孫偉博 魏朝瓊 馬曉星 魏 輝 諸葛強(qiáng)

(南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院 南京 210037)

隨著基因工程研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)被越來(lái)越多地用于植物遺傳改良。相對(duì)于傳統(tǒng)育種，轉(zhuǎn)基因技術(shù)能夠?qū)⑻囟ǖ耐庠椿蛘系绞荏w植物中，打破了物種間隔離，可以更快更準(zhǔn)確地對(duì)植物性狀進(jìn)行改良。從1983年首例轉(zhuǎn)基因煙草(Nicotianatabacum)獲得成功，1996年轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化獲得批準(zhǔn)以來(lái)，全球轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的商業(yè)化應(yīng)用呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)(Halford，2018)，轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物及轉(zhuǎn)基因林木提高了相關(guān)的經(jīng)濟(jì)效益同時(shí)也具有重要的科研價(jià)值，但在另一方面，關(guān)于轉(zhuǎn)基因安全性的問(wèn)題一直爭(zhēng)議不斷。其問(wèn)題主要來(lái)源于3個(gè)方面：1)轉(zhuǎn)化基因?qū)τ谌嘶騽?dòng)物等的潛在危害，由于少數(shù)轉(zhuǎn)化基因編碼的蛋白具有過(guò)敏性或毒性，人或動(dòng)物食用后可能造成傷害(Pengetal.，2019)，另外在轉(zhuǎn)基因過(guò)程中攜帶的抗性標(biāo)記基因進(jìn)入植物基因組可能會(huì)使人或動(dòng)物產(chǎn)生抗藥性；2)基因逃逸引發(fā)的環(huán)境危害，包括轉(zhuǎn)基因植物與周邊環(huán)境中的近源物種會(huì)由于花粉雜交等原因出現(xiàn)基因漂移，導(dǎo)致抗除草劑等基因進(jìn)入其他物種基因組從而形成超級(jí)雜草(Wangetal.，2018)，還有基因漂移可能導(dǎo)致外源基因進(jìn)入土壤微生物基因組中，對(duì)土壤微生物的生存及群落結(jié)構(gòu)造成影響(Luetal.，2018)；3)對(duì)于生態(tài)多樣性的不利影響，轉(zhuǎn)基因植株的各種性狀優(yōu)勢(shì)會(huì)使自身形成優(yōu)勢(shì)種群，抑制野生種群的發(fā)展從而對(duì)生態(tài)多樣性造成破壞(賈士榮等，2014)，外源基因編碼蛋白也可能通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物殘?bào)w或根系代謝影響土壤微生物生長(zhǎng)，從而破壞土壤微生物群落多樣性(Weietal.，2018)。

