羅媛 王昌權(quán) 鞏仔鵬 李月婷 王愛民 陳思穎 黃勇 鄭林

摘 要 目的：建立全面、快速分析苗藥云實(shí)皮化學(xué)成分的方法，為該藥質(zhì)量控制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。方法：采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS/MS）。色譜柱為Agilent SB-C18，流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液（梯度洗脫），流速為0.25 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為2 ?L;電噴霧離子源，正、負(fù)離子模式全程掃描，掃描范圍為m/z 50～1 500，毛細(xì)管電壓為4.5 kV，霧化氣（氮?dú)猓毫?.2 Bar，去溶劑氣為氮?dú)?，去溶劑氣流速? L/min，去溶劑氣溫度為200 ℃。使用Data Analysis 4.2軟件分析各成分峰的碎片離子信息，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)和對(duì)照品質(zhì)譜圖指認(rèn)云實(shí)皮的化學(xué)成分。結(jié)果：在正離子模式下，共確定并指認(rèn)9個(gè)化合物，峰1、2、3、4、5、6、7、8、9分別為兒茶素、原蘇木素B、表兒茶素、沒食子酸乙酯、槲皮素、木犀草素、3-去氧蘇木查耳酮、異甘草素、亞油酸;在負(fù)離子模式下，共確定21個(gè)色譜峰，并指認(rèn)了其中13個(gè)，峰3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、21分別為兒茶素、短葉蘇木酚酸、原蘇木素B、表兒茶素、沒食子酸乙酯、表兒茶素沒食子酸酯、槲皮素、白藜蘆醇、蘇木查耳酮、木犀草素、3-去氧蘇木查耳酮、異甘草素、亞油酸。結(jié)論：成功建立了可分析云實(shí)皮化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS法。

關(guān)鍵詞 苗藥;云實(shí)皮;超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù);化學(xué)成分;分析鑒定

中圖分類號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）20-2481-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.20.09

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method that can comprehensively and rapidly analyze the chemical compositions of Miao medicine Caesalpinia decapetala， and to providing reference for quality control and pharmacodynamic material basis study of C. decapetala. METHODS： UPLC-Q-TOF-MS/MS was adopted. The determination was performed on Agilent SB-C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid solution-0.1% formic acid acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 0.25 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and sample size was 2 ?L. ESI source was applied in negative and positive scanning ion mode and data collection range of m/z 50-1 500. The capillary voltage was 4.5 kV， the atomizing gas （nitrogen） pressure was 1.2 Bar， the solvent removal gas was nitrogen， the flow rate of solvent removal gas was 8 L/min and the solvent removal gas temperature was 200 ℃. Data Analysis? 4.2 software was adopted to analyze fragment ion information of each peak， and identify chemical compositions on the basis of relevant literature and mass spectograms of reference substance. RESULTS： Under positive ion mode， 9 chemical compounds were identified; peak 1， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9 were catechin， protohematoxylin B， epicatechin， ethyl gallate， quercetin， luteolin， 3-deoxy-hematoxylin chalcone， isoliquiritigenin and linoleic acid. Under negative ion mode， totally 21 peaks were confirmed and 13 compounds were identified; peak 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11， 12， 13， 15， 21 were catechins， brevifolin carboxylic acid， proto- hematoxylin B， epicatechin， ethyl gallate， epicatechin gallate， quercetin， resveratrol， hematoxylin， luteolin， 3-deoxy-hema- toxylin， isoliquiritigenin， linoleic acid. CONCLUSIONS： UPLC-Q-TOF-MS/MS method is established successfully for analysis of chemical compositions in C. decapetala.

KEYWORDS? ?Miao medicine; Caesalpinia decapetala; UPLC-Q-TOF-MS/MS; Chemical composition; Analysis and identification

云實(shí)皮為豆科植物云實(shí)Caesalpinia decapetala（Roth）Alston的干燥根或根皮，主產(chǎn)于貴州，為苗族常用藥材，苗藥名為“Ghab Jongx Bel Jab Fab”（近似漢譯音為“嘎龔布加非”）。該藥被收載于《中華本草（苗藥卷）》《苗族醫(yī)藥學(xué)》《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中，具有祛風(fēng)除濕，解毒消腫的功效[1-3]。云實(shí)皮可用于治療咳嗽、咽喉腫痛、風(fēng)濕痹痛等癥，且療效顯著[4-6]。該藥含有多種化學(xué)成分，主要是萜類、黃酮類、香豆素類等，具有良好的抗炎、抗瘧疾及抗病毒等活性[7-11]。以云實(shí)皮為主藥的上市貴州民族藥品有云實(shí)感冒合劑、馬蘭感寒膠囊、清痹通絡(luò)藥酒等[3]，均被納入國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)。云實(shí)皮已成為貴州重點(diǎn)培育的民族藥材，其地域優(yōu)勢(shì)強(qiáng)、資源豐富、發(fā)展?jié)摿Υ蟆，F(xiàn)有文獻(xiàn)關(guān)于云實(shí)皮的報(bào)道主要集中在化合物的分離鑒定等方面，尚未見質(zhì)量控制研究的相關(guān)報(bào)道;此外，現(xiàn)行分離鑒定技術(shù)的分析時(shí)間較長(zhǎng)，且準(zhǔn)確度不高，使云實(shí)皮的質(zhì)量控制研究受到了一定的限制。隨著貴州民族藥產(chǎn)業(yè)對(duì)云實(shí)皮需求量的不斷擴(kuò)大，故亟需一種全面、快速鑒定云實(shí)皮主要化學(xué)成分的方法，以促進(jìn)其藥材的進(jìn)一步開發(fā)利用。

