胡家 霍麗霞 王菲菲 張玲 倪林

[摘要] 目的 觀察利拉魯肽對2型糖尿病腎?。―N）患者腸道菌群的影響。 方法 選取2017年3月～2019年6月在本院就診的DN患者60例為研究對象，隨機(jī)分為兩組，A組使用西格列汀片口服，B組使用利拉魯肽針皮下注射。治療前檢測血清空腹血糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、尿白蛋白/肌酐比值（UACR）、β2-微球蛋白（β2-MG）等。治療后檢測糞便腸道菌群雙歧桿菌、普雷沃菌、乳桿菌和腸桿菌的數(shù)量。采用Pearson相關(guān)性分析分析DN腸道菌群與微量白蛋白尿指標(biāo)的相關(guān)性。 結(jié)果 （1）治療前兩組患者FPG、HbA1c、UACR，β2-MG比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（2）治療6個(gè)月后，B組雙歧桿菌和普雷沃菌的菌落數(shù)顯著高于A組，A組腸桿菌菌落數(shù)高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（3）B組的β2-微球蛋白和尿白蛋白肌酐比值較A組均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（4）雙歧桿菌與β2-MG、UACR呈負(fù)相關(guān)（r=-0.437.-0.612）。普雷沃菌與β2-MG、UACR呈負(fù)相關(guān)（r=-0.488.-0.435）。而腸桿菌與β2-MG、UACR呈正相關(guān)（r=0.650.0.679），以上數(shù)值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 利拉魯肽通過增加糖尿病腎病患者腸道菌群益生菌的數(shù)量，改善微量白蛋白尿，最終起到額外保護(hù)腎臟的作用。

[關(guān)鍵詞] 糖尿病腎病;2型糖尿病;腸道菌群;微量白蛋白尿

[中圖分類號] R581.2;R692? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）27-0049-05

[Abstract] Objective To observe the effect of liraglutide on intestinal microflora in the patients with type 2 diabetic nephropathy（DN）. Methods A total of 60 patients with DN who were treated in our hospital from March 2017 to June 2019 were selected as the study subjects. The patients were randomly divided into two groups. Group A was given sitagliptin tablets for oral administration， and group B was given liraglutide subcutaneous injection. Before treatment， serum fasting blood glucose （FPG）， glycated hemoglobin （HbA1C）， urine albumin/creatinine ratio （UACR）， β2-microglobulin （β2-MG） and other indicators were measured. After treatment， the number of fecal intestinal microflora such as Bifidobacterium， Prevotella， Lactobacillus and Enterobacteriaceae was detected. Pearson correlation analysis was used to analyze the correlation between DN intestinal microflora and microalbuminuria index. Results （1） Before treatment， FPG， HbA1C， UACR， β2-MG and other indicators were compared between the two groups， and the difference was not statistically significant （P>0.05）. （2） After 6 months of treatment， the number of colonies of Bifidobacterium and Prevotella in group B were significantly higher than that in group A， and the number of enterobacteriaceae in group A was higher than that in group B， the differences were statistically significant（P<0.05）. （3）The ratio of β2-microglobulin and urinary albumin creatinine in group B was significantly lower than that in group A， and the difference was statistically significant（P<0.05）. （4）Bifidobacterium was negatively correlated with β2-MG and UACR（r=-0.437， -0.612）. Prevotella was negatively correlated with β2-MG and UACR（r=-0.488， -0.435）. Enterobacteriaceae was positively correlated with β2-MG and UACR（r=0.650， 0.679）. The differences of all the above values were statistically significant（P<0.05）. Conclusion Liraglutide can improve the microalbuminuria by increasing the number of probiotics in the intestinal microflora of patients with diabetic nephropathy， and finally play an additional role in protecting the kidneys.

