智亮輝，劉 偉，李 偉，甄四虎，焦喜林

在世界范圍內(nèi)，胃癌是第二大癌癥相關(guān)致死性疾病[1],在我國(guó)是繼肺癌、肝癌后的第三大高發(fā)惡性腫瘤，預(yù)后差、病死率高，嚴(yán)重威脅了我國(guó)人民的生命健康[2]。胃癌的演化進(jìn)程涉及多種致癌基因激活、抑癌基因失活和復(fù)雜分子調(diào)控機(jī)制[3]。近年來(lái)靶向藥物、生物治療、免疫治療等取得了一定進(jìn)展，然而胃癌患者的整體5年生存率仍然徘徊在20%左右[4]，且中晚期患者居多，預(yù)后差。因此尋找新的胃癌演化進(jìn)程中有效靶點(diǎn)用于臨床診斷，評(píng)估預(yù)后，開發(fā)相應(yīng)作用靶點(diǎn)的藥物是目前亟待解決的問題，對(duì)于提高胃癌患者的臨床診治水平和長(zhǎng)期生存有重大意義。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)LncRNA-ATB在胃癌中高表達(dá)且提示患者預(yù)后不良，但其具體功能及作用機(jī)制尚需深入研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和試劑 人胃癌細(xì)胞系BGC-823、MGC-803、SGC-7901、AGS及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司、日本TaKaRa公司，熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒SYBRPremix Ex Taq TMⅡ購(gòu)自日本TaKaRa公司，LncRNAATB-siRNA和NC由Invitrogen公司設(shè)計(jì)并合成(敲低組設(shè)計(jì)si1、si2、si3共3條)，Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑和Transwell小室分別購(gòu)自購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司及Corning公司，胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶、Penicillin-Streptomycin雙抗購(gòu)于美國(guó)Hyclon公司，RIPA高效蛋白裂解液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和篩選:胃癌細(xì)胞(BGC-823、MGC-803、SGC-7901、AGS)及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES1均采用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代一次，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。待細(xì)胞80%融合后，收集細(xì)胞，用Trizol 裂解細(xì)胞，分別提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板。lncRNA-ATB引物序列為：上游5-CTTCACCAGCACCCAGAGA-3，下游5-AAGACAGAAAAACAGTTCCGAGTC-3；內(nèi)參GAPDH引物序列為：上游5-TTGGTATCGTGGAAGGACTC-3A，下游5-TGTCATCATATTTGGCAGGTT-3。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 45 s，75℃ 15 s，60℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。記錄各組反應(yīng)Ct值，以2-ΔΔCt表示待測(cè)基因的表達(dá)水平。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及鑒定:選取BGC-823和MGC-803胃癌細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)功能研究，分為對(duì)照(NC)組，si1、si2、si3組。培養(yǎng)細(xì)胞3～5 d，于轉(zhuǎn)染前12 h將細(xì)胞懸液種植于六孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到30%左右時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取4個(gè)EP管，分別加入200 μl無(wú)牛血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基，取2管加入3 μl轉(zhuǎn)染試劑lipo 2000，輕輕搖晃混勻；另2管分別加入LncRNA-ATB-shRNA/NC，搖晃混勻，常溫放置5 min。將LncRNA-ATB-shRNA/NC和lipo 2000混在一起，輕輕搖晃混勻，常溫放置15 min。將六孔板中待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞換成無(wú)牛血清無(wú)雙抗培養(yǎng)基，將上述混合液按分組加入六孔板中，輕輕搖晃混勻，培養(yǎng)8 h后取出，換成含牛血清含雙抗培養(yǎng)基。48 h后收取細(xì)胞提取 RNA，鑒定轉(zhuǎn)染效率。構(gòu)建瞬時(shí)轉(zhuǎn)染敲低lncRNA-ATB的胃癌細(xì)胞系。