面對(duì)轉(zhuǎn)基因植物可能存在的風(fēng)險(xiǎn)，需要建立科學(xué)的安全評(píng)估體系。評(píng)估轉(zhuǎn)基因植物的安全性問(wèn)題應(yīng)該從物種、基因和環(huán)境3方面統(tǒng)籌衡量，作為安全評(píng)估框架的一部分，轉(zhuǎn)基因植物的大田試驗(yàn)成為轉(zhuǎn)基因物種與現(xiàn)存物種比對(duì)的關(guān)鍵方法，也是目前國(guó)際上對(duì)于轉(zhuǎn)基因安全評(píng)測(cè)原則達(dá)成的共識(shí)(Andersonetal.，2018)。本研究采用了3類轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)(Populus)進(jìn)行大田試驗(yàn)，分別是轉(zhuǎn)類甜蛋白編碼基因(PeTLP)的抗病系列、轉(zhuǎn)Bt毒蛋白編碼基因(Cry1Ac)的抗蟲(chóng)系列、轉(zhuǎn)AtGols基因的耐旱和耐鹽堿系列。3種基因均通過(guò)根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)侵染南林895楊(Populusdeltoides×P.euramericana‘Nanlin 895’)葉盤進(jìn)行轉(zhuǎn)化。其中，PeTLP基因來(lái)源于毛果楊(Populustrichocarpa)，編碼的類甜蛋白對(duì)于多種病原菌具有抑制作用(Wangetal.，2013)；Cry1Ac基因?yàn)閮?yōu)化過(guò)的Bt毒蛋白編碼基因，來(lái)源于蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)，其編碼產(chǎn)物對(duì)美國(guó)白蛾(Hyphantriacunea)具有良好的滅殺性(張雁等，2012)；AtGols基因來(lái)源于擬南芥(Arabidopsisthaliana)，編碼生成的蛋白激酶在植物抗旱、抗鹽堿等多種生理進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用(Laetal.，2017)。通過(guò)比較不同轉(zhuǎn)基因南林895楊對(duì)周圍環(huán)境影響的橫向差異以及各轉(zhuǎn)基因株系自身相關(guān)參數(shù)的縱向差異，揭示不同外源基因、不同轉(zhuǎn)基因株系和環(huán)境因素等對(duì)于轉(zhuǎn)基因安全評(píng)估的影響，為轉(zhuǎn)基因林木的安全評(píng)估及田間釋放提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為3類轉(zhuǎn)基因南林895楊，即轉(zhuǎn)類甜蛋白編碼基因(PeTLP)的TLP抗病系列(TLP1-2、TLP1-6、TLP1-7、TLP2-9、TLP2-11)，轉(zhuǎn)Bt毒蛋白編碼基因(Cry1Ac)的Bt抗蟲(chóng)系列(A1-3、A3-4、A4-6、A5-0、A5-23)，轉(zhuǎn)AtGols基因的Gols抗逆系列(Gols2-1、Gols2-2、Gols2-3)。3類轉(zhuǎn)基因南林895楊均采用植物表達(dá)載體pGWB9，通過(guò)農(nóng)桿菌(LBA4404)侵染葉盤法進(jìn)行轉(zhuǎn)化獲得。篩選陽(yáng)性植株，于溫室培養(yǎng)1年，剪取莖段在試驗(yàn)田中進(jìn)行扦插種植。對(duì)照均為未轉(zhuǎn)基因南林895楊。

1.2 試驗(yàn)田間設(shè)計(jì)

試驗(yàn)地位于江蘇省宿遷市泗洪陳?ài)琢謭?chǎng)，該試驗(yàn)地為國(guó)家林業(yè)局已批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)田間試驗(yàn)林地。試驗(yàn)地地形平坦，周邊土質(zhì)、氣溫、降水等環(huán)境條件穩(wěn)定一致。實(shí)際種植面積為97 m(南北)× 45 m(東西)，試驗(yàn)地北邊為2 m寬排水溝和3 m寬道路，南邊為空置地，東邊為3 m寬排水溝，西邊為3 m寬道路。3類轉(zhuǎn)基因南林895楊及對(duì)照組均采用莖段進(jìn)行扦插，定植方式依據(jù)苗木數(shù)量采用隨機(jī)區(qū)設(shè)計(jì)和裂區(qū)設(shè)計(jì)，具體定植如圖1所示，株行距為2 m × 2.15 m，不同轉(zhuǎn)基因品系之間種植非轉(zhuǎn)基因南林895楊進(jìn)行隔離。試驗(yàn)地邊緣種植南林895楊進(jìn)行隔離，外圍栽植不飄絮楊樹(shù)品種進(jìn)行隔離。試驗(yàn)地于2017年3月進(jìn)行造林，試驗(yàn)期間不施用化肥及農(nóng)藥。

