于世德，黎日照，伍思俊，張 鵬，呂炳輝，喬建勛，顏 丹，羅湧彬

佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院·佛山市口腔醫(yī)院，佛山 528000

聚醚醚酮（polyetheretherketone，PEEK）是一種由羰基和醚基連接芳香環(huán)組成新型的半結(jié)晶性的全芳香族高分子聚合物［1］。由于其耐高溫、耐腐蝕、耐磨、耐疲勞、阻燃以及絕緣等優(yōu)異性能，同時還具有耐摩擦性、耐藥品性、耐水分解性以及優(yōu)良的生物相容性，PEEK 材料獲得了廣泛的應(yīng)用［2-4］。在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，作為性能優(yōu)異的骨替代材料，聚醚醚酮首先被應(yīng)用在了顱面部骨缺損的修復(fù)上［5］。聚醚醚酮具有良好的生物相容性已經(jīng)與骨具有相近的彈性模量，近年來在口腔領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注［5-6］。在口腔種植領(lǐng)域，相比傳統(tǒng)金屬材質(zhì)的口腔種植愈合基臺，由聚醚醚酮材料制作的愈合基臺具有較好的生物相容性以及更大的可調(diào)改空間，更有利于種植體后期的美學(xué)修復(fù)。

相比于傳統(tǒng)的金屬及合金生物材料，PEEK 在骨科領(lǐng)域具有更加巨大的臨床應(yīng)用前景［6］。 然而，關(guān)于PEEK 材料對于軟組織修復(fù)應(yīng)用的相關(guān)報道較少。因此，對于PEEK 材料在軟組織修復(fù)方面的研究能夠?yàn)槿蘸笃渑R床廣泛應(yīng)用，提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究擬采用牙齦成纖維細(xì)胞與PEEK 以及Ti 片共培養(yǎng)后，比較兩種材料對于牙齦成纖維細(xì)胞的黏附、增殖能力進(jìn)行探究，為日后PEEK 材料應(yīng)用于種植體基臺材料對于軟組織修復(fù)能力提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。拓展了聚醚醚酮材料在口腔種植領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，還為種植修復(fù)技術(shù)提供了新的方向和選擇，對于口腔種植學(xué)和口腔材料學(xué)提供重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

聚醚醚酮（廣東粵誠牙科技術(shù)開發(fā)有限公司），鈦（廣東粵誠牙科技術(shù)開發(fā)有限公司），掃描電子顯微鏡S-3000N（Hitachi，日本），CCK-8(東仁，日本)，全自動酶標(biāo)儀Infinite200（Tecan 公司，瑞士），細(xì)胞死活染色試劑盒（碧云天，中國），羅丹明鬼筆環(huán)肽（索萊寶，中國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

牙齦成纖維細(xì)胞取自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院口腔頜面外科門診18～25 周歲阻生牙拔除患者正常牙齦組織。使用組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)牙齦成纖維細(xì)胞，10%胎牛血清的高糖DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞長至覆蓋瓶底的80%時，細(xì)胞接種于各個試件表面接種密度為1 × 105個/mL。

1.3 試件制備

將直徑為10.0 mm的PEEK和Ti制備成厚度為1.0 mm、直徑為10 mm 的圓片狀PEEK 試件和Ti 試件，用400#、500#、600#、1000#、2000#的碳化硅砂紙逐級打磨拋光。依次用丙酮、無水乙醇、超純水超聲清洗10 min，60 ℃水浴酸蝕30 min，乙醇浸泡紫外照射消毒滅菌后干燥備用，見圖1。

圖1 PEEK試件和Ti試件實(shí)物圖

1.4 掃描電鏡觀察細(xì)胞的黏附形態(tài)

PEEK 組和Ti 組各組內(nèi)隨機(jī)選取試件，每個時間點(diǎn)每組設(shè)置3 個重復(fù)試件。將牙齦成纖維細(xì)胞按照相同密度（1 × 105 個/mL）， 接種于各試件表面， 分別于24 h 終止培養(yǎng)， 掃描電鏡觀察試件表面細(xì)胞形態(tài)。

1.5 死活細(xì)胞染色法檢測細(xì)胞死亡

將打磨滅菌后的試件分別置于24孔板中，將處于對數(shù)生長期的牙齦成纖維細(xì)胞以1×105 個/mL 的密度接種于試件表面牙齦成纖維細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別孵育6 h，12 h，24 h 后，吸除培養(yǎng)基，PBS 緩沖液清洗3 次，每孔加入250 μL細(xì)胞死活染色工作液，細(xì)胞培養(yǎng)箱避光孵育30 min，正置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.6 CCK-8方法檢測細(xì)胞的增殖能力