[Key words] Diabetic nephropathy; Type 2 diabetes; Intestinal microflora; Microalbuminuria

生活方式的變化和人口老齡化加速糖尿病的蔓延。據(jù)統(tǒng)計(jì)全球糖尿病患病率為8.8%，我國成人糖尿病患病率已高達(dá)10.9%[1]。糖尿病的主要危害來自并發(fā)癥，給社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。而糖尿病腎?。―iabetic nephropathy，DN）是嚴(yán)重糖尿病微血管并發(fā)癥之一，以尿蛋白的升高和腎小球?yàn)V過率下降為主要特點(diǎn)。在我國糖尿病患者中有20%～40%進(jìn)展為糖尿病腎病，這將是終末期腎病的主要原因[2-3]。

胰高血糖素樣肽1受體激動(dòng)劑（Glucagon like peptide-1，GLP-1）臨床上廣泛用于治療2型糖尿病，使胃腸道成為治療糖尿病的潛在靶點(diǎn)[4-5]。而胃腸道菌群失調(diào)與2型糖尿病腎病的嚴(yán)重程度加重有關(guān)[6-7]，但是目前胰高血糖素樣肽1受體激動(dòng)劑與腸道菌群之間的相互作用尚處于研究階段。

全球多中心臨床試驗(yàn)LIRA-RENAL研究結(jié)果表明，利拉魯肽除了有效控制血糖，還能減少持續(xù)性大量白蛋白尿，從而延緩腎功能衰竭的發(fā)生[8]，但利拉魯肽改善糖尿病腎病的具體作用機(jī)制目前尚不明確。本課題組從2017～2019年觀察分析皮下注射利拉魯肽對糖尿病腎病患者的腸道菌群和微量白蛋白尿的變化，并分析腸道菌群和微量白蛋白尿，旨在為利拉魯肽是否通過調(diào)節(jié)腸道菌群改善微量白蛋白尿，為深入探討糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年3月～2019年6月在湖州市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的2型糖尿病合并腎并發(fā)癥患者作為研究對象，其中男35例，女25例。2型糖尿病診斷均符合1999年世界衛(wèi)生組織（WHO）診斷標(biāo)準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合1999年WHO的2型糖尿?。═ype 2 Diabetes，T2DM）的臨床診斷[9];微量白蛋白尿：尿白蛋白/肌酐比值（UACR）30～300 mg/g; 腎小球?yàn)V過率eGFR≥60[mL/min，（1.73 m2）-1][1];進(jìn)入研究前6個(gè)月內(nèi)均未使用過抗生素、乳果糖、微生物活菌制劑等，患者均使用口服降糖藥物，未使用胰島素治療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：胃腸道疾病;重度肝腎功能不全;急性感染;甲狀腺疾病;胰腺疾病;1 型糖尿病;繼發(fā)性糖尿病;惡性腫瘤;自身免疫性疾病[7]。

分組方法：將符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為兩組。A組31例給予西格列汀控制血糖（100 mg/d，每天1次，口服，默沙東中國制藥有限公司），B組29例予利拉魯肽針（1.2 mg/d，每天1次，皮下注射，諾和諾德中國制藥有限公司）。

本研究經(jīng)湖州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

兩組DN患者基線資料的比較：A組和B組兩組患者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、FPG、HbA1C、TG、TC、尿白蛋白/肌酐比值（UACR），β2-微球蛋白（β2-MG）、eGFR等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

1.2 方法

將簽署知情同意書并且符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為兩組。A組31例予西格列汀片（100 mg/片，默沙東中國制藥有限公司）口服，劑量為每天1次，1次1片，療程為6個(gè)月。B組29例予利拉魯肽針（18 mg/支，諾和諾德中國制藥有限公司）皮下注射，劑量為每天1次，每次1.2 mg，療程為6個(gè)月。

1.3 觀察指標(biāo)