圖1 試驗(yàn)田定植示意Fig.1 Planting map of experimental fieldA1-3,A3-4,A4-6,A5-0,A5-23：轉(zhuǎn)Bt毒蛋白編碼基因(Cry1Ac)的Bt抗蟲(chóng)系列；TLP1-2,TLP1-6,TLP1-7,TLP2-9,TLP2-11：轉(zhuǎn)類甜蛋白編碼基因(PeTLP)的TLP抗病系列；Gols2-1,Gols2-2,Gols2-3：轉(zhuǎn)AtGols基因的Gols抗逆系列；NL895：未轉(zhuǎn)基因南林895楊。A1-3,A3-4,A4-6,A5-0,A5-23:Bt insect-resistant lines of transgenic Bt toxin protein coding gene (Cry1Ac);TLP1-2,TLP1-6,TLP1-7,TLP2-9,TLP2-11:TLP pathogen-resistant lines of transgenic thaumatin-like protein coding gene (PeTLP);Gols2-1,Gols2-2,Gols2-3:Gols stress-resistant lines of transgenic AtGols gene;NL895:Non-transgenic Nanlin895 poplars.

1.3 研究方法

1.3.1 試驗(yàn)地環(huán)境及轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)情況測(cè)定 試驗(yàn)地氣溫和降水量分別采用溫度記錄儀(Hoiki，日本)和降水量記錄儀(Hoiki，日本)進(jìn)行記錄，于2017年3月至2018年11月，每2個(gè)月對(duì)儀器中的數(shù)據(jù)進(jìn)行1次拷貝。植株高度采用米尺進(jìn)行測(cè)量，每個(gè)季度測(cè)量2次，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.3.2 外源基因穩(wěn)定性的分子檢測(cè) 對(duì)不同外源基因在南林895楊中的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估，轉(zhuǎn)化基因的載體均采用35S啟動(dòng)子，因此使用35S啟動(dòng)子序列作為上游引物，目的基因的下游序列作為檢測(cè)的下游引物(表1)，采用PCR方法針對(duì)不同外源基因進(jìn)行檢測(cè)。于2018年6月對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)基因系列分別隨機(jī)采摘生長(zhǎng)良好的葉片作為重復(fù)樣本，使用植物總RNA提取試劑盒(天根，北京)進(jìn)行總RNA提取，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)合成cDNA作為PCR檢測(cè)的模板，反應(yīng)條件如表1所示。

表1 轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)檢測(cè)的PCR引物和退火溫度及擴(kuò)增片段大小Tab.1 PCR primers,annealing temperature(Tm) and amplification fragment size for detection of transgenic poplar

1.3.3 外源基因向土壤微生物轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 每個(gè)轉(zhuǎn)基因系列隨機(jī)選取3份土壤樣品進(jìn)行土壤微生物總DNA提取，具體提取方法依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)(FastDNA Spin kit for Soil，MP Biomedicals，美國(guó))。以土壤微生物總DNA為模板，分別使用不同外源基因的特異引物(表2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。

表2 土壤微生物檢測(cè)的PCR引物和退火溫度及擴(kuò)增片段大小Tab.2 PCR primers,annealing temperature(Tm) and amplification fragment size for detection of soil microorganisms

1.3.4 土壤微生物數(shù)量檢測(cè) 以隨機(jī)區(qū)設(shè)計(jì)或裂區(qū)設(shè)計(jì)中相鄰4株同一株系的植株作為單個(gè)取樣區(qū)的4個(gè)頂點(diǎn)，選取每個(gè)取樣區(qū)西北頂點(diǎn)植株，在距其主干半徑20 cm的取樣區(qū)域內(nèi)，隨機(jī)選取一點(diǎn)采集10～20 cm深處土壤50 g作為樣本。將采集的土壤樣本置于50 mL離心管中，所有樣品收集于冰盒內(nèi)，4 ℃冰箱保存。

采用四環(huán)素-葡萄糖-酵母提取物培養(yǎng)基(OGYE)進(jìn)行土壤樣品中真菌的培養(yǎng)，對(duì)土壤樣品中細(xì)菌及放線菌培養(yǎng)采用蛋白胨-胰蛋白胨-酵母提取物-葡萄糖培養(yǎng)基(PTYG)，具體培養(yǎng)基配制方法參照Yu等(2013)。