近年來，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)常被應(yīng)用于中藥化學(xué)成分的分離鑒定，以其簡(jiǎn)便、快捷的分析手段為中藥及其復(fù)方的成分分析做出了較大貢獻(xiàn)。超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS/MS）將高分離能力的液相色譜與高檢測(cè)能力的質(zhì)譜進(jìn)行有效結(jié)合，可以直接得到成分的保留時(shí)間、精確的相對(duì)分子質(zhì)量及碎片離子信息，并通過分析化合物的裂解途徑來對(duì)未知化合物進(jìn)行快速推測(cè)[12-13]。基于此，本研究采用快速、高效、分辨率及靈敏度高的UPLC-Q-TOF-MS/MS法對(duì)云實(shí)皮的化學(xué)成分進(jìn)行全面、快速分析，以期為該藥質(zhì)量控制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1290型超高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司）;AB Sciex TripleTOF? 4600型高分辨串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（美國(guó)Sciex公司）;Allegra X-30R Centrifuge型離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）;KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;EL204型萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

云實(shí)皮藥材（批號(hào)：20190823）購(gòu)自貴陽市萬東橋中藥材市場(chǎng)，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室龍慶德教授鑒定為豆科植物云實(shí)C. decapetala（Roth）Alston的干燥根或根皮。兒茶素、原蘇木素B、3-去氧蘇木查耳酮、蘇木查耳酮、木犀草素、異甘草素對(duì)照品（成都埃法生物科技有限公司，批號(hào)分別為AF8030805、AF8031312、AF9060406、AF8060823、AF8052202、AF9060222，純度均大于98%）;乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 ?m）;流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～12 min，5%B;12～30 min，5%B→14%B;30～32 min，14%B→20%B;32～55 min，20%B→95%B;55～56 min，95%B→5%B;56～60 min，5%B）;流速：0.25 mL/min;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：2 ?L。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）;正、負(fù)離子模式全程掃描;掃描范圍：m/z 50～1 500;毛細(xì)管電壓：4.5 kV;霧化氣（氮?dú)猓毫Γ?.2 Bar;去溶劑氣：氮?dú)?去溶劑氣流速：8 L/min;去溶劑氣溫度：200 ℃。

2.3 供試品溶液的制備

取云實(shí)皮藥材適量，粉碎后，過40目篩，精密稱取粉末1 g，加入70%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過，以12 000 r/min離心5 min，取上清液，即得。

2.4 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取原蘇木素B、兒茶素、蘇木查耳酮、木犀草素、3-去氧蘇木查耳酮、異甘草素對(duì)照品各適量，分別置于10 mL量瓶中，加入甲醇，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz）溶解，再用甲醇定容至刻度，即得。溶液置于 -20 ℃冰箱中保存，備用。臨用前，用甲醇稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度即可。

2.5 化學(xué)成分分析

2.5.1 正離子模式 取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液（40 mg/mL，以生藥量計(jì)）和“2.4”項(xiàng)下各對(duì)照品溶液（5 μg/mL），按“2.1”“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，得云實(shí)皮樣品在正離子模式下的總離子流圖，詳見圖1。在正離子模式下，云實(shí)皮樣品中共確定色譜峰9個(gè)。使用Data Analysis 4.2軟件分析各成分峰的碎片離子信息，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[14-17]以及對(duì)照品質(zhì)譜圖（圖略）進(jìn)行化學(xué)成分指認(rèn)，初步指認(rèn)峰1、2、3、4、5、6、7、8、9分別為兒茶素、原蘇木素B、表兒茶素、沒食子酸乙酯、槲皮素、木犀草素、3-去氧蘇木查耳酮、異甘草素、亞油酸。

2.5.2 負(fù)離子模式 按“2.5.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析，得云實(shí)皮樣品在負(fù)離子模式下的總離子流圖，詳見圖2。通過正、負(fù)離子模式總離子流圖的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式下的色譜峰信息量較大，且正離子模式下指認(rèn)的成分在負(fù)離子模式指認(rèn)的成分中都有體現(xiàn)。在負(fù)離子模式下，云實(shí)皮樣品中共確認(rèn)色譜峰21個(gè)。通過與對(duì)照品質(zhì)譜圖（見圖3）比對(duì)，指認(rèn)峰3、5、11～13、15分別為兒茶素、原蘇木素B、蘇木查耳酮、木犀草素、3-去氧蘇木查耳酮、異甘草素;使用Data Analysis 4.2軟件分析各成分峰的碎片離子信息，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[14-20]比對(duì)，指認(rèn)峰4、6～10、21分別為短葉蘇木酚酸、表兒茶素、沒食子酸乙酯、表兒茶素沒食子酸酯、槲皮素、白藜蘆醇、亞油酸;而峰1～2、14、16～20雖有碎片離子信息，但暫無法確認(rèn)其具體結(jié)構(gòu)，詳見表1。

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（收稿日期：2020-05-27 修回日期：2020-08-18）

（編輯 鄒麗娟）