血清學(xué)指標(biāo)檢測：治療前后分別取兩組患者清晨空腹靜脈血，檢測2型糖尿病腎病相關(guān)指標(biāo)。測定空腹血糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、血清肌酐（Scr）、尿素氮（BNU）、腎小球?yàn)V過率（eGFR）等。血清學(xué)指標(biāo)采用日立全生化分析儀測定。

微量白蛋白尿指標(biāo)檢測：留取晨間尿檢測微量白蛋白尿指標(biāo)：UACR，β2-微球蛋白（β2-MG）。

腸道菌群指標(biāo)檢測：治療前后分別留取糞便標(biāo)本，用無菌匙采集糞便標(biāo)本，放入裝有8 mL糞便DNA穩(wěn)定劑的預(yù)標(biāo)記管中混合。立即在-80℃保存直到提取DNA，使用糞便基因組提取試劑盒。通過16S rRNA基因測序分析糞便樣品普雷沃氏菌、乳桿菌、雙歧桿菌和腸桿菌的菌落數(shù)量。通過對16SrRNA V3-V4 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。通用引物序列為338F5'-ACTCCTACGG-GAGGCAGCA-3'和806R 5'-GGACTACHVGGGT-WTCTAAT-3'[7]。PCR 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min;95℃變性30 s;55℃退火30 s;72℃延伸45 s;25 個(gè)循環(huán);72℃后保溫10 min，于4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。用Bio-rad IQ5 System 軟件進(jìn)行分析，測得糞便樣品中普雷沃氏菌、乳桿菌、雙歧桿菌和腸桿菌的菌落數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。腸道菌群與微量蛋白尿指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系采用Pearson 相關(guān)性分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療后兩組患者糖尿病腎病指標(biāo)比較

治療6個(gè)后，西格列汀組與利拉魯肽組相比，兩組血尿素氮、血肌酐和腎小球?yàn)V過率數(shù)值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。利拉魯肽組的β2-微球蛋白[（156.27±7.31） μg/L vs （238.31±10.27） μg/L]和尿白蛋白肌酐比值[（24.55±1.16） mg/mmol vs （42.40±2.02） mg/mmol]較西格列汀組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.2 治療后兩組患者腸道菌群數(shù)量的比較

利拉魯肽組（B組）雙歧桿菌[（9.20±0.51） logN/g vs （7.33±0.39）logN/g]和普雷沃菌[（8.33±0.15）logN/g vs （6.06±0.24） logN/g]的菌落數(shù)顯著高于西格列汀組，盡管利拉魯肽組乳桿菌水平高于西格列汀組[（6.63±0.18） logN/g vs （5.83±0.23） logN/g]，但兩者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。值得注意的是，西格列汀組腸桿菌落數(shù)高于利拉魯肽組[（8.31±0.27） logN/g vs （6.61±0.30） logN/g]。見表3。

2.3 治療后糖尿病患者腸道菌群與糖尿病腎病指標(biāo)的相關(guān)性分析

本研究分析四種腸道菌群數(shù)量與糖尿病腎病各個(gè)指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，雙歧桿菌與β2-MG、UACR呈負(fù)相關(guān)（r=-0.437.-0.612），雙歧桿菌、普雷沃菌與eGFR呈正相關(guān)（r=0.525.0.594）。普雷沃菌與β2-MG、UACR呈負(fù)相關(guān)（r=-0.488.-0.435）。而腸桿菌與eGFR呈負(fù)相關(guān)（r=-0.434），腸桿菌與β2-MG、UACR呈正相關(guān)（r=0.650，0.679），以上數(shù)值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

近年來研究證實(shí)GLP-1受體激動(dòng)劑如利拉魯肽，具有降低血糖，減輕體重，改善B細(xì)胞功能及低血糖安全性等臨床優(yōu)勢，且可以顯著降低T2DM患者的心血管事件和慢性腎病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