將同一株系楊樹(shù)下采集的土壤樣品混合均勻后，稱取60 g平均分為2份，1份倒入三角瓶中，加入15 mmol·L-1無(wú)菌磷酸緩沖液(pH7.0)270 mL，置于水平搖床上震蕩10 min。吸取0.1 mL土壤懸浮液，使用15 mmol·L-1無(wú)菌磷酸緩沖液稀釋1 000倍，分別取0.1 mL稀釋后土壤懸浮液均勻涂布于OGYE和PTYG培養(yǎng)基上，每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)，在室溫條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后統(tǒng)計(jì)OGYE培養(yǎng)基上真菌菌落數(shù)目(colony forming unit，CFU)，培養(yǎng)7天后統(tǒng)計(jì)PTYG培養(yǎng)基上菌落數(shù)目。統(tǒng)計(jì)完成后使用70%乙醇將PTYG培養(yǎng)基表面輕輕擦拭，仍然存在的菌落為放線菌，分別記錄細(xì)菌和放線菌菌落數(shù)目。另外1份30 g土壤樣品置于烘箱內(nèi)，80 ℃過(guò)夜烘干，稱量并記錄其干質(zhì)量。樣品中微生物數(shù)量計(jì)算公式如下：微生物數(shù)量=菌落數(shù)目×土壤干質(zhì)量×稀釋倍數(shù)，最終以每g土壤(干質(zhì)量)形成菌落數(shù)目的對(duì)數(shù)值(lgCFU·g-1DW)進(jìn)行比較分析。

1.3.5 轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的化感作用 于2017年開(kāi)始，定期采集各轉(zhuǎn)基因系列及對(duì)照組南林895楊葉片，利用“三明治”方法模擬轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)對(duì)于野生植物的化感作用(圖2)，以評(píng)估轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)可能對(duì)于野生植物的負(fù)面效應(yīng)。將采集的楊樹(shù)葉片于50 ℃條件下烘干24 h，取烘干的葉片樣本置于六孔板(康寧，美國(guó))下排3孔中，每孔50 mg同一株系的葉片組織(對(duì)照組放置相同處理的未轉(zhuǎn)基因南林895楊葉片組織)；在每個(gè)孔內(nèi)倒入5 mL低熔點(diǎn)瓊脂(0.5%，W/V)，凝固后再重復(fù)倒入5 mL低熔點(diǎn)瓊脂，待瓊脂全部凝固后，每孔加入5粒萵苣(Lactucasativa)種子。在六孔板的上排3孔中均倒入10 mL低熔點(diǎn)瓊脂，待瓊脂全部凝固后，每孔加入5粒萵苣種子，作為負(fù)對(duì)照。將六孔板放入培養(yǎng)箱于25 ℃條件下暗培養(yǎng)72 h。取出六孔板置于-20 ℃冰箱10 h，之后將萵苣種子取出，測(cè)量其胚根及下胚軸長(zhǎng)度，每孔中的測(cè)量值去除最大值與最小值后，取剩余3粒種子的平均值進(jìn)行記錄。

圖2 轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的化感作用Fig.2 Allelopathy of transgenic poplars CK-：未放置楊樹(shù)葉片的負(fù)對(duì)照；CK：未轉(zhuǎn)基因南林895楊葉片；T：轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)葉片。CK-:Negative control without poplar leaves;CK:Non-transgenic Nanlin895 poplar leaves;T:Transgenic poplar leaves.

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel軟件記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)地氣象條件及轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)情況

試驗(yàn)地位于江蘇省中部，屬季風(fēng)氣候。根據(jù)溫度和降水量記錄結(jié)果(圖3)可以發(fā)現(xiàn)，在2017年4月至2018年5月期間，試驗(yàn)地降水量具有明顯的季節(jié)性變化，在5—11月期間降水量較大，最大降水量出現(xiàn)在2017年10月1日，為75.5 mm；在11月至次年4月之間降水量較小，較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)沒(méi)有降水。氣溫變化符合當(dāng)?shù)貧夂蛱攸c(diǎn)，最高氣溫出現(xiàn)在2017年7月24日，達(dá)到39.7 ℃，最低氣溫出現(xiàn)在2018年1月12日，為-10.3 ℃。試驗(yàn)地氣象條件較為穩(wěn)定，未出現(xiàn)影響楊樹(shù)生長(zhǎng)的極端天氣，降水量和氣溫在不同的季節(jié)具有顯著差異性，能夠作為土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響因素進(jìn)行分析。