1.2.3細(xì)胞侵襲和遷移：Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。實(shí)驗(yàn)前1天用 Matrigel基質(zhì)膠覆蓋小室上室的基底膜，在培養(yǎng)箱過夜。實(shí)驗(yàn)時(shí)將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞懸浮，每個(gè)小室上室加入密度為 1×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液200 μl，下室加入500 μl含20%牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48～72 h后，取出小室，用PBS沖洗2遍，并用棉簽輕輕擦去上室底層的殘余細(xì)胞及培養(yǎng)基，用10%甲醛固定細(xì)胞5 min，結(jié)晶紫溶液染色15 min，自來(lái)水沖洗，放置于倒置顯微鏡下，隨機(jī)選取3個(gè)視野,計(jì)數(shù)染色細(xì)胞的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)，Transwell小室的上室基底膜無(wú)需Matrigel 覆蓋基質(zhì)膠，其他步驟與細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.4細(xì)胞克隆：將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞接種于六孔板中，每孔接種1000個(gè)細(xì)胞，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)10 d，每2～3天換液一次。第10天取出細(xì)胞，用PBS沖洗2遍，加入10%甲醛固定5 min。棄甲醛，加入結(jié)晶紫溶液常溫下染色15 min。然后用自來(lái)水緩慢沖洗培養(yǎng)板，將結(jié)晶紫洗凈，室溫晾干，拍照計(jì)數(shù)染色細(xì)胞，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5細(xì)胞增殖：在96孔板中分別接種BGC-823和MGC-803細(xì)胞(每孔3000個(gè)細(xì)胞)，分為實(shí)驗(yàn)組(si2、si3)及對(duì)照組(NC)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別于0、24、48、72、96 h用CCK-8 法檢測(cè)BGC-823和MGC-803細(xì)胞的增殖情況，避光加入10 μl CCK-8(5 mg/ml)，在培養(yǎng)箱中孵育2 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞OD值，計(jì)算每組平均值，重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1lncRNA-ATB在正常胃和胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平 與正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES1相比，lncRNA-ATB在胃癌細(xì)胞BGC-823、MGC-803、SGC-7901、AGS表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。見圖1。本實(shí)驗(yàn)選取升高差異最明顯的BGC-823和MGC-803進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 GES1和MGC-803、BGC-823、SGC-7901、AGS細(xì)胞lncRNA-ATB表達(dá)水平比較

2.2構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系及鑒定 si2、si3組BGC-823細(xì)胞lncRNA-ATB表達(dá)水平分別為0.43±0.29、0.32±0.26；si2、si3組lncRNA-ATB表達(dá)水平顯著低于NC組(P<0.05)。si2、si3組MGC-803細(xì)胞lncRNA-ATB表達(dá)水平分別為0.45±0.23、0.25±0.14，si2、si3組lncRNA-ATB表達(dá)水平顯著低于NC組(P<0.05)。見圖2。因此后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)選取si2、si3作為對(duì)照組進(jìn)行。

圖2 MGC-803、BGC-823細(xì)胞lncRNA-ATB表達(dá)水平比較

2.3敲低lncRNA-ATB后對(duì)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

2.3.1對(duì)BCG-823細(xì)胞遷移、侵襲能力影響：遷移實(shí)驗(yàn)中NC組、si2組和si3組BCG-823細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為200.00±10.44、75.00±9.52、48.00±7.56；與NC組相比，si2組和si3組BCG-823細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著降低(P<0.05)。侵襲實(shí)驗(yàn)中NC組、si2組和si3組BCG-823細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為175.00±12.31、54.00±8.55、47.00±6.74；與NC組相比，si2組和si3組BCG-823細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 敲低lncRNA-ATB后對(duì)BGC-823體外遷移侵襲能力的影響

2.3.2對(duì)MGC-803細(xì)胞遷移、侵襲能力影響：遷移實(shí)驗(yàn)中NC組、si2組和si3組BCG-803細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為195.00±9.88、54.00±7.61、47.00±8.32；與NC組比較，si2組和si3組BCG-803細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著降低(P<0.05)。侵襲實(shí)驗(yàn)中NC組、si2組和si3組的BCG-803細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為173.00±7.36、48.00±7.57、45.00±6.83；與NC組相比，si2轉(zhuǎn)染組和si3轉(zhuǎn)染組BCG-803細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著降低(P<0.05)。見圖4。

