可逆性毒性作用(Ito, 2000)。實(shí)際上, 細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷后的自我修復(fù)功能也已在多個(gè)研究中得到證實(shí)(Ito, 1994; 黃燕霞, 2016; 王燕等, 2018), 因此這一看似矛盾的結(jié)果, 可能與毒素的暴露劑量和毒性有關(guān), 超過(guò)一定劑量的毒素可能會(huì)造成細(xì)胞功能的永久性損傷, 且導(dǎo)致其生理功能完全喪失, 但一定劑量范圍內(nèi)可能會(huì)產(chǎn)生自我修復(fù)功能。本研究中, 我們也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。如在III階段末期, 低暴露組組櫛孔扇貝的受損細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)自我修復(fù)現(xiàn)象, 而高生物量組細(xì)胞損傷嚴(yán)重幾乎沒(méi)有修復(fù)。與之相對(duì)應(yīng), 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中高暴露組櫛孔扇貝出現(xiàn)大量的死亡現(xiàn)象, 而低暴露組的生理活動(dòng)變化程度不大。由此推測(cè), 不同AZAs對(duì)櫛孔扇貝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。另外考慮到自然界中, AZAs可在貝類中長(zhǎng)期存在, 因此即便低劑量AZAs對(duì)海洋貝類的長(zhǎng)期脅迫, 可能也會(huì)導(dǎo)致貝類細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的不可逆損傷, 從而對(duì)其生理生化活動(dòng)造成嚴(yán)重影響, 最終也可能會(huì)造成貝類種群和生物量的下降。因此, 需要進(jìn)一步加強(qiáng)自然水平下AZAs長(zhǎng)期脅迫對(duì)貝類的相關(guān)影響, 有助于準(zhǔn)確評(píng)價(jià)其生態(tài)毒理效應(yīng)。

4 結(jié)語(yǔ)

櫛孔扇貝暴露于氮雜螺環(huán)酸毒素AZAs產(chǎn)毒藻-腹孔環(huán)胺藻后, 可對(duì)其所產(chǎn)生的AZAs毒素進(jìn)行蓄積代謝, 并生成新的代謝產(chǎn)物, 以加速對(duì)內(nèi)源性AZAs的消除速度并最大化保護(hù)自身安全。但櫛孔扇貝仍然受到不利影響, 其生理生化均出現(xiàn)不同程度的應(yīng)激響應(yīng), 主要表現(xiàn)在存活率降低、生長(zhǎng)遲緩、血細(xì)胞數(shù)量改變、抗氧化系統(tǒng)酶活性及靶組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化等, 且多個(gè)指標(biāo)均表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。相關(guān)現(xiàn)象的發(fā)生, 與外源毒素AZAs在櫛孔扇貝中的代謝消除有密切的關(guān)聯(lián)性, 即AZAs在櫛孔扇貝中的代謝不僅直接對(duì)櫛孔扇貝造成一定的危害, 而且其誘導(dǎo)產(chǎn)生的過(guò)氧化物對(duì)扇貝也帶來(lái)二次危害, 從而影響其維持正常生理活動(dòng)的能力。

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PHYSIOLOGICAL RESPONSE OF SCALLOPTO THE METABOLIC DETOXIFICATION OF AZASPIRACIDS

DONG Chen-Fan1, 2, WU Hai-Yan2, LI Qing-Yun2, GU Hai-Feng3, TAN Zhi-Jun2

(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Key Laboratory of Testing and Evaluation for Aquatic Product Safety and Quality, Ministry of Agriculture; Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 3. Third Institute of Oceanography, MNR, Xiamen 361005, China)

To understand the physiological response of scallopto the metabolic detoxification of azaspiracids (AZAs), the scallop was exposed to a toxic algae of AZAs,(strain AZDY06, producing AZA2 mainly, isolated from the South China Sea). Except for the metabolic process of AZAs in scallop, activities of four enzymes including superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), peroxidase (POD), and acid phosphatase (ACP) in the blood, viscera, and gills, as well as the total hemocyte counts (THC) were measured. In addition, the ultrastructure of viscera and gill cell were observed to study the structural damage. The results show thatcould convert AZA2 into four metabolites (AZA6, AZA12, AZA19, and AZA23) that have strong polarity and low toxicity, which means thatcould protect itself by eliminating the toxicity of AZAs. However, some physiological parameters, including THC, activities of key antioxidant enzymes, and the ultrastructure of target organ cells, also showed responding reaction during the detoxification process, and some of these parameters showed obvious dose-effect relationship. The THC fluctuated greatly to the highest level of 2—2.5 times of the control group’s. The activities of four antioxidant enzymes changed to different degrees. GSH-Px and POD were activated continuously during the whole process, especially in blood, more than 20 times of those in viscera and gills. The SOD activity showed a strong relationship with AZA content. When the AZAs content was in 74.2—168.2μg AZA1 eq/kg, SOD activity was in the induction state, and otherwise in inhibitory state below or beyond the range. Different from other enzymes, the ACP activity was inhibited in almost of all the process. In the ultrastructure, some pathological phenomena such as vacuolization and nuclear atrophy occurred in the cells of viscera and gill. The tissue cells in low-exposure group could self-repair their structure to some degrees, but not in high-exposure group. This study provides a scientific basis for future study of the detoxification mechanism of AZAs, as well as the risk assessment and limit setting of this phycotoxins in standard.

; azaspiracids (AZAs); metabolic detoxification; physiological response

* 國(guó)家自然科學(xué)基金, 41806138號(hào)。董晨帆, 碩士研究生, E-mail: cfdong1103@163.com

譚志軍, 博士生導(dǎo)師, 研究員, E-mail: tanzj@ysfri.ac.cn

2020-02-07,

2020-03-20

S917.4

10.11693/hyhz20200200037