圖3 試驗(yàn)地降水量及氣溫記錄Fig.3 Precipitation and air temperature records in the experimental field

根據(jù)對(duì)照組和轉(zhuǎn)基因南林895楊樹(shù)高測(cè)量結(jié)果(圖4)，可以發(fā)現(xiàn)在正常生長(zhǎng)環(huán)境條件下，轉(zhuǎn)基因南林895楊的生長(zhǎng)趨勢(shì)與對(duì)照組的生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，在6—12月之間，生長(zhǎng)速度較快，12月至次年3月期間植株生長(zhǎng)緩慢。在3個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)上，Bt系列和TLP系列轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的樹(shù)高平均值均低于對(duì)照組，而Gols系列的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)樹(shù)高平均值均高于對(duì)照組，但方差分析結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因南林895楊樹(shù)高與各自對(duì)照組之間的差異未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。Bt系列的楊樹(shù)樹(shù)高高于TLP系列和Gols系列，推測(cè)與扦插時(shí)莖段的生長(zhǎng)狀態(tài)差異相關(guān)。

圖4 轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)樹(shù)高測(cè)量結(jié)果Fig.4 The height measurement of the transgenic poplars不同小寫字母表示數(shù)值在0.05水平上存在顯著性差異。The different lowercase letters mean significant differences among values at 0.05 level.

2.2 外源基因穩(wěn)定性及向土壤微生物轉(zhuǎn)移情況

采用PCR方法對(duì)不同外源基因在轉(zhuǎn)基因南林895楊中的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)，在3個(gè)系列的轉(zhuǎn)基因南林895楊葉片中，均擴(kuò)增到轉(zhuǎn)化基因的特異性目的片段(Bt系列1 977 bp，TLP系列890 bp，Glos系列1 131 bp)，且與各基因保存質(zhì)粒的陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增片段大小一致，在對(duì)照組南林895楊中均未擴(kuò)增到目的片段(圖5)，外源基因均穩(wěn)定存在于各轉(zhuǎn)基因系列南林895楊的基因組中。

對(duì)采集的土壤樣品，提取微生物總DNA后使用細(xì)菌16SrRNA基因的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)(圖6a-c)，所有樣品均獲得相同目的片段，表明所取土壤微生物樣品均可用于基因轉(zhuǎn)移檢測(cè)。以質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，微生物總DNA作為檢測(cè)模板，根據(jù)不同的轉(zhuǎn)基因株系，利用特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)(圖6d-f)，結(jié)果表明僅在質(zhì)粒當(dāng)中擴(kuò)增到目的片段，對(duì)照組及轉(zhuǎn)基因組土壤微生物樣品中均未檢測(cè)到目的片段，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因南林895楊的外源基因向土壤微生物中產(chǎn)生轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。

圖6 土壤微生物中16S rRNA基因及目的基因PCR檢測(cè)Fig.6 PCR detection of 16S rRNA gene and target gene in soil microorganismsM：DNA ladder；P：質(zhì)粒；C：對(duì)照組；1-5:各轉(zhuǎn)基因株系的土壤樣品。a-c：16S rRNA基因PCR結(jié)果；d-f：目的基因PCR結(jié)果。M:DNA ladder;P:Plasmid;C:Control group;1-5:Soil samples of transgenic lines.a-c:PCR results of 16S rRNA gene;d-f:PCR results of target gene.