圖4 敲低lncRNA-ATB后對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803體外遷移侵襲能力的影響

2.4敲低lncRNA-ATB后胃癌細(xì)胞克隆能力變化的比較 NG組、si2組、si3組BGC-823細(xì)胞克隆集落生長(zhǎng)數(shù)目分別為785.00±5.02、213.00±7.82、195.00±4.24。與NC組比較，si2組、si3組BGC-823細(xì)胞克隆集落生長(zhǎng)數(shù)目顯著減少(P<0.01)。NC組、si2組、si3組MGC-803細(xì)胞克隆集落生長(zhǎng)數(shù)目分別為812.00±12.35、205.30±12.32、195.00±15.47。與NC組比較，si2組、si3組MGC-803細(xì)胞克隆集落生長(zhǎng)數(shù)目顯著減少(P<0.01)。見圖5。

圖5 敲低lncRNA-ATB后對(duì)BGC-823和MGC-803細(xì)胞克隆形成能力影響

2.5敲低lncRNA-ATB后對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響 與NC組比較，si2組和si3組BGC-823、MGC-80細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.05)。見圖6。

圖6 敲低lncRNA-ATB后對(duì)BGC-823和MGC-803細(xì)胞增殖能力的影響

3 討論

人類全基因組中，只有2%的基因可以編碼蛋白，其他基因均轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA[5-6]。非編碼RNA根據(jù)長(zhǎng)度分為：小ncRNA(<200 nt)及 lncRNA(>200 nt)。lncRNA 由于長(zhǎng)度及結(jié)構(gòu)原因，其高級(jí)結(jié)構(gòu)決定了其重要功能[7]。既往多個(gè)研究表明，lncRNA廣泛在多個(gè)細(xì)胞分子事件中參與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，在復(fù)雜的分子生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用[7]。國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)，lncRNA在各種癌癥中廣泛表達(dá)，具有腫瘤特異性及表達(dá)多樣性[8-9]。研究表明，多種lncRNA 在胃癌演化進(jìn)程的重要節(jié)點(diǎn)存在異常表達(dá)，與胃癌的異常分化、遷移、侵襲等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，并能指導(dǎo)患者預(yù)后，在患者術(shù)后監(jiān)測(cè)輔助治療效果判斷方面有重要意義[10-11]。如：SNHG5在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌作用[12]；GClnc1在胃癌的進(jìn)展中發(fā)揮促癌作用[13]；HOTAIR、lncRNA-H19促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[14-15]。研究表明lncRNA-ATB與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，廣泛參與了惡性腫瘤細(xì)胞的多個(gè)分子事件[16]，其在結(jié)直腸癌和肝癌的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[17-18]。但lncRNA-ATB在胃癌中的具體功能尚未見研究報(bào)道。

侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤特有的生物學(xué)行為，也是腫瘤復(fù)發(fā)致死的主要原因，因此探尋腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移侵襲的相關(guān)癌基因有重大意義。本課題組首先采用qPCR在4種胃癌細(xì)胞系中驗(yàn)證了lncRNA-ATB的表達(dá)水平，篩選出高表達(dá)lncRNA-ATB的兩種胃癌細(xì)胞系BGC-823和MGC-803進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。設(shè)計(jì)LncRNA-ATB-shRNA/NC干擾序列，構(gòu)建瞬時(shí)轉(zhuǎn)染敲低lncRNA-ATB的胃癌細(xì)胞系。采用qPCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，選取敲低效果較好的si2和si3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低lncRNA-ATB后si2組、si3組BGC-823、MGC-803遷移、侵襲能力較NC組明顯降低。提示lncRNA-ATB對(duì)胃癌的遷移、侵襲能力有促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明，敲低lncRNA-ATB后si2組、si3組BGC-823、MGC-803細(xì)胞克隆能力和增殖能力較NC組顯著降低。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明lncRNA-ATB在體外發(fā)揮癌基因的作用，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移侵襲能力。但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，lncRNA-ATB在體外對(duì)胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為發(fā)揮重要的調(diào)控作用，對(duì)胃癌進(jìn)展有重要的促進(jìn)作用，但是其具體作用機(jī)制仍有待深入研究。