PEEK 組和Ti 組各組內(nèi)隨機(jī)選取試件，每個時間點(diǎn)每組設(shè)置3 個平行試件，且每個時間點(diǎn)設(shè)置空白孔和背景孔。將牙齦成纖維細(xì)胞按照1 × 105個/mL密度接種于各試件表面，分別于6 h、12 h、24 h 終止培養(yǎng)，吸除培養(yǎng)基，按每孔500 μL體積配置實(shí)驗(yàn)所需CCK-8工作液，將各試件置于CCK-8 溶液中，避光孵育1 h～4 h，吸取100 μL混合液至96 孔板中，全自動酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長下檢測樣本的吸光度值。

1.7 羅丹明鬼筆環(huán)肽染色檢測細(xì)胞形態(tài)

取對數(shù)生長期的牙齦成纖維細(xì)胞按照1 × 105個/mL密度接種于各試件表面，培養(yǎng)6 h、12 h、24 h后，用4%多聚甲醛室溫固定15 min； PBS洗滌3次，每次5 min，5 μg/mL的羅丹明鬼筆環(huán)肽室溫避光染色40 min，PBS 漂洗3 次，DAPI復(fù)染。激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism8 軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。對于兩組獨(dú)立樣本數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布和方差齊性采用兩獨(dú)立樣本的t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計推斷；數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布，但方差不齊，采用校正的t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 掃描電鏡觀察試件表面形貌

掃描電鏡觀察Ti 試件及PEEK 表面形貌，結(jié)果顯示試件經(jīng)過打磨酸蝕后表面呈不規(guī)則形，試件表面不平整。PEEK 試件表面呈不規(guī)則片層狀結(jié)構(gòu)，Ti 試件表面呈蜂窩狀孔隙結(jié)構(gòu)，見圖2。

圖2 掃描電鏡觀察PEEK及Ti表面形貌

2.2 掃描電鏡觀察細(xì)胞黏附形態(tài)

掃描電鏡觀察牙齦成纖維細(xì)胞在Ti 試件及PEEK 表面黏附情況。分別將牙齦成纖維細(xì)胞接種于滅菌后的Ti試件及PEEK 試件表面24 h 后觀察細(xì)胞形態(tài)及黏附水平，結(jié)果顯示牙齦成纖維細(xì)胞在細(xì)胞在PEEK 試件表面的黏附數(shù)量要多于Ti 試件表面。觀察牙齦成纖維細(xì)胞黏附形態(tài)，結(jié)果顯示牙齦成纖維細(xì)胞在PEEK 試件表面及Ti 試件表面成長梭形，形態(tài)不規(guī)則，呈典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞在PEEK 試件表面較Ti 試件表面伸出較多絲狀偽足及蛋白纖維絲，且在PEEK 試件表面鋪展更開。結(jié)果顯示牙齦成纖維細(xì)胞在PEEK 試件和Ti試件表面均可黏附與增殖，且在PEEK表面細(xì)胞黏附要優(yōu)于Ti表面，見圖3。

圖3 牙齦成纖維細(xì)胞在PEEK及Ti試件表面黏附情況

2.3 細(xì)胞死活染色

將打磨滅菌后的試件分別置于24孔板中，將處于對數(shù)生長期的牙齦成纖維細(xì)胞以1×105個/mL 的密度接種于試件表面，分別培養(yǎng)6 h，12 h，24 h 后進(jìn)行Calcein-AM/PI免疫熒光染色。熒光正置顯微鏡觀察，結(jié)果顯示Ti試件表面較PEEK 試件表面在6 h，12 h，24 h均出現(xiàn)了較多PI染色的死細(xì)胞，而PEEK 試件表面未見明顯PI 染色的死細(xì)胞，且活細(xì)胞多于Ti試件組，見圖4。

圖4 齦成纖維細(xì)胞在PEEK及Ti試件表面培養(yǎng)不同時間細(xì)胞死活染色

2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力

將PEEK 試件，Ti 試件分別與牙齦成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)6 h，12 h，24 h，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖水平。結(jié)果顯示PEEK 試件，Ti 試件與牙齦成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)6 h、12 h、24 h 后，PEEK 試件表面細(xì)胞增殖能力均優(yōu)于Ti 試件組；隨著共培養(yǎng)時間增長，細(xì)胞增殖增加。即牙齦成纖維細(xì)胞在PEEK 試件表面培養(yǎng)6 h、12 h、24 h的活細(xì)胞數(shù)均高于Ti試件組，見圖5。

2.5 細(xì)胞黏附檢測

將打磨滅菌后的試件分別置于24孔板中，將處于對數(shù)生長期的牙齦成纖維細(xì)胞以1×105 個/mL 的密度接種于試件表面，分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h后進(jìn)行羅丹明鬼筆環(huán)肽熒光染色，檢測細(xì)胞的形態(tài)以及黏附于材料表面情況。結(jié)果顯示細(xì)胞接種6 h、12 h、24 h，牙齦成纖維細(xì)胞均可黏附于試件表面，而在PEEK 試件表面細(xì)胞黏附效果更佳，細(xì)胞鋪展更開，伸出更多偽足。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PEEK 較Ti更有利于黏附細(xì)胞的伸展，見圖6。