2.3 轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)對(duì)土壤微生物的影響

采用平板培養(yǎng)的方式對(duì)土壤微生物進(jìn)行檢測(cè)，以菌落形成數(shù)的對(duì)數(shù)作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，分析轉(zhuǎn)基因南林895楊對(duì)于土壤微生物生長(zhǎng)的影響(圖7)。在3個(gè)不同系列的轉(zhuǎn)基因南林895楊種植區(qū)域內(nèi)，其土壤微生物種類及數(shù)量變化趨勢(shì)呈現(xiàn)一致性，真菌和放線菌菌落形成數(shù)的對(duì)數(shù)值(lgCFU·g-1DW)在1～4.5之間變動(dòng)，總細(xì)菌菌落形成數(shù)的對(duì)數(shù)值(lgCFU·g-1DW)在3 ～7之間變動(dòng)；不同月份間變化明顯，在2017年7月微生物數(shù)量較多，在2017年12月具有明顯的下降，經(jīng)歷大幅波動(dòng)后在2018年4月微生物數(shù)量又恢復(fù)到較多水平。根據(jù)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)對(duì)土壤微生物影響方面，不同株系間差異性不顯著，轉(zhuǎn)基因組與對(duì)照組之間同樣無(wú)顯著性差異，僅不同取樣時(shí)間的樣品間存在顯著性差異；結(jié)合氣溫及降水量結(jié)果(圖3)，可以發(fā)現(xiàn)土壤微生物數(shù)量與氣溫和降水量變化關(guān)系密切，受其變化影響顯著(P<0.05)，而轉(zhuǎn)基因南林895楊對(duì)土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)未產(chǎn)生顯著影響。

圖7 轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)對(duì)土壤微生物的影響Fig.7 Effects of transgenic poplars on soil microorganisms

2.4 轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的化感作用分析

轉(zhuǎn)基因植物的外源基因來(lái)源具有多樣性，編碼蛋白功能各異，因此分析轉(zhuǎn)基因植物的化感作用對(duì)于轉(zhuǎn)基因生物安全性分析必不可少。本研究采用“三明治”方法評(píng)估轉(zhuǎn)基因南林895楊對(duì)于萵苣種子萌發(fā)生長(zhǎng)的影響(Kikuchietal.，2009)。

根據(jù)對(duì)不同培養(yǎng)條件下萵苣種子胚根和下胚軸生長(zhǎng)的測(cè)量結(jié)果(表3)及統(tǒng)計(jì)分析(表4)，可以發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)基因南林895楊與正對(duì)照組(未轉(zhuǎn)基因南林895楊)數(shù)據(jù)間無(wú)顯著性差異，且不同轉(zhuǎn)基因株系間數(shù)據(jù)不存在顯著性差異，不同外源基因轉(zhuǎn)化的葉片處理對(duì)于萵苣種子胚根和下胚軸的生長(zhǎng)并無(wú)顯著影響；有葉片組(轉(zhuǎn)基因南林895楊和正對(duì)照未轉(zhuǎn)基因南林895楊)與無(wú)葉片組(CK-)數(shù)據(jù)間存在顯著性差異(P<0.05)，且轉(zhuǎn)TLP系列南林895楊葉片對(duì)于胚根的萌發(fā)生長(zhǎng)，不同月份樣品處理所得數(shù)據(jù)具有顯著性差異(P<0.05)，在另外2個(gè)轉(zhuǎn)基因系列中數(shù)據(jù)無(wú)顯著性差異，以上結(jié)果表明葉片的添加能夠?qū)θn苣種子的胚根和下胚軸生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著影響，但外源基因?qū)τ谌n苣種子胚根和下胚軸生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。

表3 轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)對(duì)萵苣種子生長(zhǎng)的影響Tab.3 Effect of transgenic poplars on growth of lettuce seed

表 4 轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)對(duì)萵苣種子生長(zhǎng)影響的統(tǒng)計(jì)分析Tab.4 Statistical analysis of the effect of transgenic poplars on lettuce seed growth