既往糖尿病腎病研究結(jié)果顯示，GLP-1受體激動(dòng)劑可以抑制晚期糖基化終末期產(chǎn)物來保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞及腎功能。近期研究發(fā)現(xiàn)GLP-1受體激動(dòng)劑可以顯著降低尿白蛋白和改善腎臟病理改變，GLP-1的腎保護(hù)作用可能通過GLP-1受體-AMPK-mTOR-自噬-ROS通路來發(fā)揮作用，但是GLP-1受體激動(dòng)劑利拉魯肽是否通過改善糖尿病腎病患者的腸道菌群，從而發(fā)揮腎保護(hù)作用的研究甚少。

人體腸道益生菌有助于維持機(jī)體糖脂代謝平衡，從而維護(hù)人體健康。其機(jī)制在于腸道菌群通過代謝產(chǎn)物、菌體蛋白及其活力影響人體的自身免疫、內(nèi)分泌代謝、腫瘤等多個(gè)方面，與疾病發(fā)生密切相關(guān)[10]。但是飲食結(jié)構(gòu)改變、糖脂代謝失衡、抗生素的應(yīng)用及腸道功能紊亂等諸多因素，均會(huì)影響腸道菌群的分布數(shù)量、代謝活動(dòng)的變化，導(dǎo)致腸道菌群失衡從而引起相關(guān)疾病發(fā)生[11-12]。

糖尿病腎病的相關(guān)研究表明腸道微生物的種類和數(shù)量均發(fā)生不同程度的改變，雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌等益生菌的相對豐度降低，糞腸球菌等致病菌數(shù)量增加，炎癥指標(biāo)也相應(yīng)增加，證實(shí)糖尿病腎病患者腸道菌群比例失調(diào)[13-14]。益生菌的減少和致病菌的增加導(dǎo)致體內(nèi)炎癥狀態(tài)惡化，最終加重了2型糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展[15-16]。

特定飲食和藥物干預(yù)能夠改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)，并達(dá)到治療的效果。研究表明，高脂飲食可顯著降低小鼠腸道菌群的多樣性，進(jìn)食高纖維類食物可以增加腸道菌群的多樣性[17-18]。二甲雙胍處理高脂飲食小鼠，可有效增加腸道中黏蛋白降解細(xì)菌阿爾曼菌、普雷沃菌相對豐度，改善糖耐量異常[19-21]。LEADER臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明利拉魯肽可以保護(hù)2型糖尿病患者的糖尿病腎病。與安慰劑相比，利拉魯肽可以減少持續(xù)性大量白蛋白尿的新發(fā)生率（HR 0.74，95%CI：0.60～0.91，P=0.004）[8]。

本研究應(yīng)用16S rRNA基因測序技術(shù)分析，早期糖尿病腎病患者分別使用利拉魯肽和西格列汀降糖治療后，兩組微量白蛋白尿指標(biāo)和腸道菌群的相關(guān)性。結(jié)果顯示利拉魯肽組β2-微球蛋白和尿白蛋白肌酐比值數(shù)值，較西格列汀組明顯下降（P<0.05）。利拉魯肽組雙歧桿菌和普雷沃菌的數(shù)量較西格列汀組升高，原因在于GLP-1類藥物能夠改善胰島素抵抗，臨床上T2DM患者存在不同程度的胰島素抵抗。盡管利拉魯肽組乳桿菌水平高于西格列汀組，但兩者相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

綜上所述，2型糖尿病DN患者常伴隨腸道菌群失調(diào)，而腸道菌群紊亂又可以加重患者微量白蛋白尿的出現(xiàn)。本研究通過觀察DN患者使用GLP-1受體激動(dòng)劑利拉魯肽和DPPⅣ抑制劑西格列汀半年，從而分析DN患者腸道菌群與微量白蛋白尿的相關(guān)性，希望能夠通過調(diào)控糖尿病腎病患者的腸道菌群，以微生物學(xué)方法改善DN患者血糖和減少微量白蛋白尿，延緩糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展，為深入探討糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2020-02-01）