圖5 材料與牙齦成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)不同時間細(xì)胞增殖性能測定，*表示P＜0.05

圖6 牙齦成纖維細(xì)胞在PEEK及Ti試件表面培養(yǎng)不同時間細(xì)胞黏附形態(tài)檢測

3 討論

隨著口腔技術(shù)的不斷發(fā)展, 各種材料被應(yīng)用于種植體穿齦部分的研發(fā)。PEEK 是一種具有良好生物性能的高分子材料，在骨修復(fù)中具有廣泛的應(yīng)用，研究表明PEEK 的機(jī)械性能優(yōu)于現(xiàn)有的牙科金屬材料，并且與骨具有相近的彈性模量［7］。在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，作為性能優(yōu)異的骨替代材料，聚醚醚酮首先被應(yīng)用在了顱面部骨缺損的修復(fù)上。近年來在口腔種植領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用［6,8］。牙種植體材料是否具有良好的細(xì)胞黏附增殖性能，是評價其生物學(xué)性能的重要指標(biāo)之一［9-10］。種植體植入種植窩內(nèi)，種植窩周圍血液中蛋白能夠迅速吸附在種植體表面，誘導(dǎo)細(xì)胞黏附于種植體表面，為之后的愈合發(fā)揮重要作用［11］。越來越多的研究關(guān)注種植體表面軟組織的修復(fù)。但是其對于軟組織的修復(fù)能力的相關(guān)研究未見報道。本實(shí)驗(yàn)對PEEK 及傳統(tǒng)種植基臺材料Ti 進(jìn)行了體外細(xì)胞生物相容性的比較，通過牙齦成纖維細(xì)胞在PEEK 及Ti材料表面的黏附、增殖能力評價PEEK 的細(xì)胞生物相容性，探討PEEK 作為牙種植基臺新材料的可能性。

本實(shí)驗(yàn)制備PEEK 和Ti 標(biāo)準(zhǔn)化試件，經(jīng)過粗糙度不同的碳化硅砂紙打磨后，經(jīng)過酸蝕，清洗，殺菌后，使用掃描電子顯微鏡觀察試件表面形貌。通過分別將牙齦成纖維細(xì)胞接種于PEEK 及Ti 試件表面共培養(yǎng)6 h、12 h、24h 后利用掃描電子顯微鏡，CCK-8及免疫熒光檢測細(xì)胞的增殖及黏附性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過打磨酸蝕殺菌后的PEEK 表面呈片層狀，不規(guī)則粗糙的形貌，而Ti 試件表面表面呈蜂窩狀多孔粗糙形貌。將牙齦成纖維細(xì)胞接種于試件表面24 h 后，掃描電鏡觀察顯示，牙齦成纖維細(xì)胞在PEEK 表面和Ti 表面均可黏附生長，但在PEEK 試件表面較Ti試件表面細(xì)胞鋪展更開，伸出更多的纖毛和偽足。說明牙齦成纖維細(xì)胞在PEEK 表面黏附性更好。CCK-8 檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將牙齦成纖維細(xì)胞接種于試件表面培養(yǎng)6 h、12 h、24 h 后，細(xì)胞在PEEK 表面細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)，在6 h、12 h、24 h 細(xì)胞增殖能力均強(qiáng)于Ti 試件組?；罴?xì)胞死細(xì)胞染色結(jié)果顯示，細(xì)胞接種于PEEK 表面6 h、12 h、24 h 后，試件表面均沒有出現(xiàn)明顯的PI染色的死細(xì)胞，而在Ti表面出現(xiàn)了少量PI染色的死細(xì)胞，且隨著培養(yǎng)時間的增長，死細(xì)胞染色增多。羅丹明鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果同樣顯示，牙齦成纖維細(xì)胞在PEEK 試件表面較Ti 試件表面鋪展更開，細(xì)胞形態(tài)更長，伸出偽足更多。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與掃描電鏡結(jié)果一致。

理想的種植體材料應(yīng)該具有良好的生物相容性，能夠促進(jìn)促進(jìn)細(xì)胞的增殖和黏附。PEEK 作為一種具有優(yōu)良理化特性的生物醫(yī)學(xué)高分子材料，在臨床上具有良好的應(yīng)用前景［12］。本實(shí)驗(yàn)通過比較PEEK 及Ti對于牙齦成纖維細(xì)胞的增殖黏附能力，驗(yàn)證PEEK 的體外生物相容性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PEEK和Ti相比具有更好的生物相容性，能夠在體外促進(jìn)牙齦成纖維的黏附增殖。但是有實(shí)驗(yàn)表明PEEK由于過于穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使得其具有明顯的惰性及疏水性［4］，嚴(yán)重限制了其生物學(xué)應(yīng)用。因此更多關(guān)于PEEK 及其改性的相關(guān)研究仍需進(jìn)行，為下一步的臨床應(yīng)用提供依據(jù)和參考。