3 討論

自Fillatti等(1987)首次報(bào)道轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)以來(lái)，轉(zhuǎn)基因樹(shù)木的環(huán)境釋放在世界范圍內(nèi)引起廣泛的爭(zhēng)議，爭(zhēng)議的焦點(diǎn)在于轉(zhuǎn)基因樹(shù)木的安全性，其中包括：外源基因在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的穩(wěn)定性；基因漂移可使近源物種攜帶優(yōu)勢(shì)基因從而影響遺傳多樣性；外源基因的預(yù)期和非預(yù)期效應(yīng)，其功能表達(dá)對(duì)于轉(zhuǎn)基因樹(shù)木自身生長(zhǎng)的影響及對(duì)非目標(biāo)生物的潛在威脅；對(duì)周圍環(huán)境植物或微生物可能造成不利影響從而破壞環(huán)境生態(tài)；轉(zhuǎn)基因樹(shù)木花粉、花絮及可食部分等對(duì)于動(dòng)物及人生命安全的危害(Gongetal.，2012；Kljujevetal.，2018)。

對(duì)轉(zhuǎn)基因樹(shù)木的安全性進(jìn)行評(píng)估，需要分析外源基因在受體植物中的穩(wěn)定性以及基因插入引起的表型變異。本研究采用載體35S啟動(dòng)子序列作為上游引物，以基因序列作為下游引物，對(duì)進(jìn)入大田階段1年時(shí)間的轉(zhuǎn)基因南林895楊進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明3種目的基因仍穩(wěn)定存在于轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)基因組內(nèi)。而外源基因的隨機(jī)插入，在改變轉(zhuǎn)基因樹(shù)木預(yù)期性狀的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生非預(yù)期效應(yīng)。轉(zhuǎn)CpTI基因的三倍體毛白楊(Populustomentosa)回交雜種的3個(gè)轉(zhuǎn)化株系中，有2個(gè)株系的樹(shù)高及地徑與未轉(zhuǎn)基因植株無(wú)顯著差異，另外1個(gè)株系的樹(shù)高和地徑顯著優(yōu)于未轉(zhuǎn)基因植株(Zhangetal.，2002)；在雜交楊(Populusalba×P.berolinensis)中過(guò)表達(dá)乙烯效應(yīng)因子的編碼基因ERF，在無(wú)脅迫條件下，13個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的樹(shù)高均顯著高于未轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)(Lietal.，2009)；在三倍體毛白楊中轉(zhuǎn)入多拷貝rolB基因，1年后對(duì)其生長(zhǎng)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)樹(shù)高均低于未轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)且各株系間差異顯著，rolB基因轉(zhuǎn)入位置的不同，導(dǎo)致基因表達(dá)量不同，從而造成轉(zhuǎn)基因植株之間的樹(shù)高差異(張曉軍等，2011)。本研究當(dāng)中Bt系列和TLP系列轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的樹(shù)高平均值均低于對(duì)照組，Gols系列的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)樹(shù)高平均值均高于對(duì)照組，盡管存在生長(zhǎng)差異，但方差分析表明轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)樹(shù)高與對(duì)照組之間并無(wú)顯著性差異，3個(gè)外源基因的插入并未對(duì)南林895楊的樹(shù)高產(chǎn)生顯著影響。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的重要支撐力，在土壤物質(zhì)循環(huán)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是土壤生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定的重要表征。轉(zhuǎn)基因樹(shù)木種植大田后，其根系外泌物及外源基因可能會(huì)影響周圍土壤環(huán)境中的微生物群落結(jié)構(gòu)，同時(shí)在微生物降解和吸收有機(jī)物的過(guò)程中進(jìn)入其體內(nèi)(Figueredoetal.，2018)。例如轉(zhuǎn)基因抗病植物可能會(huì)對(duì)非目標(biāo)微生物多樣性及動(dòng)態(tài)性產(chǎn)生影響，同時(shí)抗性基因也可在水平轉(zhuǎn)移上為細(xì)菌和真菌等土壤微生物提供選擇性優(yōu)勢(shì)。本研究以外源基因序列作為引物對(duì)土壤微生物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明外源基因未向環(huán)境微生物中產(chǎn)生轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。盡管不同月份間土壤中真菌、細(xì)菌及放線菌數(shù)量變化明顯，但方差分析表明轉(zhuǎn)基因組與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異，群落結(jié)構(gòu)變化受氣溫和降水影響顯著，轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)未對(duì)土壤微生物群落產(chǎn)生顯著影響。相似的結(jié)果在轉(zhuǎn)基因陸地棉(Gossypiumhirsutum)和玉米(Zeamays)對(duì)土壤微生物影響的研究中有所報(bào)道。轉(zhuǎn)基因棉SGK321與非轉(zhuǎn)基因親本棉或常規(guī)棉根際土壤微生物種群在某些生育期和某些年份存在微小差異,主成分分析表明轉(zhuǎn)基因棉SGK321與非轉(zhuǎn)基因親本棉根際土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量沒(méi)有顯著差異(Zhangetal.，2014)。轉(zhuǎn)cry1Ab和epsps基因的玉米C0030.3.5根際土古細(xì)菌數(shù)量隨生長(zhǎng)期的推進(jìn)呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，但轉(zhuǎn)基因玉米與對(duì)照組間古菌豐度及群落結(jié)構(gòu)均無(wú)顯著差異，古菌數(shù)量變化主要受生長(zhǎng)時(shí)期影響(王晶等，2017)。

本研究所采用的試驗(yàn)材料為南林895楊，均為雌株，不產(chǎn)生花粉，因此不存在花粉飄散形成的基因安全問(wèn)題。但轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)由于外源功能基因的插入，可能會(huì)通過(guò)根系分泌物、葉片及其殘?bào)w等影響環(huán)境中其他植物的生長(zhǎng)(Aslametal.，2017)。本研究采用“三明治”法模擬轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的化感作用，評(píng)估轉(zhuǎn)基因南林895楊對(duì)于萵苣種子生長(zhǎng)的影響，該方法能夠更直觀地反映外源基因在受體植物中表達(dá)所產(chǎn)生的影響(Kikuchietal.，2009)，結(jié)果表明有葉片組與無(wú)葉片組(CK-)數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)，葉片的存在能夠顯著影響萵苣種子的萌發(fā)生長(zhǎng)，但不同外源基因的葉片間對(duì)于萵苣種子胚根和下胚軸的生長(zhǎng)并無(wú)顯著影響，同時(shí)轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異。盡管轉(zhuǎn)TLP系列南林895楊不同月份葉片樣品對(duì)萵苣種子生長(zhǎng)影響的數(shù)據(jù)間具有顯著差異性(P<0.05)，但轉(zhuǎn)化基因并未顯著影響萵苣種子生長(zhǎng)，推測(cè)與采集葉片的生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān)。因此，3種外源基因?qū)τ谌n苣種子胚根和下胚軸生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。

4 結(jié)論

本研究以進(jìn)入田間試驗(yàn)的3類(Bt、TLP和Gols)轉(zhuǎn)基因南林895楊為研究對(duì)象，對(duì)其外源基因的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的生長(zhǎng)、外源基因轉(zhuǎn)移及對(duì)環(huán)境微生物和植物等影響進(jìn)行了初步評(píng)估分析，表明3種外源基因仍然穩(wěn)定存在于轉(zhuǎn)基因南林895楊中，外源基因?qū)D(zhuǎn)基因楊樹(shù)生長(zhǎng)未產(chǎn)生顯著影響，3種外源基因沒(méi)有發(fā)生基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，且未進(jìn)入周圍土壤微生物基因組中，外源基因的表達(dá)對(duì)于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響，轉(zhuǎn)基因南林895楊葉片無(wú)顯著化感作用。綜上所述，本研究中Bt系列、TLP系列和Gols系列3類轉(zhuǎn)基因南林895楊在田間試驗(yàn)中無(wú)明顯的環(huán)境危害。